本申請要求2011年3月7日提交的美國臨時(shí)申請No.61/449,769的優(yōu)先權(quán)，該臨時(shí)申請?jiān)诖艘匀脑姆绞郊{入本文。以電子方式與本申請?zhí)峤坏男蛄斜硪浴靶蛄斜怼睘槲募?，?chuàng)建于2012年3月7日，文件大小為620,037字節(jié)，在此以全文援引的方式納入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從表達(dá)細(xì)胞壁降解酶的植物中生產(chǎn)可溶性糖的方法，以及轉(zhuǎn)基因植物、表達(dá)載體，核酸以及細(xì)胞壁降解蛋白。
背景技術(shù)：
：：木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是一種引人注目的用于生產(chǎn)生物燃料、化學(xué)物質(zhì)和生物產(chǎn)品的原料。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)可提供許多優(yōu)勢，包括豐富的可用性、潛在的低成本、可持續(xù)性，以及一般不作為人類的食物來源被消耗(LangeveldJWAetal.2010CropSci50：S131-S151)。為了將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)換成可再生能源和生化藥劑，生物處理將一部分木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)變成單糖，然后轉(zhuǎn)化為生物燃料或其他生物產(chǎn)品。由于生物質(zhì)預(yù)處理和酶水解的成本，通過生物轉(zhuǎn)化來生產(chǎn)糖的成本是昂貴的(AlviraPetal.2010BioresourTechnol101：4851；AbramsonMetal.2010PlantScience178：61；DanielKlein-Marcuschameretal.Biotechnol.Bioeng.2012；109:1083)。酶水解不容易降解植物細(xì)胞壁，因?yàn)榧?xì)胞壁多糖的生物異質(zhì)性、化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特征使它們難以被水解酶水解(ZhuLetal.2008BioresourTechnol99：3817)。出于這個(gè)原因，酶水解需要能夠使植物細(xì)胞壁容易水解的預(yù)處理。在工業(yè)上比較普遍的預(yù)處理技術(shù)，通常使用苛刻的條件，如高溫和極端的pH值條件(WymanCEetal.2005BioresourTechnol96:1959；MosierNetal.2005BioresourTechnol96：673)。這些條件會(huì)引起糖降解并且導(dǎo)致產(chǎn)糖量減少，以及形成有毒的發(fā)酵化合物，需要昂貴的額外步驟以及昂貴的前期資本設(shè)備來進(jìn)行解毒、分離和中和。預(yù)處理成本、外源酶用量的高成本、緩慢的水解速率、酶的有限供應(yīng)也會(huì)影響到涉及木質(zhì)纖維素生物質(zhì)工藝的商業(yè)化。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：一方面，本發(fā)明涉及一種從基因工程植物材料(engineeredplantmaterial)中生產(chǎn)可溶性糖的方法。該方法包括通過將基因工程植物材料與制漿制劑(pulpingformulation)混合形成混合物以進(jìn)行預(yù)處理。所述基因工程植物材料包括編碼第一蛋白的第一多核苷酸序列，所述第一蛋白選自由木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的內(nèi)切葡聚糖酶、內(nèi)含肽修飾的外切葡聚糖酶和內(nèi)含肽修飾的阿魏酸酯酶所組成的組中。所述方法還包括提供水解條件。一方面，本發(fā)明涉及一種基因工程植物。所述基因工程植物包括編碼與第一參考序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列的第一多核苷酸序列，所述第一參考序列選自由SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10和SEQIDNO：11所組成的組中。一方面，本發(fā)明涉及一種表達(dá)盒。所述表達(dá)盒包括能夠在中度嚴(yán)格條件下與含有第一參考序列的核酸雜交的第一多核苷酸序列，所述第一參考序列選自由SEQIDNO：32、SEQIDNO：33、SEQIDNO：34、SEQIDNO：35、SEQIDNO：36、SEQIDNO：37、SEQIDNO：38和SEQIDNO：39[P77853:S158-30-108-35]所組成的組中。所述表達(dá)盒還包括能夠在中度嚴(yán)格條件下與含有第二參考序列的核酸雜交的第二多核苷酸序列，所述第二參考序列選自由SEQIDNO：32、SEQIDNO：33、SEQIDNO：34、SEQIDNO：35、SEQIDNO：36、SEQIDNO：37、SEQIDNO：38、SEQIDNO：39、SEQIDNO：40、SEQIDNO：41、SEQIDNO：42和SEQID：43所組成的組中。被選定為第一參考序列的SEQIDNO不同于被選定為第二參考序列的SEQIDNO。一方面，本發(fā)明涉及一種表達(dá)盒。所述表達(dá)盒包括能夠在中度嚴(yán)格條件下與含有參考序列的核酸雜交的多核苷酸序列，所述參考序列選自由含有SEQIDNO：52、SEQIDNO：53、SEQIDNO：54、SEQIDNO：55、SEQIDNO：56、SEQIDNO：57、SEQIDNO：58、SEQIDNO：59、SEQIDNO：60、SEQIDNO：61和SEQIDNO：62的序列所組成的組中。一方面，本發(fā)明涉及一種用于在工程植物中表達(dá)多種蛋白的表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括：第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列編碼第一蛋白并能夠在中度嚴(yán)格條件下與由第一參考序列組成的的核酸的互補(bǔ)物雜交，所述第一參考序列選自由SEQIDNO：32、SEQIDNO：33、SEQIDNO：34、SEQIDNO：35、SEQIDNO：36、SEQIDNO：37、SEQIDNO：38、SEQIDNO：39、SEQIDNO：40、SEQIDNO：41、SEQIDNO：42和SEQIDNO：43所組成的組中；第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列編碼第二蛋白且能夠在中度嚴(yán)格條件下與由第二參考序列組成的核酸的互補(bǔ)物雜交，所述第二參考序列選自由SEQIDNO：32、SEQIDNO：33、SEQIDNO：34、SEQIDNO：35、SEQIDNO：36、SEQIDNO：37、SEQIDNO：38、SEQIDNO：39、SEQIDNO：40、SEQIDNO：41、SEQIDNO：42和SEQID：43所組成的組中，其中，被選定為第一參考序列的SEQIDNO不同于被選定為第二參考序列的SEQIDNO，并且所述第一蛋白和第二蛋白中的均能夠水解植物材料的組分。一方面，本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體。所述表達(dá)載體包括能夠在中度嚴(yán)格條件下與含有選自由SEQIDNO：68、SEQIDNO：69、SEQIDNO：70、SEQIDNO：71、SEQIDNO：72、SEQIDNO：73、SEQIDNO：74、SEQIDNO：75、SEQIDNO：76、SEQIDNO：77、SEQIDNO：78、SEQIDNO：79、SEQIDNO：80、SEQIDNO：81、SEQIDNO：82和SEQIDNO：83所組成的組中的序列的核酸雜交的多核苷酸序列。一方面，本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列能夠在中度嚴(yán)格條件下與由選自由SEQIDNO：68、SEQIDNO：69、SEQIDNO：70、SEQIDNO：71、SEQIDNO：72、SEQIDNO：73、SEQIDNO：74、SEQIDNO：75、SEQIDNO：76、SEQIDNO：77、SEQIDNO：78、SEQIDNO：79、SEQIDNO：80、SEQIDNO：81、SEQIDNO：82和SEQIDNO：83所組成的組中的序列組成的核酸的互補(bǔ)物雜交。一方面，本發(fā)明還提供了一種制備工程植物的方法，該方法包括：提供如上所述的表達(dá)盒，以及使用整合有所述表達(dá)盒的載體轉(zhuǎn)化植物。一方面，本發(fā)明還提供了一種制備工程植物的方法，該方法包括：使用如上所述的載體轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明還提供了一種使用如上所述的表達(dá)盒生產(chǎn)可溶性糖的方法，該方法包括：收獲通過如上所述的方法制備的工程植物；預(yù)處理所述工程植物，其中，所述預(yù)處理步驟包括：將工程植物與制漿制劑混合形成pH值在5.0-9.0的混合物，所述制漿制劑含有亞硫酸氫銨和碳酸銨，并且提供55-95℃的混物物溫度；以及提供給所述混合物水解條件。一方面，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)可溶性糖的方法，該方法包括：收獲通過如上所述的方法制備的工程植物；預(yù)處理所述工程植物，其中，所述預(yù)處理步驟包括：將工程植物與制漿制劑混合形成pH值在5.0-9.0的混合物，所述制漿制劑含有亞硫酸氫銨和碳酸銨，并且提供55-95℃的混物物溫度；以及提供給所述混合物水解條件。附圖說明結(jié)合附圖閱讀將會(huì)更好地理解以下對本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)說明。出于圖解本發(fā)明的目的，圖中顯示的是目前優(yōu)選的實(shí)施方式。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明并不局限于顯示出的具體設(shè)置和方法。在附圖中：圖1是顯示表達(dá)細(xì)胞壁降解酶的植物生物質(zhì)的聯(lián)合預(yù)處理和水解步驟的流程圖。圖2A-2B顯示了使用#5復(fù)合酶(enzymecocktail)(FCt；灰色(每3個(gè)一組的柱形圖的中間))或缺乏木聚糖酶A的#5復(fù)合酶(Ct-Xyn；斜條紋(右))或者不經(jīng)酶(NCt；白色(左))水解后，來自預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因植物(transgenicplant)(XynA.2015.05)和缺乏木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?XynB.2063.17)的葡萄糖(圖2A)和木糖(圖2B)的產(chǎn)量。圖3A-3B顯示使用#1復(fù)合酶(FCt；灰色(每3個(gè)一組的柱形圖的中間))或缺乏木聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-Xyn；斜條紋(右))，或者不經(jīng)酶(NCt；白色(左))水解后，來自預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶B(XynB.2063.17)的轉(zhuǎn)基因植物和預(yù)處理的野生型對照植物(AxB)的葡萄糖(圖3A)和木糖(圖3B)的產(chǎn)量。圖4顯示了對預(yù)處理的表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶(EG)的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行#1復(fù)合酶(FCt；灰色(中間))或缺乏內(nèi)切葡聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-EG(右))，或者不經(jīng)酶(NCt；白(左))水解后的葡萄糖產(chǎn)量。圖4A顯示了從表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因植物(EGA.2049.02和EGA.2049.10)和缺乏內(nèi)切葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?TGC.4000.12)中產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量。圖4B顯示了從表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶B的轉(zhuǎn)基因植物(EGB2042.03)和缺乏內(nèi)切葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?TGC.2004.8.02)中產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量。圖5A-5D顯示了表達(dá)多種蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的水解結(jié)果。圖5A和圖5C表示使用#1復(fù)合酶處理的從測試轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参镏挟a(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量，圖5B和圖5D表示使用#1復(fù)合酶處理的從測試轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参镏挟a(chǎn)出的木糖產(chǎn)量。圖5A和圖5B顯示的結(jié)果：經(jīng)過全復(fù)合酶處理(FCt；深灰色(中間))、缺乏木聚糖酶的全復(fù)合酶處理(FCt-Xyn；條紋柱(右)以及不經(jīng)酶(NCt；白色柱(左))的處理的1)雙重疊表達(dá)木聚糖酶A(XynA)和輔酶(Acc)的轉(zhuǎn)基因植物XynA/AccA/B.2096.05和XynA/AccA/B.2096.01；2)轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.2004.8.02。圖5C和圖5D顯示的結(jié)果：經(jīng)過全復(fù)合酶處理(FCt；深灰色(每組樣品中四個(gè)的最左邊))、缺乏木聚糖酶的全復(fù)合酶處理(Ct-Xyn；斜條紋(左二))，缺乏內(nèi)切葡聚糖酶的全復(fù)合酶處理(Ct-EG；白色(左三))，以及缺乏木聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶的全復(fù)合酶處理(Ct-Xyn-EG；網(wǎng)格線(左四))的1)表達(dá)XynA和EGA的轉(zhuǎn)基因植物EGA/XynA.2242.09；2)轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.4000.12。圖6A-6B分別顯示從預(yù)處理的野生型對照植物AxB和表達(dá)三重疊加(triplestacked)蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynB/EGA/CBHB.2349.56，XynB/EGA/CBHB.2349.55和XynB/EGA/CBHA.2345.116的秸稈中產(chǎn)出的葡萄糖和木糖的產(chǎn)量。產(chǎn)量的衡量是根據(jù)使用1500/XY復(fù)合酶(FCt；黑色柱(右))進(jìn)行酶水解，并與缺乏復(fù)合酶的對照處理(NCt；灰色(左))對比進(jìn)行的。圖7A-7B分別顯示的是轉(zhuǎn)基因植物的葡萄糖和木糖的產(chǎn)量。圖7A顯示的是經(jīng)過#1復(fù)合酶(FCt；灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-Xyn；斜條紋(右))和缺乏復(fù)合酶的對照處理(NCt；白色(左))的酶水解后，從預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因柳枝稷(XynA.pv2015.3c、XynA.pv2015.4c)和預(yù)處理的野生型柳枝稷(Alamo白楊)中產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量。圖7B顯示了經(jīng)過#1復(fù)合酶(FCt；灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-Xyn；斜條紋(右))和缺乏復(fù)合酶的對照處理(NCt；白色(左))的酶水解后，從預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶A的第一代轉(zhuǎn)基因植物(XynA.2015.05.T0)，表達(dá)木聚糖酶A的第二代轉(zhuǎn)基因植物(XynA.2015.05.T1)以及預(yù)處理的缺乏木聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物(TGC.4000.11)中產(chǎn)出的木糖產(chǎn)量的結(jié)果。圖8A-8B分別顯示了經(jīng)過#1復(fù)合酶(FCt；灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-Xyn；斜條紋(右))和缺乏復(fù)合酶的對照處理(NCt；白色(左))的酶水解后，從兩種預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因柳枝稷植物(XynA.pv2015.3c和XynA.pv2015.4c)和對照非轉(zhuǎn)基因柳枝稷植物(Alamo)中產(chǎn)出的葡萄糖和木糖產(chǎn)量。