本發(fā)明涉及分子標(biāo)記
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于檢測“瓊麗”小型西瓜雜交種純度的引物組合及其方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：西瓜(Citrulluslanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai)原產(chǎn)非洲地區(qū)，屬于葫蘆科西瓜屬一年生蔓生草本植物，其果實(shí)味甜多汁，富含多種營養(yǎng)成分，在熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛栽培。我國不僅是西瓜的生產(chǎn)大國，而且是消費(fèi)大國。選育適應(yīng)不同栽培模式和市場需求的西瓜新品種是當(dāng)今西瓜育種的主要目標(biāo)。小型西瓜外形美觀，含糖量高，品質(zhì)優(yōu)良，生長期短，早熟，單瓜重1.0-2.5kg，適宜多樣化栽培，經(jīng)濟(jì)效益遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通西瓜，栽培面積呈現(xiàn)穩(wěn)定增長的趨勢。種子是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)科技進(jìn)步的載體，作為重要的生產(chǎn)資料，其質(zhì)量的好壞直接影響農(nóng)作物的產(chǎn)量。種子純度是影響種子質(zhì)量的主要因素，開展雜交種純度檢測對于保障優(yōu)良品種的增產(chǎn)潛力具有重要意義。田間種植鑒定和同工酶電泳技術(shù)常用于作物雜交種純度檢測。但田間種植純度鑒定周期較長，需要耗費(fèi)大量的人力、物力資源，容易受環(huán)境條件和鑒定者經(jīng)驗(yàn)的影響，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性較差。同工酶鑒定多態(tài)性不夠豐富，并且具有組織和器官特異性。隨著西瓜新品種的不斷增加，傳統(tǒng)鑒定技術(shù)難以快速、準(zhǔn)確檢測親緣關(guān)系較近的雜交種的純度。分子標(biāo)記技術(shù)能夠從基因組水平上揭示不同材料間的遺傳變異，多態(tài)性豐富，不受環(huán)境條件影響，無組織、器官及發(fā)育特異性，能夠在植株生長的任何時(shí)期進(jìn)行檢測，并且鑒定時(shí)間較短。西瓜全基因組測序及部分材料重測序的完成推動(dòng)了分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用，使得從基因組水平上檢測小型西瓜雜交種純度成為可能?！碍傷悺笔侵袊鵁釒мr(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所經(jīng)多年研究選育出的早熟小果型西瓜品種，于2013年通過海南省品種認(rèn)定。該雜交組合全生育期冬播72-78d，夏播60-63d，果實(shí)發(fā)育期為26-28d，第一雌花節(jié)位為5-6節(jié)，雌花間隔節(jié)位4-5節(jié)；果實(shí)短橢圓形，果型指數(shù)為1.27，外觀清秀，深綠果皮覆墨綠細(xì)齒條帶13-15條，瓜瓤橙紅色，色澤均勻，中心可溶性固形物為12.0％-12.5％，最高可達(dá)13％，肉質(zhì)細(xì)膩無纖維，具有特殊清香味，口感極佳。果皮薄，皮厚0.4-0.5cm，種子卵圓形，千粒重40g，植株抗病性強(qiáng)，易座果，適于保護(hù)地栽培，也可露地栽培。SSR(SimpleSequenceRepeats)標(biāo)記，也稱為微衛(wèi)星DNA，是根據(jù)基因組序列中的簡單串聯(lián)重復(fù)序列開發(fā)的一種標(biāo)記類型，依據(jù)重復(fù)單位數(shù)目的不同檢測遺傳多態(tài)性。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、在染色體上均勻分布、擴(kuò)增的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好、不受環(huán)境因素和植株發(fā)育階段的影響等優(yōu)點(diǎn)。InDel(Insertion/Deletion)標(biāo)記，通過比較兩份材料基因組的差異，檢測插入或缺失位點(diǎn)，根據(jù)插入缺失位點(diǎn)兩端的序列設(shè)計(jì)引物檢測遺傳多態(tài)性。近年來，隨著西瓜基因組測序和部分材料重測序研究的開展，豐富的序列資源為西瓜SSR和InDel標(biāo)記的開發(fā)提供了便利條件。目前利用SSR和InDel標(biāo)記基于雙重PCR技術(shù)建立小型西瓜雜交種純度鑒定方法尚未見報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：傳統(tǒng)的作物雜交種純度檢驗(yàn)方法具有鑒定周期較長、鑒定結(jié)果易受環(huán)境條件和鑒定者經(jīng)驗(yàn)的影響，準(zhǔn)確性較差、需要大量的人力，物力資源、成本較高等缺點(diǎn)，在一定程度上限制了良種的及時(shí)銷售。