本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及TREM-2基因在鑒別豬對藍耳病毒易感性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗稱藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV）引起，于1987年最早出現(xiàn)在美國，隨后在歐洲出現(xiàn)報道。我國于1996年由郭寶清等首次分離到PRRSV，將分離毒株命名為CH-1a，證實了該病在我國存在。早在1992年，世界動物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties，OIE）就將該病列為B類傳染病。目前，PRRS是養(yǎng)豬業(yè)中最重要的傳染病之一，在全球?qū)︷B(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。2005年，PRRS對美國養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟損失高達56,000萬美元，而現(xiàn)在，每年損失估計將高達66,400萬美元。PRRS幾乎分布在所有的養(yǎng)豬國家。豬感染PRRSV后，一般會繼發(fā)細菌如副豬嗜血桿菌、鏈球菌等感染。在臨床上，PRRS與豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）混合感染病例較多。2006年，我國大部分省份及越南爆發(fā)了豬高熱?。≒orcine high fever syndrome，PHFS），給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，此病是由變異的PRRSV引起，命名為高致病型豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV）。HP-PRRSV特征為高熱、高致病性及高死亡率。目前，農(nóng)業(yè)部已將該病列入重大動物疫病強制免疫計劃。

PRRSV的防控是目前我國乃至世界的難題。PRRSV難于防控主要表現(xiàn)在以下幾方面：（1）嗜巨噬細胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細胞（Porcine alveolar macrophages，PAMs），PAMs是免疫細胞，破壞PAMs，從而破壞機體免疫系統(tǒng)，從而引起免疫抑制；（2）抗原變異性，目前PRRSV變異較快，弱毒疫苗的使用是促使病毒變異的一個原因，最近有文獻報道，美國出現(xiàn)了藍耳新毒株NADC30，而我國也分離到類似美國的新毒株，命名為NADC30-like，而另有文獻報道從豬場中分離到與疫苗毒基因組高度同源的PRRSV致病毒株，且毒力增強，分析有可能是疫苗毒反強或重組并散毒；（3）疫苗沒有交叉保護力，目前市場上PRRSV疫苗幾乎無交叉保護力，不同毒株間不交叉保護力；（4）抗體依賴性增強，PRRSV的感染會刺激機體產(chǎn)生抗體，但低效價的抗體不但不能中和病毒，反而對病毒的增殖有促進作用；（5）病毒持續(xù)性感染，PRRSV感染后，能夠長時間在豬體內(nèi)檢測到病毒血癥，PRRSV在體內(nèi)持續(xù)時間長達5個月；（6）混合感染，目前臨床上多見藍耳與其他疾病混合感染，特別是圓環(huán)病毒、副豬嗜血桿菌、豬肺疫等與PRRSV的混合感染，使PRRSV的防控難上加難。

目前研究顯示，PRRSV感染的必需受體為CD163，故若能找到調(diào)控CD163表達的基因即可調(diào)節(jié)PRRSV感染，從而可針對此基因開展新的豬藍耳病防控技術(shù)。并且，若能找到調(diào)控CD163表達的基因，還可以以此基因作為豬對PRRSV抗性或易感性的判定標準，篩選豬對藍耳病病毒的抗性或者易感性，這可能是未來藍耳病防治的重要途徑之一，通過建立豬對PRRSV抗性或易感性的判定標準，為PRRSV抗病育種奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有豬藍耳病防治技術(shù)的缺陷和不足，提供TREM-2基因在鑒別豬對藍耳病毒易感性的應(yīng)用，TREM-2基因通過調(diào)控CD163表達進而調(diào)節(jié)PRRSV復(fù)制，PRRSV感染PAMs細胞后促進TREM-2基因表達。TREM-2基因的表達量與PRRSV的復(fù)制息息相關(guān)，有望成為一種新型的判定豬對PRRSV易感性的標準，對PRRSV抗性豬的篩選和培育具有很好的臨床應(yīng)用價值。

本發(fā)明的目的是提供TREM-2基因在鑒別豬對藍耳病毒易感性中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的是提供一種鑒別評價豬對藍耳病毒易感性的方法。