圖9A-9B分別顯示了經(jīng)過#1復(fù)合酶(FCt；灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-Xyn；斜條紋(右))和缺乏復(fù)合酶的對照處理(NCt；白色(左))的酶水解后，從預(yù)處理的表達(dá)經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶A(iXynA)的轉(zhuǎn)基因植物(iXynA.2229.110)和預(yù)處理的野生型對照植物(AxB)中產(chǎn)出的葡萄糖和木糖產(chǎn)量。圖10闡明了使用#1復(fù)合酶對預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因植物(XynA.2015.5T1；實(shí)心三角)和預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶B的轉(zhuǎn)基因植物(XynB.2063.17；實(shí)心圓圈)與對比的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?TGC.2004.8.02；空心方框)進(jìn)行酶水解產(chǎn)生葡萄糖產(chǎn)量的時(shí)間進(jìn)程。圖11闡明了使用#1復(fù)合酶(EGA.2049.10.FCt、實(shí)心方框；TGC.4000.11.FCt、空心菱形)和缺乏內(nèi)切葡聚糖酶的#1復(fù)合酶(EGA.2049.10.Ct-EG、實(shí)心三角；TGC.4000.11.Ct-EG、空心圓圈)對預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因植物(EGA.2049.10)和預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因?qū)φ?TGC.4000.11)進(jìn)行酶水解產(chǎn)出葡萄糖產(chǎn)量的時(shí)間進(jìn)程。圖12A-12B闡明了經(jīng)過全復(fù)合酶(EGA/XynA.2242.09.FCt，實(shí)心方塊；TGC.4000.11.FCt、空心菱形)處理，與使用缺乏內(nèi)切葡萄糖酶的全復(fù)合酶(圖12A中EGA/XynA.2242.09.Ct-EG、實(shí)心圓圈；TGC.4000.11；Ct-EG，空心圓圈)和使用缺乏木聚糖酶的全復(fù)合酶(EGA/XynA.2242.09.Ct-Xyn、實(shí)心圓圈；TGC.4000.11；Ct-Xyn，空心圓圈)處理相比，預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因植物(EGA/XynA.2242.09)和預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?TGC.4000.11)的酶水解產(chǎn)出葡萄糖產(chǎn)量的時(shí)間進(jìn)程。圖13A-13B闡明了經(jīng)過全復(fù)合酶(XynA/AccB.2092.103.FCt，實(shí)心方塊；TGC.4000.11.FCt，空心菱形)與缺乏木聚糖酶的全復(fù)合酶(XynA/AccB.2092.103.Ct-Xyn、實(shí)心三角；TGC.4000.11.Ct-Xyn、空心圓圈)進(jìn)行酶水解后，分別來自預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶A和阿魏酸酯酶B的轉(zhuǎn)基因植物(XynA/AccB.2092.103)和預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?TGC.4000.11)的葡萄糖和木糖產(chǎn)量的時(shí)間進(jìn)程。圖14闡明了對預(yù)處理的以下表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行酶水解，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?AxB)和缺乏酶的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?TGC.4000.11)對比得到葡萄糖的產(chǎn)量，所述表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)基因植物包括：表達(dá)木聚糖酶B的轉(zhuǎn)基因植物(XynB.2063.17)，表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物(EGA.2049.10)，表達(dá)木聚糖酶A和阿魏酸酯酶B的轉(zhuǎn)基因植物(XynA/Acc.B.2092.103)，表達(dá)木聚糖酶A和內(nèi)切葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物(EGA/XynA.2242.09)，表達(dá)經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因植物(iXynA.2229.110)。進(jìn)行預(yù)處理的溫度為65℃(PT_65)和75℃(PT_75)。酶用量包括每克生物質(zhì)0.2毫升1500或0.1毫升XY以及0.05μM的β-葡糖苷酶(BGL)。每個(gè)PT_65和PT_75預(yù)處理的上面的條形設(shè)定為目前轉(zhuǎn)基因和對照植物的數(shù)據(jù)，從左到右依次是AxB；TGC.4000.11；XynA.2015.05T1；XynB.2063.17；XynA/AccB.2092.103；iXynA.2229.110；EGA.2049.10；和XynA/EGA.2242.09。圖15顯示了使用#5復(fù)合酶對預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因柳枝稷(EGC.2253.4b，實(shí)心圓圈)和野生型柳枝稷(Alamo、空心方框)進(jìn)行酶水解產(chǎn)出的葡萄糖的產(chǎn)量。預(yù)處理溫度為：65℃、75℃和95℃。圖16A-16B顯示了預(yù)處理溫度和時(shí)間對從酶水解的預(yù)處理的表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因植物(EGA/XynA.2342.105；黑條(右))和預(yù)處理的對照植物(TGC.2342.01；灰條(左))中產(chǎn)出的葡萄糖(圖16)和木糖(圖16B)產(chǎn)量的影響。圖17A-17B顯示了預(yù)處理溫度對從預(yù)處理的表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶A和木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因植物EGA/XynA.2242.09.01和EGA/XynA.2242.09.07，以及對照植物：野生型AxB和轉(zhuǎn)基因TGC.4000.11中產(chǎn)出的葡萄糖(圖17A)和木糖(圖17B)產(chǎn)量的影響。圖18顯示了使用減少的酶用量：#1全復(fù)合酶(FCt)，75％的#1全復(fù)合酶(0.75FCt)，50％的#1全復(fù)合酶(0.50FCt)，25％的#1全復(fù)合酶(0.25FCt)，10％的#1全復(fù)合酶(0.10FCt)和無酶(0FCt)進(jìn)行水解后，減少外源酶用量對從預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因植物XynA.2015.05T1(實(shí)心圓圈)，XynB.2063.17(實(shí)心三角)和對照植物TGC.2004.8.04(實(shí)心方塊)中產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量的影響。圖19顯示了減少外源酶用量對從轉(zhuǎn)基因植物XynE/EGC/CBHA.2339.03，XynE/EGC/CBHA.2339.04，XynE/EGC/CBHA.2339.05和對照植物BxA中產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量的影響。預(yù)處理使用0.17M亞硫酸氫銨和碳酸銨(pH8.1)，在75℃、液固比為10條件下進(jìn)行16小時(shí)。在大約2％固含量，沒有酶(NCt；白色(左))，20％全復(fù)合酶(0.2FCt；灰色(中間))和全復(fù)合酶，加入量為0.2毫升/0.1毫升的每克秸稈(0.2ml/0.1mlofpergramstover)，50℃和pH值5.0的條件下進(jìn)行為期三天的酶水解。圖20A-20B分別顯示了經(jīng)過全用量的復(fù)合酶1500/XY(FCt；黑色(右))、20％用量的復(fù)合酶(0.2FCt；灰色(圖20A中和圖20B右))以及無酶(NCt；白色(圖20A左))的酶水解后，預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶A和內(nèi)切葡聚糖酶的植物(XynA/EGA.2309.54和XynA/EGA2309.107)與預(yù)處理的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参飳Ρ鹊钠咸烟呛湍咎堑漠a(chǎn)量。圖21A-21B顯示了經(jīng)過每克秸稈加入0.2毫升1500和0.1毫升XY的全復(fù)合酶(FCt)，80％的全復(fù)合酶；每克秸稈加入0.16毫升1500和0.08毫升XY(0.8FCt)，60％的全復(fù)合酶；每克秸稈加入0.12毫升1500和0.06毫升XY(0.6FCt)，40％的全復(fù)合酶；加入每克秸稈0.08毫升1500和0.04毫升XY(0.4FCt)，20％的全復(fù)合酶；每克秸稈加入0.04毫升1500和0.02毫升XY(0.2FCt)以及無酶(0FCt)的情況下進(jìn)行酶水解后，減少的外源酶用量對從轉(zhuǎn)基因植物EGA/XynA.2242.09.16，CBHA.2069.01.03和對照植物TGC.4000.11中產(chǎn)出的葡萄糖(圖21A)和木糖(圖21B)產(chǎn)量的影響。圖22顯示了使用1)復(fù)合酶1500和XY；和2)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)D5A預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因植物EGA.2049.10和EGA/XynA.2242.09以及對比的對照植物的同步糖化和發(fā)酵(SSF)得到的乙醇產(chǎn)量。圖23顯示了基于表達(dá)外切葡聚糖酶CBHA的轉(zhuǎn)基因植物(CBHA.2069.3.17；白色)和野生型對照植物(AxB；灰色)的重量損失的生物質(zhì)增溶。圖24A-24B顯示了從非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?AxB；圖24A)和表達(dá)外切葡聚糖酶CBHA的轉(zhuǎn)基因植物(CBHA.2063.3.17；圖24B)中產(chǎn)出乙酸(HAc)的產(chǎn)量。處理在75℃下進(jìn)行16小時(shí)(白色(左))、85℃下進(jìn)行7小時(shí)(條紋(中間))和95℃下進(jìn)行(網(wǎng)格(右))圖25A-25B顯示了從非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?AxB；圖25A)和表達(dá)外切葡聚糖酶CBHA的轉(zhuǎn)基因植物(CBHA.2063.3.17)產(chǎn)出糖降解產(chǎn)物羥甲基糠醛(HMF)和糠醛的產(chǎn)量。處理方式用白色、條紋或網(wǎng)格表示，從左至右依次是：白色，HMF_75℃處理16小時(shí)；條紋，HMF_85℃處理7小時(shí)；網(wǎng)格，HMF_95℃處理16小時(shí)；條紋，糠醛_95℃處理16小時(shí))。圖26顯示了經(jīng)過0.17M亞硫酸氫銨和碳酸銨(BSC；pH8.1)預(yù)處理并自動(dòng)水解后，從僅表達(dá)木聚糖酶B的轉(zhuǎn)基因植物(XynB.2063.15)、表達(dá)木聚糖酶A和兩種輔助酶A和B的轉(zhuǎn)基因植物(XynA/AccA/B.2096.1)和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?WTAxB)中產(chǎn)出的木糖產(chǎn)量。將木糖作為單糖(黑色(右))和將木糖作為寡糖(灰色(左))來評(píng)估木糖的產(chǎn)量。圖27顯示了經(jīng)過0.17M亞硫酸氫銨和0.165M碳酸銨(BSC；pH8.1)預(yù)處理并自動(dòng)水解后，從兩種表達(dá)木聚糖酶B、內(nèi)切葡聚糖酶和CBHB(XynB/EGA/CBHB.2349.56和XynB/EGA/CBHB.2349.55)的轉(zhuǎn)基因植物，表達(dá)木聚糖酶B、內(nèi)切葡聚糖酶和CBHA(XynB/EGA/CBHA.2345.116)的轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?AxB)產(chǎn)出的木糖產(chǎn)量。圖28A-28B分別顯示從使用XY預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因植物(同時(shí)表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶A的EGA/XynA.2242.09T1(實(shí)心圓圈)，以及轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.4000(實(shí)心方塊))中產(chǎn)出的葡萄糖和木糖產(chǎn)量。圖28C-28D分別表示從都同時(shí)表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶A、木聚糖酶B和外切纖維素酶B(cellobihydrolaseB)的XynB/EGA/CBHB.2349.55(空心圓圈)，XynB/EGA/CBHB.2349.229(實(shí)心正三角)和XynB/EGA/CBHB.2349.56(實(shí)心倒三角)，以及表達(dá)經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶A的iXynA.2329.14和野生型對照植物AxB中產(chǎn)出的葡萄糖和木糖的產(chǎn)量。具體實(shí)施方式在以下的說明中某些術(shù)語的使用只是為了方便而不是限制。單詞“右”、“左”、“頂”和“底”在所提及的附圖中用于指代方向。用于權(quán)利要求書和說明書相應(yīng)部分中的單詞“一個(gè)”和“一種”，除特別聲明外，定義為包括一個(gè)或多個(gè)引用項(xiàng)。這個(gè)術(shù)語包括以上特別提到的單詞，及其衍生詞，以及相似的單詞。短語“至少一個(gè)”意思為兩個(gè)或兩個(gè)以上的項(xiàng)目的列表，如“A，B或C”，意思是A、B或C的任何一個(gè)及它們的任何組合。本文的實(shí)施方式提供了在植物中表達(dá)一系列的細(xì)胞壁降解(CWD)蛋白的技術(shù)。CWD蛋白可以是CWD酶或CWD酶的修飾形式。修飾形式可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。植物可以是玉米、高粱、柳枝稷或其他植物。本文的實(shí)施方式提供了獲得含有植物CWD蛋白的生物質(zhì)，以在糖生產(chǎn)中用作原料。植物酶表達(dá)使用植物作為一個(gè)“工廠”，而不是微生物發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)CWD酶。這種方法的優(yōu)勢在于將生物質(zhì)原料中的蛋白直接用于可發(fā)酵糖生產(chǎn)中。有水解特性的轉(zhuǎn)基因植物生物質(zhì)可以不需要嚴(yán)格的預(yù)處理來提高細(xì)胞壁纖維素與外源酶的可結(jié)合性。在單株植物中，不同類型CWD蛋白的表達(dá)可以為生物燃料和生物化學(xué)生產(chǎn)創(chuàng)建一個(gè)低成本的糖平臺(tái)。本文的實(shí)施方式提供了對來自包括一種或多種類型CWD蛋白的基因工程植物的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)進(jìn)行溫和的化學(xué)預(yù)處理來生產(chǎn)可溶性糖的方法。一種實(shí)施方式提供了一種從基因工程植物材料中生產(chǎn)可溶性糖的方法。所述方法可以包括通過與制漿制劑混合形成混合物以預(yù)處理基因工程植物原料?；蚬こ讨参锊牧峡梢园ň幋a第一蛋白的第一多核苷酸序列。第一蛋白可以是CWD酶。第一蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD酶。第一蛋白可以是木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶，阿魏酸酯酶，經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的內(nèi)切葡聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的外切葡聚糖酶或經(jīng)內(nèi)含肽修飾的阿魏酸酯酶。第一蛋白可以能夠水解基因工程植物材料的組分。能夠水解某組分意味著在水解條件下第一蛋白催化該組分的水解。對于經(jīng)內(nèi)含肽修飾的第一蛋白而言，能夠水解某組分意味著該內(nèi)含肽從肽上剪接(spliced)后，該蛋白能夠在水解條件下水解該組分。所述方法還可以包括提供水解條件。水解條件可以適于水解該組分。基因工程植物材料還可以包括編碼第二蛋白的第二多核苷酸序列。第二蛋白可以是CWD蛋白。第二蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。第二蛋白可以是木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的內(nèi)切葡聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的外切葡聚糖酶或經(jīng)內(nèi)含肽修飾的阿魏酸酯酶。被選定為第二蛋白的蛋白可以不同于被選定為第一蛋白的蛋白。第二蛋白能夠水解基因工程植物原料的組分。