針對以上問題，本發(fā)明的目的是開發(fā)用于“瓊麗”小型西瓜雜交種純度檢測的SSR、InDel分子標(biāo)記，并建立雙重PCR技術(shù)，進(jìn)一步提高檢測效率和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種用于檢測“瓊麗”小型西瓜雜交種純度的引物組合，所述引物組合包括組合SSR16-InDel2和/或組合SSR48-InDel2，其中引物對SSR16的核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，引物對SSR48的核苷酸序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示，引物對InDel2的核苷酸序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示。本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供一種用于檢測“瓊麗”小型西瓜雜交種純度的試劑盒，其包含權(quán)利要求1所述的引物組合。即本發(fā)明的第二個(gè)方面的試劑盒中包含組合SSR16-InDel2和/或組合SSR48-InDel2。本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供如第一個(gè)方面所述的引物對或本發(fā)明第二個(gè)方面所述的試劑盒在檢測“瓊麗”小型西瓜雜交種純度中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供一種檢測“瓊麗”小型西瓜雜交種純度的方法，包括以下步驟：步驟1，取樣品播種，從作物中提取DNA；步驟2，用本發(fā)明第一個(gè)方面所述的引物組合、或者本發(fā)明第二個(gè)方面所述的試劑盒中的引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；步驟3，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并作出判斷。本發(fā)明中，提取待測樣品的基因組DNA的方法不受特別限制，可以采用任何已知的基因組DNA提取方法或試劑盒進(jìn)行。本發(fā)明中，將所述待測樣品的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的條件不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：總反應(yīng)體系為10μL，其中包括小型西瓜(“瓊麗”)單株DNA30ng，引物組合40ng，0.2mMdNTPs，TaqDNA聚合酶0.6U，10×PCRBuffer1μL，最后用無菌超純水補(bǔ)齊至10μL。所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性40s，50℃或56℃退火40s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸6min。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，退火溫度為56℃。本發(fā)明中，對所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測的方法不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，通過凝膠電泳進(jìn)行檢測，根據(jù)多態(tài)性條帶的擴(kuò)增結(jié)果鑒定小型西瓜品種“瓊麗”的純度。由此，能夠高通量、快速、高效、準(zhǔn)確地獲得檢測結(jié)果。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，電泳緩沖液最佳濃度為0.5×TBE。其中，在PCR反應(yīng)體系中，各引物對的濃度足以使1kb的DNA片段在PCR反應(yīng)體系中循環(huán)擴(kuò)增30次即可，一般為0.1～0.5μM之間。因此，在本發(fā)明中，不對引物對SSR16、引物對InDel2和SSR48的比例進(jìn)行限定。但根據(jù)發(fā)明的一些具體示例，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中：如果存在組合SSR16-InDel2，則引物對SSR16和引物對InDel2的濃度比為1-100:1；如果存在組合SSR48-InDel2，則引物對SSR48和引物對InDel2的濃度比為1-100:1。進(jìn)一步優(yōu)選地，如果存在組合SSR16-InDel2，則引物對SSR16和引物對InDel2的濃度比為10:1；如果存在組合SSR48-InDel2，則引物對SSR48和引物對InDel2的濃度比為10:1。本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供一種引物對，所述引物對為SSR16，其核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。本發(fā)明的第六個(gè)方面是提供一種引物對，所述引物對為SSR48，其核苷酸序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。本發(fā)明的第七個(gè)方面是提供一種引物對，所述引物對為InDel2，其核苷酸序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示。作物雜交種田間純度鑒定周期較長，易受多種因素影響，準(zhǔn)確性較差。