本發(fā)明的再一目的是提供TREM-2基因在提高豬對藍耳病毒抗性以及在制備提高豬對藍耳病毒抗性的藥物或制劑方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的再一目的是提供TREM-2基因在培育對藍耳病毒具有抗性的豬品種方面的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)。

TREM-2基因在鑒別豬對藍耳病毒（PRRSV）易感性中的應(yīng)用。所述豬TREM-2基因的序列號為NM_001256777.1。

所述藍耳病毒包括經(jīng)典毒株和高致病性毒株。

一種鑒別評價豬對藍耳病毒易感性的方法（也即上述應(yīng)用的方法），是檢測豬體內(nèi)TREM-2基因的表達水平，根據(jù)TREM-2基因的表達水平鑒別豬對藍耳病毒（PRRSV）是具有抗性還是具有易感性。

所述鑒別的標準是：TREM-2表達量低時，豬對藍耳病毒（PRRSV）具有抗性；反之具有易感性。

另外，本發(fā)明對于TREM-2基因表達量的檢測方法不作限制?？梢允潜绢I(lǐng)域內(nèi)任意的基因表達量檢測方法。

作為一種可優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明提供了一種檢測豬TREM-2基因表達量的引物組，所述引物組包括上游引物TREM2-F和下游引物TREM2-R，序列分別如SEQ ID NO.1~2所示。

另外，以下所述的應(yīng)用均應(yīng)在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)：

TREM-2基因在提高豬對藍耳病毒抗性方面的應(yīng)用。

TREM-2基因在制備提高豬對藍耳病毒抗性的藥物或制劑方面的應(yīng)用。

TREM-2基因在篩選和/或培育對藍耳病毒具有抗性的豬品種方面的應(yīng)用。

TREM-2基因表達抑制劑在提高豬對藍耳病毒抗性方面的應(yīng)用。

TREM-2基因表達抑制劑在制備提高豬對藍耳病毒抗性的藥物或制劑方面的應(yīng)用。

本發(fā)明經(jīng)過大量的研究和探索，首次發(fā)現(xiàn)豬體內(nèi)TREM-2可以通過調(diào)控金屬蛋白酶ADAM17活性，進而調(diào)節(jié)CD163表達，最終影響調(diào)節(jié)PRRSV的復(fù)制；PRRSV感染靶細胞后促進TREM-2基因表達，以利于病毒復(fù)制。即TREM-2基因表達量與PRRSV感染息息相關(guān)，當TREM-2表達量低時，豬對PRRSV具有抗性，反之易感。

本發(fā)明還通過體外siRNA干擾和過表達分析了TREM-2基因與PRRSV復(fù)制的關(guān)系。另外還研究了TREM-2基因調(diào)節(jié)PRRSV復(fù)制的分子機制，TREM-2基因通過激活金屬蛋白酶ADAM17，進而切割CD163胞外域，最終抑制PRRSV復(fù)制。

另外，本發(fā)明選用了不同品種豬研究TREM-2基因在鑒別豬對PRRSV易感性中的應(yīng)用。分別選取我國地方品種通城豬、梅山豬及國外品種長白豬、大白豬為例，進行PRRSV攻毒，根據(jù)TCID₅₀及PRRSV N蛋白表達水平確定通城豬、梅山豬及國外品種長白豬、大白豬對PRRSV感染力，根據(jù)TREM-2基因表達水平研究其與4種品種豬對PRRSV感染力關(guān)系。結(jié)果顯示，本發(fā)明說明的利用TREM-2基因鑒別豬對藍耳病毒的抗性或易感性的方法是可靠的、準確的。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明首次研究發(fā)現(xiàn)了豬體內(nèi)TREM-2基因表達量與PRRSV感染息息相關(guān)，TREM-2可以通過調(diào)控金屬蛋白酶ADAM17活性，進而調(diào)節(jié)CD163表達，最終影響PRRSV復(fù)制；PRRSV感染靶細胞后促進TREM-2基因表達。因此TREM-2基因可以作為一種新型的判定PRRSV易感性的標準；當TREM-2表達量低時，豬對PRRSV具有抗性，反之易感。