能夠水解某組分意味著第二蛋白在水解條件下催化這種組分水解。對于經(jīng)內(nèi)含肽修飾的第二蛋白而言，能夠水解某組分意味著該內(nèi)含肽從肽上剪接后，該蛋白可以在水解條件下水解該組分。基因工程植物材料還可以包括編碼第三蛋白的第三多核苷酸序列。第三蛋白可以是CWD蛋白。第三蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。第三蛋白可以是木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的內(nèi)切葡聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的外切葡聚糖酶或經(jīng)內(nèi)含肽修飾的阿魏酸酯酶。被選定為第三蛋白的蛋白可以不同于被選定為第一蛋白的蛋白。被選定為第三蛋白的蛋白可以不同于被選定為第二蛋白的蛋白。第三蛋白可以能夠水解基因工程植物原料的組分。能夠水解某組分意味著第三蛋白在水解條件下催化這種組分水解。對于經(jīng)內(nèi)含肽修飾的第三蛋白而言，能夠水解某組分意味著該內(nèi)含肽從肽上剪接后，該蛋白能夠在水解條件下水解該組分?；蚬こ讨参锊牧鲜侵皋D(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物的子代，轉(zhuǎn)基因植物的后代，或上述任何一種植物的部分。轉(zhuǎn)基因植物材料可以含有不存在于天然植物中的細(xì)胞壁降解酶或其編碼基因。基因工程植物材料可以是表達(dá)CWD蛋白的轉(zhuǎn)基因植物，或轉(zhuǎn)基因植物的任何部分?；蚬こ讨参锊牧峡梢允潜磉_(dá)修飾形式的CWD蛋白的任何轉(zhuǎn)基因植物，或轉(zhuǎn)基因植物的任何部分。轉(zhuǎn)基因植物可以是任何形式的植物。植物的轉(zhuǎn)基因植物類型可以是但不限于玉米、甜菜、甘蔗、高粱、柳枝稷、芒草、桉樹、柳樹或楊樹?；蚬こ讨参锊牧峡梢允钦麄€(gè)轉(zhuǎn)基因植物或該植物的部分。所述部分可以是但不限于葉、莖、花、芽、花瓣、子房、果實(shí)或種子?；蚬こ讨参锊牧峡梢允莵碜赞D(zhuǎn)基因植物的愈傷組織?；蚬こ讨参锊牧峡梢杂梢环N或多種轉(zhuǎn)基因植物的部分再生?；蚬こ讨参锊牧峡梢允堑谝晦D(zhuǎn)基因植物和第二轉(zhuǎn)基因植物或非轉(zhuǎn)基因植物有性雜交的產(chǎn)品，其中，產(chǎn)品植物保留引種到第一轉(zhuǎn)基因植物的多核苷酸序列。轉(zhuǎn)基因植物可以是本文所提供的轉(zhuǎn)基因植物中的任何一種。轉(zhuǎn)基因植物可以含有任何載體，表達(dá)盒，或單獨(dú)的核酸或其片段?；蚬こ讨参锊牧吓c制漿制劑的混合可以通過任何基因工程植物材料和制漿制劑的結(jié)合來完成?；旌峡梢酝ㄟ^攪拌來完成。制漿制劑可以是分解木質(zhì)素的物質(zhì)，所述木質(zhì)素將木質(zhì)纖維素植物材料內(nèi)部的木質(zhì)纖維素結(jié)合在一起。所述物質(zhì)可以降解木質(zhì)素而不會(huì)嚴(yán)重降解木質(zhì)纖維素。預(yù)處理可以導(dǎo)致在基因工程植物中表達(dá)的部分酶的釋放和木質(zhì)纖維素植物材料內(nèi)木質(zhì)素的部分降解。所述方法可以包括在預(yù)處理之前，期間或之后對CWD蛋白進(jìn)行激活。所述方法可以包括在供給水解條件之前、期間或之后對CWD蛋白進(jìn)行激活。被激活的CWD蛋白可以是第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白，或任何外加的木質(zhì)纖維素處理酶。CWD蛋白可以被修飾為含有內(nèi)含肽。所述內(nèi)含肽可以融合至CWD酶上或酶末端或酶的內(nèi)部。所述內(nèi)含肽在供給誘導(dǎo)條件下可誘導(dǎo)剪接。誘導(dǎo)條件可以是特定的混合物溫度。誘導(dǎo)條件可以是預(yù)處理或提供水解步驟之前、期間或之后的溫度。經(jīng)內(nèi)含肽修飾的酶和用于誘導(dǎo)內(nèi)含肽剪接的條件，可以作為活化條件，這在2004年7月7日提交的美國申請Appln.10/886,393和2010年的11月5日提交的PCT/US10/55746，2010年的11月5日提交的PCT/US10/55669和2010年的11月5日提交的PCT/US10/55751中有所描述，在此以全文援引的方式納入本文。所述組分可以是需要處理的任何部分。所述組分可以是木質(zhì)纖維材料。所述組分可以為本文所列出的任何CWD蛋白的底物。所述組分可以為木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶，阿魏酸酯酶的底物。所述組分可以是包括本文所列出的任何CWD蛋白的底物的一部分。所述組分可以是包括木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶，阿魏酸酯酶的底物一部分。所述方法還包括混合之前、期間或之后添加其他植物材料，預(yù)處理，或提供水解條件。其他植物材料可以是基因工程材料以外的任何植物生物質(zhì)、纖維素或木質(zhì)纖維材料。其他植物材料可以來源于生物煉制產(chǎn)物。其他植物材料可以包括林業(yè)和農(nóng)業(yè)廢物。林業(yè)和農(nóng)業(yè)廢物可以是但不限于玉米秸稈、甘蔗渣(baggasses)、小麥秸稈、廢木材、森林修剪物(foresttrimmings)、廢紙、城市固體廢物(MSW)。其他植物材料可以是任何能源作物。能源作物可以是但不限于。柳枝稷、高粱、甜菜、甘蔗、芒草和楊樹。編碼第一蛋白，第二蛋白，第三蛋白或任何額外的酶的多核苷酸序列可以可操作地連接至調(diào)控序列上。本文中，可操作地連接意味著調(diào)控元件將其功能賦予多核苷酸序列。在調(diào)控元件是啟動(dòng)子的情況下，當(dāng)將調(diào)控元件與多核苷酸序列可操作地連接的時(shí)候，啟動(dòng)子能夠控制它們的表達(dá)。在調(diào)控元件是終止子的情況下，所述終止子能夠終止多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。下面提供了調(diào)控元件的非限制性參考示例。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的至少一種可以是但不限于選自下列的酶：XynA：來自嗜熱網(wǎng)球菌(Dictyoglomusthermophilum)的β-1,4-木聚糖酶229B(Uniprot登記號(hào)P77853)；XynB：來自米曲霉(Thermomyceslanuginosus)的內(nèi)-1,4-β-木聚糖酶(Uniprot登記號(hào)O43097)；EGA：來自高山象白蟻(Nasutitermestakasagoensis)的內(nèi)-β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Uniprot登記號(hào)O77044)；EGB：來自解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)的內(nèi)-β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Uniprot登記號(hào)P54583)；AccA：來自黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶A(Uniprot登記號(hào)O42807)；AccB：來自黑曲霉的阿魏酸酯酶B(Uniprot登記號(hào)Q8WZI8)；AccA/B：黑曲霉的阿魏酸酯酶A和阿魏酸酯酶B；EGC：來自海洋紅嗜熱鹽菌(Rhodothermusmarinus)的內(nèi)-β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Uniprot登記號(hào)O33897)；P40942：來自糞堆梭菌F9(ClostridiumstercorariumF9)的β-1,4-木聚糖酶(Uniprot登記號(hào)P40942)；P40943：來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌T-6(GeobacillusstearothermophilusT-6嗜熱脂肪芽孢桿菌)的β-1,4-木聚糖酶(Uniprot登記號(hào)P40943)；O30700：來自芽孢桿菌屬NG-27的β-1,4-木聚糖酶(Uniprot登記號(hào)O30700)；CBHA：來自熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)的外切纖維素酶A(Uniprot登記號(hào)O68438)；CBHB：外切纖維素酶B(SYTBD22308)；或XynE：木聚糖酶(EU591743)。第一蛋白可以包括與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列組成，所述參考序列選自由SEQIDNO：1[WTP77853]、SEQIDNO：2[AnfaeA]、SEQIDNO：3[AnfaeB]、SEQIDNO：4[NtEGm]、SEQIDNO：5[EU591743]、SEQIDNO：6[O43097]、SEQIDNO：7[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO：8[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO：9[O33897]、SEQIDNO：10[O68438]和SEQIDNO：11[P54583]所組成的組中。第一蛋白可以包括與參考序列SEQID：12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與參考序列SEQID：12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列組成。第二蛋白可以包括與第二參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與第二參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列組成，所述第二參考序列選自由SEQIDNO：1[WTP77853]、SEQIDNO：2[AnfaeA]、SEQIDNO：3[AnfaeB]、SEQIDNO：4[NtEGm]、SEQIDNO：5[EU591743]、SEQIDNO：6[O43097]、SEQIDNO：7[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO：8[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO：9[O33897]、SEQIDNO：10[O68438]和SEQIDNO：11[P54583]所組成的組中。第二蛋白可以包括與參考序列SEQID：12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與參考序列SEQID：12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列組成。第三蛋白可以包括與第三參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與第三參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列組成，所述第三參考序列選自由SEQIDNO：1[WTP77853]、SEQIDNO：2[AnfaeA]、SEQIDNO：3[AnfaeB]、SEQIDNO：4[NtEGm]、SEQIDNO：5[EU591743]、SEQIDNO：6[O43097]、SEQIDNO：7[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO：8[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO：9[O33897]、SEQIDNO：10[O68438]和SEQIDNO：11[P54583]所組成的組中。第三蛋白可以包括與參考序列SEQID：12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與參考序列SEQID：12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列組成。第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種還可以包括編碼各自靶向肽的第一靶向多核苷酸序列。對于缺乏第三多核苷酸序列的基因植工程植物材料，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列的至少一種上。對于缺乏第二多核苷酸和第三多核苷酸序列的基因工程植物材料，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的每種可以獨(dú)立選擇各自的靶向肽。靶向肽可以融合到第一蛋白，第二蛋白或第三蛋白上。每種各自的靶向肽可以獨(dú)立地選自但不限于造粉體靶向信號(hào)、細(xì)胞壁靶向肽、線粒體靶向肽、細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)、葉綠體靶向信號(hào)、核靶向肽和液泡靶向肽。第一靶向多肽可以位于所述第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列的上游。靶向肽可以與SEQIDNO：13[BAASS]、大麥糊粉粒序列SEQIDNO：14[HVAlePS]、SEQIDNO：15[PR1a]、SEQIDNO：16[γ玉米蛋白序列xGZein27ss-02]或SEQIDNO：17[GluB4SP]中的一種具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性。與第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的一種相結(jié)合的第一靶向多核苷酸序列可以編碼與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列，所述參考序列選自由SEQIDNO：18[BAASS:P77853]、SEQIDNO：19[BAASS:O33897]、SEQIDNO：20[HVAlePS:NtEGm]和SEQIDNO：21[BAAS:P77853:S158-30-108-35]所組成的組中。第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種還可以包括編碼羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列。對于缺乏第三多核苷酸序列的基因工程植物材料，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列中的至少一種上。對于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的基因工程植物材料，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。羧基靶向肽可以選自但不限于與SEQIDNO：22[SEKDEL]、縮減的SEQIDNO：23[KDEL]或大麥液泡分類決定序列SEQIDNO：24[HvVSD-01]中的一種具有至少72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100的同一性的序列。羧基靶向肽可以融合到第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白的至少一種上。在細(xì)胞質(zhì)積累中，提供的所述第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中至少有一種可以不含有靶向肽。所述第一靶向多核苷酸序列和第二靶向多核苷酸序列與第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列結(jié)合在一起，可以編碼與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列，所述參考序列選自由SEQIDNO：25[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]、SEQIDNO：26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQIDNO：27[PR1a:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO：28[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO：29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO：30[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQIDNO：31[xGZein27ss-02:BD22308:HVVSD-01]所組成的組中。第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種可以編碼CWD蛋白的“變體”。所述CWD蛋白的變體的氨基酸序列可以根據(jù)氨基酸序列的缺失、添加、替換或CWD蛋白的其它修飾而改變。CWD蛋白的變體可以維持CWD蛋白的生物活性。本文中，所述維持生物活性是指，變體至少有從CWD蛋白中得到的60％的活性。對木聚糖酶活性的評(píng)估可以在實(shí)驗(yàn)中使用本文中實(shí)施例1標(biāo)題為“秸稈酶活性測定”的小節(jié)中描述的XylazymeAX底物。對內(nèi)切葡聚糖酶的活性的評(píng)估可以通過在實(shí)驗(yàn)中使用本文中實(shí)施例1標(biāo)題為“秸稈酶活性測定”的小節(jié)中描述的Cellazyme底物。