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，為快速、準(zhǔn)確鑒定小型西瓜雜交種純度提供了技術(shù)支撐。本發(fā)明結(jié)合全基因組比對和比較基因組學(xué)原理開發(fā)了特異性較高的西瓜SSR和InDel分子標(biāo)記，利用在“瓊麗”親本間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR和InDel分子標(biāo)記，結(jié)合雙重PCR技術(shù)，以“瓊麗”單株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)多態(tài)性條帶的擴(kuò)增結(jié)果檢測雜交種的純度。共顯性的SSR標(biāo)記SSR16和SSR48、InDel標(biāo)記InDel2擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶能夠準(zhǔn)確地將雜交種與母本自交種、父本自交種區(qū)分開來，將SSR標(biāo)記(SSR16和SSR48)分別和InDel標(biāo)記(InDel2)進(jìn)行組合，優(yōu)化擴(kuò)增條件和電泳條件，采用雙重PCR技術(shù)檢測小型西瓜品種“瓊麗”雜交種純度，進(jìn)一步提高了檢測效率和檢測的準(zhǔn)確性。附圖說明圖1為SSR、InDel標(biāo)記組合SSR16-InDel2、SSR48-InDel2在親本材料及部分“瓊麗”單株中的擴(kuò)增結(jié)果。其中M代表DL2000DNAMarker，1為“瓊麗”母本材料MN-123，2為“瓊麗”父本材料FR-59-1，3-24為“瓊麗”單株。檢測結(jié)果表明，18號、23號單株為母本自交株。圖2為SSR標(biāo)記SSR16、SSR48，InDel標(biāo)記InDel2在親本材料及部分“瓊麗”單株中的擴(kuò)增結(jié)果。其中M代表DL2000DNAMarker，1為“瓊麗”母本材料MN-123，2為“瓊麗”父本材料FR-59-1，3-11為“瓊麗”單株。具體實(shí)施方式下面參照附圖，結(jié)合具體的實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，以更好地理解本發(fā)明。以下如無特殊說明，本發(fā)明所涉及設(shè)備及耗材均為市售設(shè)備及耗材。本發(fā)明所需主要儀器設(shè)備為：液氮罐，研缽，水浴鍋，旋渦混勻器，高速冷凍離心機(jī)，96孔板離心機(jī)，梯度PCR儀，垂直電泳槽，電泳儀，搖床，觀片燈箱。本發(fā)明所需主要試劑為：CTAB、氯化鈉、EDTA、Tris、鹽酸、氯仿、苯酚、異戊醇、無水乙醇、超純水、dNTP、TaqDNA聚合酶、PCRBuffer、溴酚藍(lán)、去離子甲酰胺、二甲苯青FF、硼酸、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、DL2000DNAMarker、過硫酸銨、TEMED、硝酸銀、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、甲醛。(1)參考西瓜品系97103基因組序列，利用軟件(http://archive.gramene.org/db/markers/ssrtool)通過設(shè)置重復(fù)單位長度參數(shù)搜索西瓜基因組序列中的微衛(wèi)星，根據(jù)微衛(wèi)星兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)引物，結(jié)合全基因組比對分析，開發(fā)特異性較高的SSR分子標(biāo)記。采用SOAPindel(http://soap.genomics.org.cn/)軟件通過比對西瓜品系PI296341-FR和97103基因組序列，并結(jié)合比較基因組學(xué)原理，開發(fā)InDel標(biāo)記。(2)以母本材料MN-123和父本材料FR-59-1基因組DNA為模板，利用開發(fā)的SSR和InDel引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選在“瓊麗”親本間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR和InDel引物。其中2對SSR引物(SSR16和SSR48，見表1)在“瓊麗”親本間能擴(kuò)增出明顯的多態(tài)性(圖2)，分別位于西瓜第2和6號染色體上，帶型為雙親互補(bǔ)帶型。1對InDel引物(InDel2，見表1)在“瓊麗”親本間能擴(kuò)增出明顯的多態(tài)性(圖2)，位于西瓜1號染色體上，帶型為雙親互補(bǔ)帶型。這3對引物可用于“瓊麗”雜交種純度鑒定。表1SSR16、SSR48和InDel2的核苷酸序列引物名稱正向引物(5’-3’)反向引物(5’-3’)SSR16CCTCCTTCTCCATTCTCAACTTTACATGATACTAATTGAGTTGTAAAAGSSR48ATATTCGCAACTCCTAACTTCATATCATTCTAAACAATGTTTTGTCAAGInDel2CAATGGATTCAAGCAACTATCTGAAGGTTCTTCACTCTAGAGATGATCA(3)將小型西瓜品種“瓊麗”母本材料MN-123、父本材料FR-59-1及245粒“瓊麗”的種子播種于育苗盤中，待植株長2～3片真葉時(shí)進(jìn)行取樣，迅速凍于液氮中，采用改良的CTAB法分別提取不同單株的基因組DNA。