本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)為鑒別豬對PRRSV易感性以及PRRSV抗病育種奠定基礎(chǔ)，對PRRSV抗性豬的篩選和培育具有很好的臨床應(yīng)用價值，對于豬藍耳病的防控具有重要的意義。同時，本發(fā)明也為TREM-2基因提供了一種新的應(yīng)用。

附圖說明

圖1為LPS刺激PAMs細胞后以及PRRSV感染PAMs細胞后，TREM-2表達量變化。圖中，A和B表示PAMs經(jīng)LPS刺激后，TREM-2基因表達水平顯著下降； C和D表示PAMs經(jīng)LPS刺激后，PRRSV復(fù)制被抑制；E和F表示PRRSV感染PAMs后，TREM-2基因表達量顯著升高。

圖2為LPS刺激PAMs細胞后，金屬蛋白酶ADAM17和CD163表達量變化。（A）LPS刺激PAMs細胞后，ADAM17表達量升高；（B）LPS刺激PAMs細胞后，抑制CD163表達。

圖3為TREM-2基因經(jīng)siRNA干擾后，TREM-2表達量下降，同時PRRSV復(fù)制受到抑制；（A）siRNA干擾后，相對于NC對照組，S1與S2干擾組TREM-2基因mRNA表達量顯著地被抑制；（B）siRNA干擾后，相對于NC對照組，S1與S2干擾組PRRSV N基因mRNA表達量顯著地被抑制。

圖4為LPS刺激細胞后，TREM-2基因調(diào)控PRRSV機制圖。

具體實施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。

本發(fā)明以下實施例的統(tǒng)計學(xué)分析：所有試驗至少3次獨立重復(fù)，結(jié)果采用平均值和標準誤表示，使用單因素方差分析和T檢測分析。所有統(tǒng)計分析均采用以P<0.05作為具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異的檢驗標準，分析軟件為SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。

實施例1 PAMs細胞分離和培養(yǎng)

1、經(jīng)檢測無PRRSV、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、豬瘟病毒（CSFV）等特定病原感染的SPF級6-8周齡的斷奶仔豬綁定后，前腔靜脈放血致死，結(jié)扎氣管，剖開胸部，連同心臟取出完整的肺臟，用無菌PBS液充分漂洗肺表面，清除血塊和污物，清除完畢后摘除心臟。灌入PBS緩沖液，輕輕拍打捏揉肺表面5-10 min，回收支氣管肺泡灌洗液。重復(fù)步驟2至3次，直至共回收約1000 mL灌洗液。將回收得到的肺泡灌洗液用移液器輕輕來回吹打，使細胞團塊分開，4℃，1000 rpm離心灌洗液10 min，棄去上清。RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞，4℃，1000 rpm離心5 min，棄去上清。用含20%的FBS的 RPMI-1640 營養(yǎng)液輕輕吹打重懸細胞，為防止操作污染，加入雙抗，將分離得到的細胞均勻分到培養(yǎng)板中，于37℃、5% CO₂加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2、觀察PAMs細胞形態(tài)、活性，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2 TREM-2基因體外調(diào)節(jié)PRRSV復(fù)制的研究

1、用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)PAMs細胞，加入LPS刺激2 h后，以MOI=0.1接毒PRRSV，在2%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，分別對TREM-2基因和PRRSV N蛋白做qRT-PCR和Western-Blot檢測。結(jié)果如圖1中A、B、C、D所示，LPS刺激PAMs細胞后，TREM-2基因表達量下降，同時PRRSV被抑制。

2、另外，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)PAMs細胞，以MOI=0.1接毒PRRSV，在2%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，分別對TREM-2基因做qRT-PCR和Western-blot檢測。結(jié)果如圖1中E、F所示，PRRSV感染PAMs細胞后，TREM-2表達量顯著升高。

實施例3 TREM-2基因與ADAM17及CD163關(guān)系驗證

1、用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)PAMs細胞，加入LPS刺激2 h后，以MOI=0.1接毒PRRSV，在2%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，分別對CD163及ADAM17基因做qRT-PCR檢測。