外切葡聚糖酶活性的評(píng)估可以通過在實(shí)驗(yàn)中使用熒光4-甲基傘形酮-b-D-乳吡喃糖苷(4-methylumbelliferyl-b-D-lactopyranoside)(4-MU)，如HarrisonMDetal.2011“Accumulationofrecombinantcellobiohydrolaseandendoglucanaseintheleavesofmaturetransgenicsugarcane,”PlantBiotechnologyJournal(植物生物科技雜志)9：884-896中所描述的，這里以全文援引的方式納入本文。對阿魏酸酯酶活性的評(píng)估可以通過在實(shí)驗(yàn)中使用pNP標(biāo)記的阿魏酸鹽作為底物(詳見HegdeS.等.2009“Single-stepsynthesisof4-nitrophenylferulateforspectrophotometricassayofferuloylesterases,”AnalyticalBiochemistry(分析生物化學(xué))387(1)：128-129)。上述木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶或阿魏酸酯酶活性的測試可以用來確定與CWD降解蛋白序列有少于100％的同一性的序列是否為CWD降解蛋白的變體。這里CWD蛋白的變體可以被修飾成與CWD蛋白有相似的疏水性、親水性、溶解度、氨基酸殘基極性的氨基酸序列。這里CWD蛋白可以根據(jù)翻譯后的修飾而改變。不同的翻譯后修飾可以是但不限于糖基化，乙?；蛄姿峄饔谩Ｗ凅w可以通過任何方式形成。變體可以通過定點(diǎn)誘變或非定點(diǎn)誘變形成。本文中，易錯(cuò)PCR可以用來創(chuàng)建CWD蛋白的突變體，而且以上任何實(shí)驗(yàn)均可以用來評(píng)估突變體是否是變體。實(shí)施方式包括將第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白，或它們的變體中的至少一種融合到靶向肽或羧基靶向肽中的至少一種的變體上。靶向肽或羧基靶向肽的變體將蛋白靶向融合到與靶向肽或羧基靶向肽的參考序列相同的位點(diǎn)上。內(nèi)含肽的變體可以在第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中提供。內(nèi)含肽的變體可以從其融合的蛋白中剪接。為確定兩種氨基酸序列或兩種核酸序列的同一性百分比，可以包括在兩條序列的相應(yīng)位置上比對和比較氨基酸殘基或核苷酸。如果兩條序列所有的位置都被相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)，那么這兩條序列被稱為具有100％的同一性。同一性百分比可以通過SmithWaterman算法測定(SmithTF、WatermanMS1981“IdentificationofCommonMolecularSubsequences,”JMolBiol147：195-197，該文獻(xiàn)通過全文援引的方式納入本文)。在一種實(shí)施方式中，編碼與引用的氨基酸參考序列具有低于100％同一性的蛋白的多核苷酸序列可以編碼含有氨基酸參考序列的蛋白的變體。在一種實(shí)施方式中，與引用的氨基酸參考序列具有低于100％的同一性的蛋白可以是含有氨基酸參考序列的蛋白的變體。在一種實(shí)施方式中，編碼與引用的核酸參考序列編碼的蛋白具有低于100％的同一性的蛋白的多核苷酸序列可以編碼蛋白的變體，所述蛋白由參考序列編碼。參考圖1，顯示了一種從基因工程植物材料中生產(chǎn)可溶性糖的方法。圖1顯示了基因工程植物材料的聯(lián)合預(yù)處理和水解的工藝流程。基因工程植物材料或基因工程植物材料混同其他植物材料可以通過送料機(jī)10添加到反應(yīng)器20進(jìn)行化學(xué)預(yù)處理和酶液化，也就是說，將固體木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成液化狀態(tài)以進(jìn)一步加工和水解的過程。在反應(yīng)器20，基因工程植物材料或基因工程植物材料混同其他植物材料可以與制漿制劑混合。制漿制劑可以包括至少一種組分，所述組分具有選自由亞硫酸根、亞硫酸氫根、硫酸根、碳酸根、氫氧根和氧負(fù)離子(oxide)所組成的組中的離子。所述至少一種組分還包括但不限于選自由銨離子、鈉離子、鎂離子及鈣離子所組成的組中的反荷離子(counterion)。至少一種組分可以是鹽。所述鹽可以是但不限于亞硫酸鹽(SO32-)、亞硫酸氫鹽(HSO3-)、氧化物(O2-)和氫氧化物(OH-)。所述鹽可以包括反荷離子。反荷離子可以包括但不限于鈉離子(Na+)、鈣離子(Ca2+)、氫離子、鉀離子(K+)、鎂離子(Mg2+)和銨離子(NH4+)。制漿制劑可以包括氧化鈣(CaO)、石灰或氫氧化鈣(Ca(OH)2)、消石灰中的至少一種。在一種實(shí)施方式中，制漿制劑可以至少包括亞硫酸氫銨和碳酸銨中的一種。亞硫酸氫銨的濃度可為0.02M至0.35M，而碳酸銨的濃度可為0.025M至0.25M。制漿制劑可以與基因工程植物材料或混有其他植物材料的基因工程植物材料以優(yōu)選的液固比混合成混合物。這種混合物具有的液固比可選自小于或等于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1的值，或上述任何兩個(gè)值區(qū)間內(nèi)的任意值(包括端點(diǎn))。例如，液固比可以為小于任何選自3–7之間的整數(shù)或非整數(shù)的值。液固比值可以等于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1，或上述任何兩個(gè)值區(qū)間內(nèi)任何值(包含端點(diǎn))。例如，液固比可以為等于3至7范圍內(nèi)任何整數(shù)或非整數(shù)的值。預(yù)處理可以包括培養(yǎng)混合物任意一段時(shí)間。預(yù)處理可以包括培養(yǎng)混合物長達(dá)16個(gè)小時(shí)。所述培養(yǎng)可以進(jìn)行更長或更短的時(shí)間。預(yù)處理可以包括培養(yǎng)混合物一段小于或等于16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小時(shí)的時(shí)間。預(yù)處理可以包括提供40℃至95℃的混合物溫度。40℃至95℃的混合物溫度，可以在不使水解酶失活的情況下破損或除去混合物中木質(zhì)素纖維材料的部分木質(zhì)素。預(yù)處理可以包括提供55℃、65℃、75℃、95℃、低于55℃、低于65℃、低于75℃、低于95℃、低于100℃、40℃至55℃、40℃至65℃、40℃至75℃、40℃至95℃、40℃至低于100℃、55℃至65℃、55℃至75℃、55℃至95℃、55℃至低于100℃、65℃至75℃、65℃至95℃、65℃至低于100℃、75℃至95℃、75℃至低于100℃或95℃至低于100℃的混合物溫度。預(yù)處理可以包括提供混合物pH值為5.0至10。預(yù)處理可以包括提供混合物pH值在6.5-8.5范圍內(nèi)。提供的混合物pH值可以是5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0、9.5或10，或任意兩個(gè)上述pH值之間的(包括端點(diǎn))pH值。預(yù)處理過程中混合物的pH值可以取決于使用的化學(xué)物質(zhì)的類型和/或使用的植物材料的類型。提供混合物pH值可以包括添加pH值調(diào)節(jié)化學(xué)物質(zhì)。pH值調(diào)節(jié)化學(xué)物質(zhì)可以是酸或堿。預(yù)處理步驟結(jié)束時(shí)，混合物可以包括部分降解的植物材料和稱為部分濾液的液相，所述部分濾液可以含有來自制漿制劑和低濃度的CWD酶的化學(xué)物質(zhì)或從基因工程植物材料釋放的酶。所述方法可以包括在分離器30中從部分降解的植物材料的固體部分分離部分濾液。分離可通過各種工藝來完成?？梢酝ㄟ^沉淀、過濾或離心部分濾液。所述方法可以包括在多個(gè)回合的預(yù)處理中至少收集或回收一部分部分濾液。在去除部分濾液后，混合物中固體的濃度可以增加并且可以為在2％至15％(w/v)的范圍內(nèi)的任何整數(shù)或非整數(shù)值，或?yàn)樵?％至15％(w/v)范圍內(nèi)的任何兩個(gè)整數(shù)值內(nèi)的范圍。所述方法可以包括用任何合適的液體清洗預(yù)處理的基因工程植物材料。液體可以是去離子水。液體可以通過離心分離而去除。所述方法還包括通過機(jī)械研磨來精煉，這可以在精煉機(jī)40內(nèi)通過任何已知的方法完成，例如但不限于去纖維化(defibrillation)，研磨或打碎。所述方法可以包括轉(zhuǎn)移精煉的預(yù)處理的生物質(zhì)到糖化容器50。從基因工程植物材料中釋放的CWD酶的水解作用發(fā)生在糖化容器50中。提供的水解條件可以包括調(diào)整混合物為2％至25％的固含量，在2％至25％(包括端點(diǎn))之間的任何整數(shù)或非整數(shù)值的固含量，或在2％至25％之間任意兩個(gè)整數(shù)范圍內(nèi)的任何整數(shù)或非整數(shù)值的固含量。提供的水解條件可以包括培養(yǎng)混合物長達(dá)144小時(shí)的一段時(shí)間，選自長達(dá)144小時(shí)的任何一個(gè)整數(shù)或非整數(shù)值的一段時(shí)間，或大于零和長達(dá)144小時(shí)內(nèi)任意兩個(gè)整數(shù)值范圍內(nèi)的一段時(shí)間。提供水解條件可以包括提供100℃或更低、65℃或更低、50℃或更低、48℃至50℃、48℃至65℃、48℃至小于100℃，或48℃至100℃的混合物溫度。提供水解條件可以包括提供從4.8至5.0范圍的pH值，4.8的pH值，4.9的pH值或者5.0的pH值?？梢愿鶕?jù)基因工程植物材料中CWD酶的具體活性來選擇溫度，pH值或處理時(shí)間中的至少一種。如果基因工程植物材料包括多種CWD酶，可以按順序?yàn)樗龆喾N酶中的每一種的表達(dá)、預(yù)處理或水解中的至少一步提供最佳的條件。水解條件可以包括提供一種酶活性最佳的pH值，然后提供適于另一種酶活性的最佳的不同pH值。水解條件可以包括在不同的時(shí)段來調(diào)整每種酶最佳活性的溫度。例如，木聚糖酶可能需要不同于內(nèi)切葡聚糖酶的溫度或pH值。所述方法包括添加一種或多種外源酶到基因工程植物材料，其它植物材料或混合物其中的至少一種中。外源酶可以在預(yù)處理之前、期間或之后添加。外源酶可以在提供水解條件之前、期間或之后添加。外源酶可以添加到糖化容器50中。一種或多種外源酶可以以復(fù)合酶(enzymecocktail)的形式提供。復(fù)合酶可以包括一種或多種CWD酶。本文中，在一種實(shí)施方式中提供的CWD酶可以是但不限于木質(zhì)素降解酶，纖維素降解酶或半纖維素降解酶。本文中，在一種實(shí)施方式中提供的CWD酶可以是但不限于選自糖苷酶、木聚糖酶、纖維素酶、纖維素內(nèi)切酶、外切葡萄糖酶、外切纖維素酶、β-木糖苷酶、阿魏酸酯酶以及淀粉酶中的一種。復(fù)合酶可以包括從里氏木霉(Trichodermareesii)中分離的的纖維素酶。復(fù)合酶可以從供應(yīng)商購買。復(fù)合酶可以為但不限于從杰能科國際(GenencorInternational)(羅契斯特市，紐約)購買的AccelleraseTM1000，1500和XY。復(fù)合酶可以是諾纖力·賽力二代(Cellic)。酶Cellic可以包括不同類型的CWD酶?；旌衔镏胁煌愋偷腃WD酶的最優(yōu)條件可以被提供。例如，在所述方法中，可以調(diào)節(jié)水解處理的溫度、pH值和時(shí)間以為混合物中不同的酶提供最優(yōu)條件。水解條件可以包括減少復(fù)合酶中含有的外源酶的用量。減少用量可以包括在基因工程植物材料中具有較少的或缺乏一種或多種CWD蛋白表達(dá)的制劑。例如，如果轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)木聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶，這些酶可以從按配方制成的用于具有轉(zhuǎn)基因植物的基因工程植物材料水解的復(fù)合酶中去除。水解效率可以通過測量植物材料的增溶進(jìn)行評(píng)估。測量植物材料增溶的方法為本
技術(shù)領(lǐng)域：
：所公知，可以包括確定單糖和二糖濃度，例如通過高效液相色譜(HPLC)法。在此描述的實(shí)施例中，可以使用具有LC解決方案軟件(solutionssoftware)的ShimadzuLC-20AD二元液相泵(Shimadzu，Kyoto，Japan)進(jìn)行HPLC，糖濃度的測量可以使用AminexHPX-87p糖柱(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)。其他測量植物材料的增溶的方法，例如，通過測定重量損失、木質(zhì)素去除或?qū)︻A(yù)處理的植物材料進(jìn)行脫乙酰作用都是可用的。所述方法還可以包括使混合物和/或水解產(chǎn)物與發(fā)酵生物相接觸，以便生產(chǎn)生化產(chǎn)品。酶水解后，可溶性糖可以回收并用于生產(chǎn)生化產(chǎn)品?；蛘?，在所述方法中，可以同步糖化和發(fā)酵可溶性糖以形成生化產(chǎn)品。生化產(chǎn)品可以是但不限于丁烷、丁二醇、丁二烯、丁醇、異丁醇、丙烷、丙二醇、丙烯、丙醇、異丙醇、甲烷、甲醇、乙醇、苯酚、丙三醇、乙烯、甲苯、乙酯(ethyl)、苯、苯乙烯、二甲苯、乙二醇、環(huán)氧乙烷、甲酸、二氧化碳、甲醛、乙醛、丙酮、維生素、乙烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、苯、醋酸、山梨糖醇、阿拉伯糖醇、琥珀酸、胡索酸、蘋果酸、呋喃二羧酸、天冬氨酸、葡糖二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、羥基內(nèi)丁酯、甘油、山梨醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、葡糖酸、乳酸、丙二酸、丙酸、檸檬酸、烏頭酸、木糖酸、糠醛、左旋葡聚糖、丙氨酸、脯氨酸、賴氨酸、絲氨酸或蘇氨酸(參見T.Werpy和G.Petersen,TopValueAddedChemicalsFromBiomass,Volume1,ResultsofScreeningforPotentialCandidatesfromSugarsandSynthesisGas,2004年8月,Report,PNNL&NREL，在此以全文引用的方式納入本文)。所述方法可以包括同步糖化和發(fā)酵可溶性糖生產(chǎn)乙醇。同步糖化和發(fā)酵生產(chǎn)乙醇可以包括在預(yù)處理之前、期間或之后提供釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)D5A或提供水解條件?？梢酝ㄟ^任何合適的發(fā)酵生物將糖類轉(zhuǎn)換成所需的生化產(chǎn)品。發(fā)酵生物可以根據(jù)所需的生化產(chǎn)品來選擇。發(fā)酵生物可以是酵母。酵母可以是但并不僅限于酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichiai)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、刀孢酵母屬(Spathaspora)或發(fā)酵酵母屬(Scheffersomyces)各屬種中的一種。發(fā)酵的生物可以是細(xì)菌。細(xì)菌可以是但不限于單胞發(fā)酵菌屬(Zymomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)或梭菌屬(Clostridium)各屬種中的一種。發(fā)酵生物可以是野生型生物或基因工程重組生物。一種實(shí)施方式包括含有編碼第一蛋白的第一多核苷酸序列的基因工程植物。第一蛋白可以是CWD蛋白。第一蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。第一蛋白可以通過任何一種描述的有關(guān)從基因工程植物材料生產(chǎn)可溶性糖的方法中獲得。第一蛋白可以包括、基本上由或由與第一參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列組成，所述第一參考序列選自由SEQIDNO：1[WTP77853]、SEQIDNO：2[AnfaeA]、SEQIDNO：3[AnfaeB]、SEQIDNO：4[NtEGm]、SEQIDNO：5[EU591743]、SEQIDNO：6[O43097]、SEQIDNO：7[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO：8[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO：9[O33897]、SEQIDNO：10[O68438]和SEQIDNO：11[P54583]所組成的組中。所述第一蛋白可以包括，基本上由或由與參考序列SEQID：12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列組成?；蚬こ讨参镞€可以包括編碼第二蛋白的第二多核苷酸序列。第二蛋白可以是CWD酶。第二蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。第二蛋白可以通過任何一種描述的有關(guān)從基因工程植物材料生產(chǎn)可溶性糖的方法中獲得。第二蛋白可以包括、基本上由或由與第二參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列組成，所述第二參考序列選自由SEQIDNO：1[WTP77853]、SEQIDNO：2[AnfaeA]、SEQIDNO：3[AnfaeB]、SEQIDNO：4[NtEGm]、SEQIDNO：5[EU591743]、SEQIDNO：6[O43097]、SEQIDNO：7[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO：8[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO：9[O33897]、SEQIDNO：10[O68438]、SEQIDNO：11[P54583]和SEQID：12[BD22308所組成的組中。被選定為第二參考序列的SEQIDNO可以不同于被選定為第一參考序列的SEQIDNO?；蚬こ讨参镞€可以包括編碼第三蛋白的第三多核苷酸序列。第三蛋白可以是CWD酶。