采用改良的CTAB法提取小型西瓜葉片基因組DNA的具體步驟如下：配制2％CTAB提取液(0.05MEDTApH8.5，0.1MTrispH7.0，0.7MNaCl，2％CTAB)，于121℃高溫滅菌30min，使用前添加2％巰基乙醇，并于65℃水浴鍋中預(yù)熱20min；利用液氮將西瓜葉片研磨成粉末并迅速轉(zhuǎn)入1.5mL離心管，樣品達(dá)到離心管1/3處為宜，每管加入CTAB提取液650μL并于65℃水浴30min(每隔5min搖動(dòng)一次)；水浴結(jié)束后輕輕打開離心管蓋，加入苯酚/氯仿/異戊醇抽提液(苯酚：氯仿：異戊醇＝25:24:1)650μL充分混勻10min，4℃10000rpm離心15min；輕輕吸取上清液并轉(zhuǎn)入新的1.5mL離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇進(jìn)行二次抽提(氯仿：異戊醇＝24:1)充分混勻8min，4℃10000rpm離心10min；輕輕吸取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，輕輕混勻，置4℃冰箱中沉淀10min；利用槍頭將絮狀DNA沉淀挑出并置于1.5mL離心管中，采用75％的乙醇溶液漂洗3遍，自然晾干；加入200μL滅菌的超純水，輕輕搖動(dòng)，將DNA母液貯于-20℃冰箱中備用。將DNA母液稀釋20倍即可用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。(4)以“瓊麗”單株基因組DNA為模板，擴(kuò)增在“瓊麗”親本間表現(xiàn)多態(tài)性的引物。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序?yàn)椋嚎偡磻?yīng)體系為10μL，其中包括“瓊麗”單株DNA30ng，引物組合40ng(組合SSR16-InDel2和組合SSR48-InDel2，引物對SSR16和引物對InDel2的濃度比為10:1；引物對SSR48和引物對InDel2的濃度比為10:1)，0.2mMdNTPs，0.6UTaqDNA聚合酶，10×PCRBuffer1μL，最后用無菌超純水補(bǔ)齊至10μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性40s，56℃退火40s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸6min。PCR產(chǎn)物保存于4℃。(5)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：將2μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2μL上樣緩沖液(98％去離子甲酰胺，0.01MEDTA，0.05％溴酚藍(lán)，0.05％二甲苯青FF)混合，經(jīng)8％非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺＝39∶1)電泳，電泳緩沖液的濃度采用0.5×TBE，200v恒定電壓電泳5h，銀染顯色統(tǒng)計(jì)帶型。(6)根據(jù)多態(tài)性條帶擴(kuò)增結(jié)果鑒定“瓊麗”小型西瓜雜交種純度。“瓊麗”品種純度(％)＝(1-a/A)×100％，其中A為待檢測“瓊麗”植株數(shù)目，a為單獨(dú)具有母本條帶特征或單獨(dú)具有父本條帶特征或擴(kuò)增條帶既不同于父母本條帶特征也不同于“瓊麗”條帶特征的植株數(shù)目。檢測結(jié)果顯示，243個(gè)“瓊麗”單株同時(shí)具有雙親的特異譜帶，屬于真實(shí)的雜交種，18號、23號單株僅具有母本多態(tài)性條帶，不具有父本多態(tài)性條帶(附圖1)，說明18號、23號單株為母本自交株，小型西瓜“瓊麗”雜交種的純度為99.18％。而且單獨(dú)使用引物對SSR16、SSR48和InDel2進(jìn)行擴(kuò)增，也能根據(jù)多態(tài)性條帶擴(kuò)增結(jié)果鑒定“瓊麗”小型西瓜雜交種純度(附圖1和附圖2)。(7)分子鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果比較分析將取材后的母本材料MN-123、父本材料FR-59-1及“瓊麗”單株幼苗按照順序移栽到實(shí)驗(yàn)基地，參照小型西瓜田間栽培技術(shù)進(jìn)行水肥管理及病蟲害防治，在果實(shí)成熟期依據(jù)品種的特征特性逐株進(jìn)行純度鑒定，其中母本MN-123果實(shí)圓形，果肉黃色，中心含糖量12.5％左右，皮厚0.4cm左右，較脆。父本FR-59-1果實(shí)長橢圓形，果肉紅色，中心含糖量為12.0％左右，皮厚0.5cm左右，較韌?！碍傷悺惫麑?shí)短橢圓形，果肉橙紅色，中心含糖量12.0％-12.5％，皮厚0.5cm左右，較韌。18號、23號植株與母本性狀一致，果實(shí)圓形，果肉黃色，其余待檢測“瓊麗”單株果實(shí)短橢圓形，果肉橙紅色，田間種植形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與標(biāo)記SSR16-InDel2、SSR48-InDel2檢測結(jié)果一致，該結(jié)果說明基于SSR、InDel標(biāo)記的雙重PCR技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地鑒定“瓊麗”小型西瓜雜交種純度。以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3