2、結(jié)果如圖2所示，LPS刺激PAMs細胞后，金屬蛋白酶ADAM17表達量升高，而CD163表達被抑制。

實施例4 體外TREM-2基因干擾

1、將設(shè)計好的3對TREM-2 siRNA（S1、S2、S3）及1對Negative Control （NC對照）送Thermo Fisher Scientific公司合成，使用Lipofectamine? RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑（Thermo Fisher Scientific），在2個6孔板中用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)PAMs細胞至60-70%密度，分別將siRNA（3對siRNA和1個對照）及Lipofectamine? RNAiMAX用Opti-MEM^?Reduced Serum Medium稀釋，稀釋后按1：1比例混合并室溫培養(yǎng)5 min，然后加入到換有新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液的PAMs細胞上37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，棄上清，PBS洗1遍，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞通過qRT-PCR驗證TREM-2干擾效果。另外一個6孔板培養(yǎng)48 h后，在培養(yǎng)基中加入PRRSV，再培養(yǎng)24 h，收集細胞通過qRT-PCR驗證TREM-2干擾后對PRRSV復(fù)制影響。

2、結(jié)果如圖3所示，TREM-2基因經(jīng)siRNA干擾后，相對于NC對照組，siRNA S1、S2都顯著性地抑制了TREM-2 mRNA表達（圖3 A所示）。同時，TREM-2基因干擾后，PRRSV接毒，相對于NC對照組，S1與S2干擾組PRRSV N基因mRNA表達都顯著地被抑制了（圖3 B所示）。綜上所述，TREM-2基因經(jīng)siRNA干擾后，PRRSV復(fù)制被抑制。

實施例5 體外TREM-2基因過表達

1、構(gòu)建pcDNA3.1-TREM-2過表達載體，在2個6孔板中用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)PAMs細胞至60-70%密度，使用Lipofectamine? 2000 （Thermo Fisher Scientific）分別將pcDNA3.1-TREM-2和pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)入PAMs細胞，在37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，棄上清，PBS洗1遍，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞檢測過表達效果。另外一個6孔板培養(yǎng)48 h后，在培養(yǎng)基中加入PRRSV，再培養(yǎng)24 h，收集細胞檢測TREM-2過表達后對PRRSV復(fù)制影響。

2、根據(jù)結(jié)果可判斷，TREM-2轉(zhuǎn)染PAMs細胞過表達后使TREM-2表達量升高；同時，TREM-2過表達后，使PRRSV 復(fù)制升高。

另外，經(jīng)過大量的研究顯示，LPS刺激細胞后，TREM-2基因調(diào)控PRRSV復(fù)制的機制如圖4所示。

實施例6 TREM-2基因在鑒別豬對PRRSV易感性中的應(yīng)用

1、選取我國地方品種通城豬、梅山豬及國外品種長白豬、大白豬作為實驗對象，驗證本發(fā)明利用TREM-2基因鑒別豬對藍耳病毒易感性的方法。

其中，已知通城豬和梅山豬對藍耳病毒不易感，即具有抗性；而長白豬和大白豬對藍耳病毒更易感。

2、實驗方法

選擇通城豬、梅山豬、長白豬、大白豬各6頭，每3頭1組，即分成2組，其中1組進行PRRSV攻毒，另外1組不做任何處理（對照），分別在攻毒后第7、14、21、28 d采血，對照組同步采血，第28 d處死，采集肺組織。

取一部分血清進行TCID₅₀測定，剩余血清及肺組織提取RNA、反轉(zhuǎn)，對TREM-2基因及PRRSV N蛋白進行qRT-PCR檢測。

根據(jù)TCID₅₀及PRRSV N蛋白表達水平確定通城豬、梅山豬及國外品種長白豬、大白豬對PRRSV感染力，根據(jù)TREM-2基因表達水平研究其與4種品種豬對PRRSV感染力關(guān)系。

3、根據(jù)結(jié)果可判斷，通城豬和梅山豬對藍耳病毒不易感，而長白豬和大白豬對藍耳病毒更易感。

同時，TREM-2基因表達水平檢測結(jié)果顯示，通城豬和梅山豬體內(nèi)TREM-2基因表達水平顯著低于長白豬和大白豬。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大學(xué)

<120> TREM-2基因在鑒別豬對藍耳病毒易感性中的應(yīng)用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctgagtctcc tggttctg 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acacacaaat ctccacttc 19