第三蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。第三蛋白可以通過任何一種描述的有關(guān)從基因工程植物材料生產(chǎn)可溶性糖的方法中獲得。第三蛋白可以包括與第三參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與第三參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列組成，所述第三參考序列選自由SEQIDNO：1[WTP77853]、SEQIDNO：2[AnfaeA]、SEQIDNO：3[AnfaeB]、SEQIDNO：4[NtEGm]、SEQIDNO：5[EU591743]、SEQIDNO：6[O43097]、SEQIDNO：7[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO：8[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO：9[O33897]、SEQIDNO：10[O68438]、SEQIDNO：11[P54583]和SEQID：12[BD22308]所組成的組中。被選定為第三參考序列的SEQIDNO可以不同于被選定為第一參考序列的SEQIDNO。被選定為第三參考序列的SEQIDNO可以不同于被選定為第二參考序列的SEQIDNO。基因工程植物中的第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種還可以包括編碼各自的靶向肽的第一靶向多核苷酸序列。對于缺乏第三多核苷酸序列的基因工程植物，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列的至少一種上。對于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的基因工程植物，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。各自靶向肽可以獨(dú)立地選自但不限于造粉體靶向信號(hào)、細(xì)胞壁肽、線粒體靶向肽、細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)，葉綠體靶向信號(hào)，細(xì)胞核靶向肽或液泡靶向肽。每條單獨(dú)的靶向肽可以融合到相應(yīng)的第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白上。靶向肽可以與SEQIDNO：13[BAASS]、SEQIDNO：14[HvAleSP]、SEQIDNO：15[PR1a]、SEQIDNO：16[xGZein27ss-02]或SEQIDNO：17[GluB4SP]中的一種具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性?；蚬こ讨参锏牡谝欢嗪塑账嵝蛄?、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種還可以包括編碼羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列。對于缺乏第三多核苷酸序列的基因工程植物，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列中的至少一種上。對于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的基因工程植物，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。羧基靶向肽可以選自但不限于與SEQIDNO：22[SEKDEL]、縮減的SEQIDNO：23[KDEL]或SEQIDNO：24[大麥液泡分類決定序列HvVSD-01]中的一種具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100的同一性的序列。羧基靶向肽可以融合到第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白的至少一種上。基因工程植物可以包括至少一種編碼氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包括與選自由SEQIDNO：18[BAASS:P77853]、SEQIDNO：19[BAASS:O33897]、SEQIDNO：20[HVAlePS:NtEGm]、SEQIDNO：21[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO：25[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]、SEQIDNO：26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQIDNO：27[PR1a:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO：28[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO：29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO：30[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQIDNO：31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所組成的組中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的序列、基本上由或由與選自由SEQIDNO：18[BAASS:P77853]、SEQIDNO：19[BAASS:O33897]、SEQIDNO：20[HVAlePS:NtEGm]、SEQIDNO：21[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO：25[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]、SEQIDNO：26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQIDNO：27[PR1a:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO：28[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO：29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO：30[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQIDNO：31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所組成的組中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的序列組成。基因工程植物可以包括至少一種氨基酸序列，所述氨基酸序列包括與選自由SEQIDNO：18[BAASS:P77853]、SEQIDNO：19[BAASS:O33897]、SEQIDNO：20[HVAlePS:NtEGm]、SEQIDNO：21[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO：25[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]、SEQIDNO：26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQIDNO：27[PR1a:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO：28[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO：29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO：30[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQIDNO：31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所組成的組中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的序列、基本上由或由與選自由SEQIDNO：18[BAASS:P77853]、SEQIDNO：19[BAASS:O33897]、SEQIDNO：20[HVAlePS:NtEGm]、SEQIDNO：21[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO：25[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]、SEQIDNO：26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQIDNO：27[PR1a:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO：28[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO：29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO：30[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQIDNO：31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所組成的組中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的序列組成?；蚬こ讨参锟梢允寝D(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)基因植物的子代，轉(zhuǎn)基因植物的后代，或上述的任何一部分。基因工程植物可以包括不在植物中天然存在的CWD蛋白，或編碼相同CWD蛋白的基因。CWD蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。轉(zhuǎn)基因植物可以是任何類型的植物。轉(zhuǎn)基因植物類型可以是玉米、甘蔗、甜菜、高粱、柳枝稷、芒草、桉樹、柳樹或楊樹。轉(zhuǎn)基因植物可以通過已知的方法創(chuàng)建，用來表達(dá)任何形式的CWD酶或CWD蛋白。所述植物可以使用載體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化來創(chuàng)建，所述載體包括編碼酶的多核苷酸序列。還可以通過用于轉(zhuǎn)基因植物的其他方法來創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因植物，例如，基因槍法或直接吸收DNA法。本文所述的轉(zhuǎn)基因植物可以含有任何單獨(dú)的核酸、氨基酸序列、表達(dá)盒或載體。在一種實(shí)施方式中提供了一種表達(dá)盒，包括第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種，分別編碼第一蛋白、第二蛋白和第三蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一種或多種可以是CWD蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一種或多種可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一種或多種可以是從基因工程植物材料或基因工程植物中生產(chǎn)可溶性糖的方法中描述的一種蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一種或多種可以是木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的內(nèi)切葡聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的外切葡聚糖酶或經(jīng)內(nèi)含肽修飾的阿魏酸酯酶。被選定為第二蛋白的蛋白可以不同于被選定為第一蛋白的蛋白。被選定為第三蛋白的蛋白可以不同于被選定為第一蛋白的蛋白。被選定為第三蛋白的蛋白可以不同于被選定為第二蛋白的蛋白。在表達(dá)盒中編碼CWD蛋白的第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中至少有一種可以通過插入編碼內(nèi)含肽的核酸序列被修飾。經(jīng)內(nèi)含肽修飾的多核苷酸可以使用修飾功能編碼經(jīng)內(nèi)含肽修飾的蛋白。修飾功能可以使CWD蛋白失活而內(nèi)含肽仍然融合到或在CWD蛋白中。存在于經(jīng)內(nèi)含肽修飾的蛋白中的內(nèi)含肽可以誘導(dǎo)剪接形成非經(jīng)內(nèi)含肽修飾的蛋白。剪接的誘導(dǎo)條件可以是但并不局限于提供一定的溫度。提供的溫度可以是用于從基因工程植物材料中生產(chǎn)可溶性糖的方法中描述的預(yù)處理或水解條件中至少一種中提供的溫度。誘導(dǎo)條件可以是與選定的內(nèi)含肽相匹配的任何其他誘導(dǎo)條件。經(jīng)內(nèi)含肽修飾的蛋白可以是iXynA：即，經(jīng)內(nèi)含肽修飾的XynA。經(jīng)內(nèi)含肽修飾的蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的P77853。經(jīng)內(nèi)含肽修飾的蛋白可以是P77853:T134-100-101或P77853:S158-30-108-35。在表達(dá)盒中的第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一種或多種可以包括與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列組成，所述參考序列選自由SEQIDNO：1[WTP77853]、SEQIDNO：2[AnfaeA]、SEQIDNO：3[AnfaeB]、SEQIDNO：4[NtEGm]、SEQIDNO：5[EU591743]、SEQIDNO：6[O43097]、SEQIDNO：7[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO：8[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO：9[O33897]、SEQIDNO：10[O68438]和SEQIDNO：11[P54583]所組成的組中。所述第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一種或多種可以包括、基本上由或由與參考序列SEQID:12(BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列組成。表達(dá)盒中的第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列其中至少有一種還可以包括編碼各自的靶向肽的第一靶向多核苷酸序列。對于缺乏第三多核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體，第一靶向多核苷酸序列可以被包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列的至少一種上。對于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。每種各自的靶向肽可以獨(dú)立地來自第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的每一種。靶向肽可以融合到第一蛋白，第二蛋白或第三蛋白上。每種各自的靶向肽可以獨(dú)立選自但不限于造粉體靶向信號(hào)、細(xì)胞壁靶向肽、線粒體靶向肽、細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)、葉綠體靶向信號(hào)、細(xì)胞核靶向肽和液泡靶向肽。第一靶向多核苷酸可以位于第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列的上游。靶向肽可以與BAASS(SEQIDNO：13)、大麥糊粉序列HVAlePS(SEQIDNO：14)、PR1a(SEQIDNO：15)、γ玉米蛋白序列xGZein27ss-02(SEQIDNO：16)或GluB4SP(SEQIDNO：17)中的一種具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性。第一靶向多核苷酸序列與第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列結(jié)合在一起可以編碼與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列，所述參考序列選自由SEQIDNO：18[BAASS:P77853]、SEQIDNO：19[BAASS:O33897]、SEQIDNO：20[HVAlePS:NtEGm]和SEQIDNO：21[BAAS:P77853:S158-30-108-35]所組成的組中。表達(dá)盒中的第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少有一種還可以包括編碼羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列。對于缺乏第三多核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列上。對于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。羧基靶向肽可以選自但不限于與SEKDEL(SEQIDNO：22)，縮減的KDEL(SEQIDNO：23)或大麥液泡分類決定序列HvVSD-01(SEQIDNO：24)中的一種具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100同一性的序列。羧基靶向肽可以與所述第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的至少一種相融合。表達(dá)盒可以配置為提供第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的至少一種，不含有用于在細(xì)胞質(zhì)中積累的靶向肽。在表達(dá)盒中，與第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三核苷酸序列中的一種結(jié)合到一起的第一靶向多核苷酸序列和第二靶向多核苷酸序列可以編碼與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列，所述參考序列選自由SEQIDNO：25[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]，SEQIDNO：26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]，SEQIDNO：27[PR1a:NtEGm:SEKDEL]，SEQIDNO：28[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]，SEQIDNO：29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]，SEQIDNO：30[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQIDNO：31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所組成的組中。實(shí)施方式包括編碼與靶向肽或羧基靶向肽中的至少一種相融合的第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白，或者它們的變體中的至少一種的表達(dá)盒。在一種實(shí)施方式中，在表達(dá)盒中，編碼與所引用的氨基酸參考序列具有低于100％同一性的蛋白的多核苷酸序列，可以編碼具有氨基酸參考序列的蛋白的變體。在一種實(shí)施方式中，與所引用的氨基酸參考序列具有低于100％的同一性的蛋白可以是具有氨基酸參考序列的蛋白的變體。在一種實(shí)施方式中，編碼與所引用核酸參考序列編碼的蛋白具有低于100％同一性的蛋白的多核苷酸序列，可以編碼所述參考序列編碼的蛋白的變體。在一種表達(dá)盒中，所述第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種能夠與在低度、中度或高度嚴(yán)格條件下編碼CWD蛋白或經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白的參考序列雜交。所述第一，第二或第三多核苷酸中的至少一種能夠在低度、中度或高度嚴(yán)格條件下與含有參考序列的核酸雜交，所述參考序列選自由SEQIDNO：32[WTP77853]、SEQIDNO：33[AnfaeA]、SEQIDNO：34[AnfaeB]、SEQIDNO：35[NtEGm]、SEQIDNO：36[EU591743]、SEQIDNO：37[O43097]、SEQIDNO：38[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO：39[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO：40[033897]、SEQIDNO：41[O68438]、SEQIDNO：42[P54583]和SEQIDNO：43[BD22308]的所組成的組中。表達(dá)盒可以包括能夠在低度、中度或高度嚴(yán)格條件下與含有參考序列的核酸雜交的多核苷酸序列，所述參考序列選自由含有SEQIDNO：52[BAASS:P77853]、SEQIDNO：53[BAASS:O33897]、SEQIDNO：54[HVAlePS:NtEGm]、SEQIDNO：55[BAASS：P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO：56[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]、SEQIDNO：57[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQIDNO：58[PR1a:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO：59[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO：60[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO：61[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQIDNO：62[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]的序列所組成的組中。本文的表達(dá)盒可以包括調(diào)控元件。在一種實(shí)施方式中，提供了包括本文所述的任何分離的核酸，多核苷酸序列或表達(dá)盒的載體。本文的實(shí)施方式包括其中結(jié)合有至少一種本文所述的表達(dá)盒的質(zhì)粒，染色體，線粒體DNA，質(zhì)體DNA，病毒或核酸片段。一種實(shí)施方式提供了用于在植物中表達(dá)CWD蛋白的載體。一種實(shí)施方式提供了植物轉(zhuǎn)化載體。所述植物轉(zhuǎn)化載體可以是但并不僅限于T-DNA載體，雙運(yùn)載體或共整合載體。轉(zhuǎn)化載體可以包括本文所述的任何分離的核酸，多核苷酸序列或表達(dá)盒。一種實(shí)施方式包括含有多核苷酸序列的表達(dá)載體，所述多核苷酸能夠在低度、中度或高度嚴(yán)格條件下與含有以下序列的核酸雜交，所述序列包括、基本上由或由選自由SEQIDNO：63[pAG2015]、SEQIDNO：64[pAG2048]、SEQIDNO：65[pAG2049]、SEQIDNO：66[pAG2063]、SEQIDNO：67[pAG2069]、SEQIDNO：68[pAG2091]、SEQIDNO：69[pAG2092]、SEQIDNO：70[pAG2096]、SEQIDNO：71[pAG2201]、SEQIDNO：72[pAG2229]、SEQIDNO：73[pAG2233]、SEQIDNO：74[pAG2234]、SEQIDNO：75[pAG2242]、SEQIDNO：76[pAG2252]、SEQIDNO：77[pAG2253]、SEQIDNO：78[pAG2309]、SEQIDNO：79[pAG2310]、SEQIDNO：80[pAG2339]、SEQIDNO：81[pAG2342]、SEQIDNO：82[pAG2345]和SEQIDNO：83[pAG2349]所組成的組中的序列組成。一種實(shí)施方式包括含有多核苷酸序列的表達(dá)載體，所述多核苷酸序列與選自由SEQIDNO：63[pAG2015]、SEQIDNO：64[pAG2048]、SEQIDNO：65[pAG2049]、SEQIDNO：66[pAG2063]、SEQIDNO：67[pAG2069]、SEQIDNO：68[pAG2091]、SEQIDNO：69[pAG2092]、SEQIDNO：70[pAG2096]、SEQIDNO：71[pAG2201]、SEQIDNO：72[pAG2229]、SEQIDNO：73[pAG2233]、SEQIDNO：74[pAG2234]、SEQIDNO：75[pAG2242]、SEQIDNO：76[pAG2252]、SEQIDNO：77[pAG2253]、SEQIDNO：78[pAG2309]、SEQIDNO：79[pAG2310]、SEQIDNO：80[pAG2339]、SEQIDNO：81[pAG2342]、SEQIDNO：82[pAG2345]和SEQIDNO：83[pAG2349]所組中的組中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性。雜交的方法和嚴(yán)格度條件為本
技術(shù)領(lǐng)域：
：所公知，并且在以下書籍中有所描述：MolecularCloning,T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook，ColdSpringHarborLaboratory,1982，以及CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Siedman,J.A.Smith,K.Struhl,Volume1,JohnWiley&Sons,2000，在此以全文援引的方式納入本文。溫和的條件可以如下：將裝有DNA樣品的過濾器在含有6x檸檬酸鹽緩沖鹽水(SSC；Amresco，Inc.，Solon，OH)、0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS；Amresco，Inc.，Solon，OH)，5xDenhardt’s溶液(Amresco，Inc.，Solon，OH)以及和變性鮭魚精子(InvitrogenLifeTechnologies，Inc.Carlsbad，CA)的溶液中68℃預(yù)處理2-4小時(shí)。雜交是在同樣的溶液中并稍加以下改動(dòng)：0.01MEDTA(Amresco，Inc.，Solon，OH)、100μg/ml鮭魚精子DNA以及5–20x106cpm的32P-標(biāo)記或熒光標(biāo)記探針。過濾器先在雜交混合物中孵育16-20小時(shí)，然后用含有2xSSC和0.1％SDS的溶液洗15分鐘。第二次清洗更換含有0.1xSSC和0.5％SDS的洗液，并且在Tm(融化溫度℃)以下20℃至29℃下額外培養(yǎng)2小時(shí)。Tm＝81.5+16.61Log10([Na+]/(1.0+0.7[Na+]))+0.41(％[G+C])-(500/n)-P-F。[Na+]＝鈉離子的摩爾濃度。％[G+C]＝DNA序列中G+C堿基的百分比。N＝DNA序列的堿基長度。P＝錯(cuò)配堿基對百分比的溫度校正(每1％的錯(cuò)配約1℃)。F＝甲酰胺濃度的校正(每1％甲酰胺＝0.63℃)。過濾器暴露在成像儀中或者通過放射自顯影法顯影。低嚴(yán)格度條件是指低溫雜交條件，例如，在37℃和60℃之間，第二次洗滌在低于Tm的40℃至48℃的溫度下用高濃度[Na+](高達(dá)0.825M)。高嚴(yán)格度是指在高溫雜交條件，例如，高于68℃，第二次洗滌在低于Tm的5℃至10℃的溫度下用0.0165至0.0330M的[Na+]。一種實(shí)施方式提供了分離的核酸序列，所述核酸序列在低度、中度和高度嚴(yán)格條件下與含有選自SEQIDNO：32[WTP77853]、SEQIDNO：33[AnfaeA]、SEQIDNO：34[AnfaeB]、SEQIDNO：35[NtEGm]、SEQIDNO：36[EU591743]、SEQIDNO：37[O43097]、SEQIDNO：38[P77853:T134-100-101]和SEQIDNO：39[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO：40[O33897]、SEQIDNO：41[O68438]、SEQIDNO：42[P54583]和SEQID：43[BD22308]、SEQIDNO：52[BAASS:P77853]、SEQIDNO：53[BAASS:O33897]、SEQIDNO：54[HVAlePS:NtEGm]、SEQIDNO：55[BAASS：P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO：56[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]、SEQIDNO：57[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQIDNO：58[PR1a:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO：59[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO：60[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO：61[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQIDNO：62[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]、SEQIDNO：63[pAG2015]、SEQIDNO：64[pAG2048]、SEQIDNO：65[pAG2049]、SEQIDNO：66[pAG2063]、SEQIDNO：67[pAG2069]、SEQIDNO：68[pAG2091]、SEQIDNO：69[pAG2092]、SEQIDNO：70[pAG2096]、SEQIDNO：71[pAG2201]、SEQIDNO：72[pAG2229]、SEQIDNO：73[pAG2233]、SEQIDNO：74[pAG2234]、SEQIDNO：75[pAG2242]、SEQIDNO：76[pAG2252]、SEQIDNO：77[pAG2253]、SEQIDNO：78[pAG2309]、SEQIDNO：79[pAG2310]、SEQIDNO：80[pAG2339]、SEQIDNO：81[pAG2342]、SEQIDNO：82[pAG2345]和SEQIDNO：83[pAG2349]的序列或它們的互補(bǔ)序列的核酸雜交。一種實(shí)施方式提供了上述任何分離的核酸的片段。所述片段可以是雜交探針或引物。所述探針或引物的長度不限。所述探針或引物可以是6，10，15，20，25，30，35，40，45或50個(gè)核苷酸長度，或者是前述任意兩長度之間的長度(包括端點(diǎn))。片段可以有小于全長的長度，和/或包括與引用的參考序列相比的堿基的替換或缺失。所述片段可以是所述引用的參考序列的變體。由片段編碼的肽的長度可以小于全長，和/或包括與引用的參考序列編碼的氨基酸序列相比的氨基酸的替換或缺失。長度小于全長的肽可以是由所述引用的參考序列編碼的氨基酸序列的變體。表達(dá)盒可以由已知方法通過基因重組產(chǎn)生。表達(dá)盒可以包括一系列特定的核酸元件，它使得植物細(xì)胞或植物組織中特定核酸被轉(zhuǎn)錄。所述表達(dá)盒可以包括編碼蛋白的多核苷酸序列。所述蛋白可以是CWD酶或經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD酶。CWD酶可以從包括木聚糖酶酶，纖維素內(nèi)切酶，外切葡聚糖酶，木糖苷酶，葡糖苷酶和阿魏酸酯酶的一系列CWD酶中選取。本文中，表達(dá)盒中的多核苷酸序列，分離的核酸，載體，或其他任何DNA構(gòu)建體，或在本文所述的方法中應(yīng)用的，都可以可操作地與一種或多種調(diào)控元件相連接。調(diào)控元件可以是啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子，它在植物大部分細(xì)胞，組織和器官的整個(gè)發(fā)育過程以及許多但并非所有的發(fā)育階段的發(fā)育過程中提供多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，僅當(dāng)其暴露在特定的化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境刺激時(shí)，才能啟動(dòng)所述多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子對于特定的發(fā)育階段、器官或組織可以是特定的。組織特異性啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)在特定的植物組織中的轉(zhuǎn)錄。由組織特異性啟動(dòng)子靶向的植物組織可以是但不限于莖，葉，毛狀體，花藥或種子。本文中，組成型啟動(dòng)子可以是大米泛素3啟動(dòng)子(OsUbi3P)或大米肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子。也可以使用其他已知的組成型啟動(dòng)子，包括但不限于花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子，夜香樹黃色葉卷曲病毒啟動(dòng)子(CMP)或截短型CMP(CMPS)，二磷酸核酮糖羧化酶小亞基啟動(dòng)子和玉米泛素啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子可以包括種子特異性啟動(dòng)子。種子特異性啟動(dòng)子可以是但不限于大米GluB4啟動(dòng)子或玉米蛋白啟動(dòng)子。提供的另一種調(diào)控元件可以是終止轉(zhuǎn)錄的終止序列。終止序列可以被包括在表達(dá)盒的轉(zhuǎn)錄單元的3'端。終止子可以來自不同的植物基因。終止子可以是一種來自根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens.)的胭脂氨酸合成酶或章魚堿合成酶基因的終止序列。本文中，整合有表達(dá)盒的載體也可以包括另外的基因元件，如多個(gè)克隆位點(diǎn)來促進(jìn)分子克隆和篩選標(biāo)記以方便選擇。包括在載體中的可篩選標(biāo)記可以是來自大腸桿菌(Escherichiacoli)的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)基因，該基因賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞利用甘露糖增殖的能力。包括在載體中的可篩選標(biāo)記可以包括但不限于能賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(npt)基因，能賦予潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)基因和能賦予草甘膦抗性的3-磷酸烯醇式丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate-3-phosphate)合成酶基因。在一種實(shí)施方式中，可以構(gòu)建包括編碼多種CWD酶的多核苷酸序列的載體。本文所述的載體還可以包括多核苷酸序列，其目的在于沉默植物中的一種或多種基因。表達(dá)載體可以導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞，組織，器官和/或生物體中。合適的宿主細(xì)胞可以是雙子葉(dicots)或單子葉(monocots)的植物。本文的其他實(shí)施方式可以通過補(bǔ)充實(shí)施方式來構(gòu)成，補(bǔ)充的實(shí)施方式有一種或多種來源于本文中一種或多種其他實(shí)施方式的元件，和/或使用來自本文中一種或多種其他實(shí)施方式的一種或多種元件替換來自一種實(shí)施方式的一種或多種元件。本文進(jìn)一步的實(shí)施方式可以通過參考權(quán)利要求1后的任何一條從屬權(quán)利要求和閱讀從任何一條或多條前述的權(quán)利要求中選出的權(quán)利要求來描述。實(shí)施例下面提供非限制性的實(shí)施例來說明具體的實(shí)施方式。全部實(shí)施方式都可以由來自下面的一種或多種實(shí)施例來補(bǔ)充一處或多處細(xì)節(jié)，和/或一種或多種來自一種實(shí)施方式的元件可被來自下面的一種或多種實(shí)施例中的一處或多處細(xì)節(jié)替換。實(shí)施例1-材料和方法載體本文中設(shè)計(jì)的載體是根據(jù)從日本煙草購買的過渡質(zhì)粒(intermediateplasmid)pSB11進(jìn)行的，并且已在2010.11.5提交的申請No.PCT/US10/55746、2010.11.5提交的申請No.PCT/US10/55669和2010.11.5提交的申請No.PCT/US10/55751的國際申請中做出了描述，這些文獻(xiàn)以全文援引的方式納入本文。簡單地說，所述用于克隆的質(zhì)粒pSB11與pSB1受體載體結(jié)合，所述pSB1受體載體是在利用pSB11和pSB1都存在的cos和ori位點(diǎn)通過同源重組的卸甲Ti質(zhì)粒(disarmedTiplasmid)。整合載體包括諸如virB，virC和virG的毒性基因，這些毒性基因用于T-DNA轉(zhuǎn)移并且可以用于植物轉(zhuǎn)化?；A(chǔ)轉(zhuǎn)化載體含有表達(dá)盒，所述表達(dá)盒含有在OsUbi3P啟動(dòng)子后續(xù)取代了CMPS啟動(dòng)子的控制下編碼PMI的人A基因。該基礎(chǔ)載體用來獲取以下列出的載體，這些載體用于植物轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁降解酶在植物中的表達(dá)：1.pAG2015(SEQIDNO：63)：OsUbi3P:P77853；2.pAG2048(SEQIDNO：64)：OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm，在水稻Ubi3啟動(dòng)子之間與液泡融合；3.pAG2049(SEQIDNO：65)：OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL；4.pAG2063(SEQIDNO：66)：OsUbi3P:BAASS:O43097:SEKDEL；5.pAG2069(SEQIDNO：67)：OsUbi3P:O68438；6.pAG2091(SEQIDNO：68)：OsUbi3P:BAASS：AnfaeA:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:P77853；7.pAG2092(SEQIDNO：69)：OsUbi3P:BAASS:AnfaeB:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:P77853；8.pAG2096(SEQIDNO：70)：OsUbi3P:BAASS:AnfaeA:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:AnfaeB:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:P77853；9.pAG2201(SEQIDNO：71)：OsUbi3P:ZmUBQm:P77853；10.pAG2229(SEQIDNO：72)：OsUbi3P:BAASS:P77853：T134-100-101:SEKDEL(經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶)；11.pAG2233(SEQIDNO：73)OsUbi3P:P77853:S158-30-108-35；12.pAG2234(SEQIDNO：74)OsUbi3P:BAASS:P77853:S158-30-108-35；13.pAG2242(SEQIDNO：75)：OsUbi3P:PR1aSP：NtEGm：SEKDEL+OsUbi3P:ZmUBQm:P77853；14.pAG2252(SEQIDNO：76)：OsUbi3P:O33897(內(nèi)切葡聚糖酶)；15.pAG2253(SEQIDNO：77)：OsUbi3P:BAASS:O33897；16.pAG2309(SEQIDNO：78)：OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm+OsUbi3P:P77853；17.pAG2310(SEQIDNO：79)：OsUbi3P:EU591743(木聚糖酶)；18.pAG2339(SEQIDNO：80)：OsUbi3P:O68438+OsUbi3P:BAASS:O33897+OsUbi3P:EU591743；19.pAG2342(SEQIDNO：81)：OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm：SEKDEL+OsUbi3P:P77853；20.pAG2345(SEQIDNO：82)：OsUbi3P:O68438+OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:O43097:SEKDEL；21.pAG2349(SEQIDNO：83)：ZmUbi1P:ZmKozak：xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01+OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:O43097:SEKDEL；22.pAG2042(SEQIDNO：84)：P54583(內(nèi)切葡聚糖酶EGB)轉(zhuǎn)基因玉米植物的生產(chǎn)玉米和柳枝稷轉(zhuǎn)化的方法在2010.11.5提交的申請的No.PCT/US10/55746，2010.11.5提交的申請No.PCT/US10/55669，2010.11.5提交的申請No.PCT/US10/55751的國際申請以及Gray等2011PlantBiotechJ9:1100中有所描述，在此以全文援引的方式納入本文。簡單地說，將含有合適轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌細(xì)胞LBA4404接種到野生型AxB玉米胚性愈傷組織中。未成熟的玉米胚的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化按照前面描述的方法進(jìn)行(NegrottoD等.2000PlantCellRep19：798；IshidaYetal.1996NatBiotech14：745)。酶基因的表達(dá)盒被克隆到pAG2004(SEQIDNO：85)載體的KpnI-EcoRI位點(diǎn)，以便生成過渡載體，使用之前報(bào)道的方法(IshidaY等.1996NatBiotech14：745；HieiYetal.1994PlantJ6：271；HieiY和KomariT2006PlantCellTissueOrganCult.85：27；KomariTetal.1996PlantJ10：165)，所述中間載體能夠與農(nóng)桿菌菌株LBA4404三親雜交的pSB1載體重組。玉米(玉米品種HiII，A188或B73)母株生長在28℃、16小時(shí)光照的溫室中。未成熟合子胚從玉米粒中分離出來，并用含有目的基因的農(nóng)桿菌溶液接種。接種后的未成熟胚在10-12周的組織培養(yǎng)過程中生長。對發(fā)育成具有葉和根的幼苗取樣進(jìn)行PCR分析來鑒定含有目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。用水清洗PCR陽性并且生根的植物，以洗掉瓊脂培養(yǎng)基，移植到土壤中并在溫室中生長，以產(chǎn)生種子和秸稈。本文中，特定的轉(zhuǎn)基因植物是指由酶所標(biāo)示(如：“P77853”、“P40942”、“O3O700”、“NtEGm”等)或轉(zhuǎn)基因?qū)φ?如：“TGC”等)，然后從以億計(jì)的質(zhì)粒中指定用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的質(zhì)粒(如：“2014”、“2015”、“2229”、“2092”等)。在上下文中，除i)酶或?qū)φ蘸蚷i)質(zhì)粒名稱外，偶爾插入的附加字符是清楚的。提及的質(zhì)粒以pAGXXXX命名。例如，在轉(zhuǎn)基因植物名稱中“2229”、“2252”、“2253”、“2092”、“2096”或“2042”的名字的意思是所述轉(zhuǎn)基因植物分別由“pAG2229”、“pAG2252”、“pAG2253”、“pAG2092”、“pAG2096”或“pAG2042”制備?？梢詤⒖技{入的用質(zhì)粒名稱標(biāo)記的序列來確定用于制備特定的轉(zhuǎn)基因植物的序列。對于轉(zhuǎn)基因柳枝稷植株的制備，柳枝稷(Panicumvirgatum、cv.)的種子用于胚性愈傷組織的啟動(dòng)，隨后使用含有pSB1質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404用于轉(zhuǎn)化。目的基因的存在使用基因特異性引物通過PCR來驗(yàn)證。以下表達(dá)一種或多種CWD酶的轉(zhuǎn)基因植物及對照植物用來于聯(lián)合預(yù)處理和水解。1.野生型玉米植株用作陰性對照(AxB；BxA)；2.使用空載體轉(zhuǎn)化的玉米植株，用作陰性對照(TGC.4000.12；TGC.4000.11；TGC.2004.8.02；TGC.2004.8.04；TGC.2243.01)；3.通過使用pAG2015轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynA.2015.05，表達(dá)木聚糖酶XynA(P77853)；4.通過使用pAG2015轉(zhuǎn)化制備的第二代轉(zhuǎn)基因玉米植株XynA.2015.5T1，表達(dá)木聚糖酶A(P77853)；5.通過使用pAG2063轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynB.2063.17，表達(dá)木聚糖酶XynB(O43097)；6.通過使用pAG2049轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株EGA.2049.02和EGA.2049.10，表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EGA(NtEG)；7.通過使用pAG2042轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株EGB.2042.03，表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EGB(P54583)；8.通過使用pAG2253轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株EGC.2253.4b，表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EGC(O33897)；9.通過使用pAG2242轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株EGA/XynA.2242.09，表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EGA(NtEG)和木聚糖酶XynA(P77853)；10.上面植株9的第二代轉(zhuǎn)基因玉米植株，命名為EGA/XynA.2242.09.16T1，表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EGA(NtEG)和木聚糖酶XynA(P77853)；11.通過使用pAG2092轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynA/AccB.2092.103，表達(dá)木聚糖酶XynA(P77853)HE來自黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶B；12.通過使用pAG2096轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynA/AccA/B.2096.01和XynA/AccA/B.2096.05，表達(dá)木聚糖酶XynA(P77853)，來自黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶A和來自黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶B；13.通過使用pAG2069轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株CBHA.2069.3.17,表達(dá)外切葡聚糖酶CBH(O68438)；14.通過使用pAG2015轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因柳枝稷植株XynA.pv2015.3c和XynA.pv2015.4c，表達(dá)木聚糖酶XynA(P77853)；15.通過使用pAG2229轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株iXynA.2229.110是，表達(dá)經(jīng)內(nèi)含肽修飾的XynA(P77853)；16.通過使用pAG2309轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynA/EGA.2309.54和XynA/EGA.2309.107，表達(dá)XynA(P77853)，內(nèi)切葡聚糖酶EGA(NtEGm)；17.通過使用pAG2342轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynA/EGA.2342.105，表達(dá)XynA(P77853)和EGA(NtEGm)；18.通過使用pAG2339轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynE/EGC/CBHA.2339.03，XynE/EGC/CBHA.2339.04和XynE/EGC/CBHA.2339.05，表達(dá)XynE(EU591743)、內(nèi)切葡聚糖酶EGC(O33897)和CBHA(O68438)；19.通過使用pAG2345轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynB/EGA/CBHA.2345.116，表達(dá)XynB(O43097)、內(nèi)切葡聚糖酶EGA(NtEGm)和CBHA(O68438)；20.通過使用pAG2349轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynB/EGA/CBHB.2349.55和XynB/EGA/CBHB.2349.56，表達(dá)XyanB(O43097)、內(nèi)切葡聚糖酶EGA(NtEG)、CBHB(BD22308)和ZmUbi1P:ZmKozak:xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01:NosT。植物秸稈收獲的溫室玉米秸稈在37℃條件下在空氣循環(huán)器中干燥1-2周。干燥后，手動(dòng)把秸稈切成1.0-1.5英寸的碎片，然后使用0.5mm篩的UDY粉碎機(jī)(Model014，UDY公司，F(xiàn)ortCollins，CO)磨碎。植物蛋白提取物的制備將壓碎的谷?；?0mg磨碎的秸稈分別重懸在蛋白提取緩沖液中，所述蛋白提取緩沖液包括100mM磷酸鈉(pH值6.5)，乙二胺四乙酸(EDTA；1mM)，聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)(0.1％，v/v)和苯甲基磺酰氟(PMSF；0.1mM)。將重懸的組織樣本充分混合，不溶性物質(zhì)通過離心沉淀。將含可溶性蛋白的上清液轉(zhuǎn)移至新管中?；瘜W(xué)物質(zhì)和酶糖標(biāo)準(zhǔn)品(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和纖維二糖)是從AcrosOrganics(MorrisPlains，NJ)購買的。本研究所用的其他化學(xué)物質(zhì)均從Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)購買。用于自制復(fù)合酶(inhousecocktail)的內(nèi)切葡聚糖酶(C8546)，β-糖苷酶(49291)和木聚糖內(nèi)切酶(X2753)都購自Sigma(St.Louis、MO)。所述外切纖維素酶(CBHI)(EC3.2.1.91)和β-木糖酶(EC32137)均從Megazyme(威克洛，愛爾蘭)購買。1500和XY均由杰能科國際(GenencorInternational)(Rochester，NY)惠贈(zèng)。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，菌株D5A是從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)(Manassas，VA)獲得的。秸稈酶測試從15mg于室溫下在500μl提取緩沖液(100mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5；NaOAc，pH，4.5或Tris，pH8.0；EDTA(10mM)和TritonX-100(0.1％)中孵育30min的秸稈中提取蛋白。通過離心分離秸稈。收集上層清液并轉(zhuǎn)移至新的微量離心管。在緩沖液中重浮50μl蛋白提取物用來進(jìn)行酶分析。通常，將含有Xylazyme的100mM的磷酸鈉溶液，pH6.5或含有Cellazyme的100mMNaOAc溶液，pH4.5，xylazymeAX或纖維素酶檢測底物藥片(cellazymetablets)的緩沖液適量加入到用于酶測試的每管中。在測試溫度下(通常約50-60℃，這取決于被測試酶)孵育進(jìn)行反應(yīng)，直至上清液有可見藍(lán)顏色出現(xiàn)。通過測定反應(yīng)產(chǎn)物在590納米下的吸光度來量化藍(lán)色染料的量。這些反應(yīng)的對照包括微生物提高的酶和野生型植物提取物。水解底物也可以通過使用AZCL綴合底物(Megazyme)替代xylazymeAX和纖維素酶檢測底物藥片的情況而定。使用AZCL綴合底物使得被測秸稈的體積和底物濃度最優(yōu)化。木聚糖酶活性的檢測50℃下在0.5ml反應(yīng)體系中使用XylazymeAX(Megazyme,Bray,Co.Wicklow,Ireland)作為底物進(jìn)行可溶性蛋白的測定，對于BSX使用HEPES緩沖液(100mM、pH8.0)，對于XynB使用磷酸鈉(100mM、pH6.5)緩沖液。將1ml2％(w/v)的Tris堿加入到反應(yīng)體系中以終止XylazymeAX反應(yīng)。通過離心來沉淀來自XylazymeAX反應(yīng)的不溶性材料，使用分光光度計(jì)在590nm下測定100μL反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度值，一式三份。對于BSX或XynB積累水平的量化，通過孵育已知量的純化的、使用含有XylazymeAX藥片的分析緩沖液稀釋的微生物提高的BSX或XynB，以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；與此同時(shí)，使用轉(zhuǎn)基因植物材料進(jìn)行XylazymeAX分析。下面表1說明了在轉(zhuǎn)基因植物中檢測的酶活性。如文中所述。檢測了幾種木聚糖酶，內(nèi)切葡聚糖酶，外切纖維酶和阿魏酸酯酶的酶活性。對于每一個(gè)轉(zhuǎn)基因事件，被測的酶活性同樣通過蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)分析加以驗(yàn)證?！癗/A”指的是沒有進(jìn)行的分析。表1生物質(zhì)碳水化合物成分分析在碳水化合物成分分析前，按照NREL標(biāo)準(zhǔn)(NREL/TP-510-42619)，使用玻璃的索氏提取系統(tǒng)(FisherScientific，Pittsburg，PA)，用90％(v/v)的乙醇對風(fēng)干磨碎的秸稈3.0g重復(fù)進(jìn)行回流來去除乙醇可提取的材料。含有提取物的乙醇使用帶有水浴的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行真空蒸發(fā)(HeidolphLR4000G5B，ILUSA)，水浴設(shè)為40℃。通過稱量長頸瓶中50℃烘干48小時(shí)后的固形物的重量來測量提取物的含量。無提取物的秸稈經(jīng)歷兩步酸水解(NREL/TP-510-42618)，首先在30℃下用1.5ml的72％(w/w)的硫酸(每0.16-0.18g風(fēng)干重)水解60分鐘，其次在121℃條件下補(bǔ)充42.0ml的水處理1小時(shí)。在酸水解后，添加氫氧化鈉和氫氧化鈣調(diào)整pH值在4.0和9.0之間，所有樣品均通過0.2μm的PVDF過濾器過濾(FisherScientific，Pittsburg，PA)以便用于高效液相色譜(HPLC)分析。溫和的預(yù)處理和糖化的聯(lián)合工藝為了評(píng)估植物表達(dá)的CWD酶對秸稈水解的影響，開發(fā)出聯(lián)合工藝，包括溫和的預(yù)處理后進(jìn)行不進(jìn)行生物質(zhì)/解毒作用的級(jí)間洗滌的酶水解。聯(lián)合工藝去除了任何洗滌/分離/解毒步驟，允許聯(lián)合預(yù)處理，以及同步糖化和發(fā)酵(SSF)過程。溫和預(yù)處理開發(fā)的高效的溫和預(yù)處理，可以達(dá)到一定的生物質(zhì)預(yù)處理效果，但不會(huì)使植物內(nèi)的水解酶失活。預(yù)處理的化學(xué)物質(zhì)是包括0.02M-0.18M亞硫酸氫銨和0.025M-0.20M碳酸銨的混合物，pH值在5.0和9.0之間，優(yōu)選是8.10左右。為了檢測植物秸稈水解作用，將20.0mg磨碎的玉米秸稈添加到2ml裝有預(yù)處理化學(xué)溶液的微量離心管中，液固比(L/S)為10或更低(優(yōu)選為3-6)。預(yù)處理在40℃-95℃，350rpm的搖床中培養(yǎng)0-16小時(shí)?；瘜W(xué)預(yù)處理后對磨碎和未磨碎的秸稈進(jìn)行機(jī)械精煉或去纖維化。另外，預(yù)處理材料還會(huì)經(jīng)歷沒有級(jí)間洗滌的酶水解。酶水解預(yù)處理的秸稈在有疊氮化鈉的伯瑞坦一羅比森(Britton-Robinson)緩沖液(40mM的磷酸鹽，40mM的醋酸鹽，40mM的硼酸鹽)中進(jìn)行酶水解。酶水解在50℃，pH4.9，2％(w/v)固含量的條件下，在NewBrunswick搖床(NewBrunswickScientific、NewJerseyUSA)中進(jìn)行，搖床以轉(zhuǎn)速250rpm旋轉(zhuǎn)不同時(shí)間(0-144小時(shí))。基于具有1ml反應(yīng)體積的10.0mg的秸稈，#1復(fù)合酶的用量為0.5μM的內(nèi)切葡聚糖酶，0.1μM的外切纖維素酶(CBHI)，0.05μM的β-糖苷酶和0.5μ木聚糖內(nèi)切酶。5#復(fù)合酶為添加有0.1μM的β-木糖酶的#1復(fù)合酶。同時(shí)，三種類型的酶水解并行進(jìn)行：無復(fù)合酶(NCt)、全復(fù)合酶(FCt)和缺乏在植物中表達(dá)的酶的復(fù)合酶(Ct-PE)，例如，根據(jù)在植物中表達(dá)的酶，缺乏木聚糖內(nèi)切酶(Ct-Xyn)或內(nèi)切葡聚糖酶(Ct-EG)或兩者(Ct-EG-Xyn)都缺乏的復(fù)合酶。1500用量為0.2ml/g干質(zhì)量，XY用量為0.1ml/g干質(zhì)量。葡萄糖和木糖產(chǎn)量(理論值％)表示為在每種底物中總葡萄糖和木糖的百分比。附圖中的誤差線是重復(fù)試驗(yàn)平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。同步糖化和發(fā)酵(SSF)培養(yǎng)液是通過在30℃和250rpm的條件下，在的YPD(10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨和20g/l葡萄糖)中使釀酒酵母菌株(Saccharomycescerevisiae)D5A生長到OD600值為0.5而制備的。細(xì)胞通過離心(3000g5分鐘)收集，并且重新懸浮在1XYP((10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨)中。SSF實(shí)驗(yàn)在250ml錐形玻璃燒瓶(有效容積為50ml)中重復(fù)兩次，所述錐形玻璃燒瓶中含有3.0-4.0克(干重)預(yù)處理的生物質(zhì)，Britton-Robinson緩沖液，10xYP(100g/l酵母提取物和200g/l蛋白胨)，接種物和水解酶。燒瓶由帶有氣塞的橡膠塞密封。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)添加酵母接種物和酶(10FPU/g干質(zhì)量的1500和0.1ml/g干質(zhì)量的XY)，并在35℃，120rpm條件下培養(yǎng)7天。在0、24、48、72、144和168小時(shí)后分別取出樣品，進(jìn)行乙醇和糖分析。發(fā)酵糖和乙醇的分析將水解的樣品在90℃下加熱20分鐘，之后進(jìn)行10000g的離心，隨后將上清液通過0.20μmPVDF過濾器(Cat.#：09-910-13、FisherScientific、Pittsburg、PA)進(jìn)行澄清。使用島津帶有LCsolutions軟件的LC-20AD二元液相泵(Shimadzu、Kyoto、Japan)通過高效液相色譜(HPLC)測定單糖和二糖的濃度。糖濃度使用AminexHPX-87P糖柱(Bio-RadLaboratories、Hercules、CA)測定，操作條件為80℃、0.6ml/min，使用脫氣水作為流動(dòng)相。發(fā)酵液中的乙醇濃度通過使用AminexHPX-87H柱(Bio-RadLaboratories、Hercules、CA)酸柱進(jìn)行分析，操作條件為60℃、0.6ml/min，0.004M硫酸作為流動(dòng)相。對通過RI檢測器(RID10AD)分析的所有樣品的峰面積進(jìn)行整合，將所得數(shù)值與定量標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。實(shí)施例2-植物秸稈碳水化合物組成分析對來自轉(zhuǎn)基因植物的秸稈，根據(jù)他們的結(jié)構(gòu)性碳水化合物組成和糖含量進(jìn)行表征，以檢測任何由基因修飾引起的顯著變化。表2顯示了隨機(jī)抽樣的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米和柳枝稷事件的結(jié)構(gòu)性碳水化合物分析的結(jié)果。來源于無論是表達(dá)一種還是多種CWD酶或缺乏編碼CWD酶的轉(zhuǎn)基因(轉(zhuǎn)基因?qū)φ誘GC)的一系列轉(zhuǎn)基因植物的葡聚糖和木聚糖的含量類似于野生對照植物(AxB)的。表2轉(zhuǎn)基因植物(表達(dá)CWD或TGC)的葡萄糖和木糖的含量與非轉(zhuǎn)基因野生型(AxB)植物比較。表2中數(shù)據(jù)的Student’st-檢驗(yàn)顯示，在表達(dá)CWD酶的轉(zhuǎn)基因玉米事件和野生型玉米AxB之間，或表達(dá)CWD酶的轉(zhuǎn)基因玉米事件和不表達(dá)CWD酶的轉(zhuǎn)基因?qū)φ帐录g，葡聚糖總量無顯著差異，P值分別為0.90和0.14。對木聚糖含量的t-檢驗(yàn)相應(yīng)的p值分別為0.57和0.36。因此，植物中酶的表達(dá)，不僅為生產(chǎn)廉價(jià)酶，還為生產(chǎn)用于可溶性糖生產(chǎn)的具有水解特征的生物質(zhì)原料提供了機(jī)會(huì)。實(shí)施例3-植物表達(dá)的CWD酶對生物質(zhì)水解的影響植物生物質(zhì)水解分析的方法學(xué)植物中表達(dá)CWD酶的一個(gè)目標(biāo)是消除或減少用于加工木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的化學(xué)預(yù)處理?xiàng)l件的嚴(yán)格性。為了評(píng)估植物表達(dá)的CWD酶對生物質(zhì)水解的影響，開發(fā)了伴隨溫和的化學(xué)預(yù)處理(pH值為5.0-9.0，55℃處理16小時(shí))后進(jìn)行沒有級(jí)間洗滌的酶水解(pH4.9，50℃水解72小時(shí))的聯(lián)合工藝，并選定為用于植物秸稈初始篩選的標(biāo)準(zhǔn)程序。在這個(gè)工藝中，使用自制混合酶(#1復(fù)合酶和#5復(fù)合酶)用來檢測。自制復(fù)合酶是單獨(dú)酶組分的結(jié)合，從而使得取決于在植物中表達(dá)的酶的特性的任何組分的遺漏成為可能。對于每種轉(zhuǎn)基因植物秸稈和野生型或轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锝斩?，以下酶水解處理并行運(yùn)行：無復(fù)合酶(NCt)，全復(fù)合酶(FCt)和缺乏在植物中表達(dá)的酶的復(fù)合酶(Ct-PE；例如缺乏木聚糖酶的復(fù)合酶(Ct-Xyn)，酶缺乏內(nèi)切葡聚糖酶的復(fù)合酶(Ct-EG)、或同時(shí)缺乏木聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶的復(fù)合酶(Ct-Xyn-EG))。為了檢測哪種酶或哪些酶支持好的水解作用，應(yīng)用了兩種標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)估在初始篩選中表達(dá)CWD酶的轉(zhuǎn)基因事件的加工特性。1.來自全復(fù)合酶(FCt)水解(圖2A–2B中的高度(1))的總糖產(chǎn)量。2.涉及全復(fù)合酶(FCt)和不含有在植物中表達(dá)的酶的復(fù)合酶(Ct-PE)水解之間糖產(chǎn)量的差異(圖2A–2B中的高度(2))。加工過程中生產(chǎn)的總糖(高度(1))是考慮的標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樗苯佑绊懙阶罱K產(chǎn)品的產(chǎn)量，生產(chǎn)力和運(yùn)營成本。在表達(dá)CWD酶的植物中，證明了表達(dá)酶的轉(zhuǎn)基因植物與相同處理?xiàng)l件下的對照植物相比，能更好的完成全部水解，這在圖2中的總葡萄糖和木糖產(chǎn)量中得到了證明。第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，在FCt和Ct-PE(高度(2))之間的糖產(chǎn)量的差異代表了植物表達(dá)的酶對水解的影響。當(dāng)使用這些轉(zhuǎn)基因植物作為生物質(zhì)原料時(shí)，觀察到在復(fù)合酶中的外源酶能夠部分或完全被在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的一種或多種CWD酶所取代，而達(dá)到相似或相同的水解效果，這表明了在FCt和Ct-PE水解之間(圖2B)的糖產(chǎn)量沒有區(qū)別或只有小差別。植物秸稈的水解評(píng)估使用以上認(rèn)定的兩個(gè)選擇標(biāo)準(zhǔn)，使用自制的復(fù)合酶對秸稈樣品進(jìn)行酶水解，以篩選不同的表達(dá)CWD酶的轉(zhuǎn)基因玉米植株的性能?；诤Y選的結(jié)果，鑒定出性能最好的轉(zhuǎn)基因植物事件，包括表達(dá)木聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物XynA.2015.05和XynB.2063.17；表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物EGA.2049.10和EGB.2042.03以及表達(dá)多種酶的轉(zhuǎn)基因植物-XynA/AccA/B.2096.01，XynA/AccB.2092.103，EGA/XynA.2242.09，XynB/EGA/CBHA.2345.116，XynB/EGA/CBHB.2349.55，XynB/EGA/CBHB.2349.56和XynB/EGA/CBHB.2349.229。圖2說明了對來自表達(dá)木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因植物(XynA；XynA.2015.05)和不表達(dá)CWD酶的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.4000.12(TGC.4000.12)的材料水解后葡萄糖(圖2A)和木糖(圖2B)的產(chǎn)量。轉(zhuǎn)基因事件XynA.2015.05和轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼蒄Ct(自制#5復(fù)合酶)、NCt和Ct-Xyn(缺乏木聚糖酶A的自制#5復(fù)合酶)酶水解后，糖產(chǎn)量數(shù)據(jù)使用上面選擇的標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)估。FCt處理(標(biāo)準(zhǔn)1)后顯示出的總葡萄糖產(chǎn)量值要高于對XynA.2015.05和TGC.4000.12兩者進(jìn)行FCt和Ct-Xyn處理(標(biāo)準(zhǔn)2)之間的葡萄糖產(chǎn)量的差值。所有處理的葡萄糖和木糖產(chǎn)量的總值，對于轉(zhuǎn)基因事件XynA.2015.05來說要高于對照植物TGC.4000.12。值得關(guān)注的是，使用全復(fù)合酶和不含有植物表達(dá)的木聚糖酶A的復(fù)合酶處理后的葡萄糖和木糖產(chǎn)量的差異非常小?；谶@些結(jié)果，植物中表達(dá)的木聚糖酶A在水解植物秸稈中與全復(fù)合酶提供的木聚糖酶A幾乎一樣有效。根據(jù)選擇標(biāo)準(zhǔn)1和2，圖2中顯示的轉(zhuǎn)基因事件XynA.2015.05被認(rèn)為水解作用較好。表達(dá)木聚糖酶的植物木聚糖是已知的在硬木，農(nóng)業(yè)廢棄物、生物質(zhì)和多年生牧草中占優(yōu)勢的半纖維素。木聚糖是雜聚生物聚合物，由重復(fù)的β-1,4連接的含有支鏈基團(tuán)的木糖骨架組成，并且可以通過芳香族酯類(DoddD和CannIO2009GlobChangeBiolBioenergy1：2)交聯(lián)到木質(zhì)素上。木聚糖的破壞和去除有益于纖維素水解轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖。在典型的水解復(fù)合酶中，木聚糖酶是一類主要的用來水解半纖維素聚合物的CWD酶，因?yàn)樗麄冊谑估w維素更易被酶水解中起著非常重要的作用。參見圖3B，圖5B-5D以及圖7B，表達(dá)XynA或XynB的轉(zhuǎn)基因植物(XynB.2063.17、XynA/Acc/A/B.2096.01和XynA.2015.05T1)證明了來自Ct-Xyn水解的木聚糖的轉(zhuǎn)化要比對照植物高29.80-172.1％，說明了植物中表達(dá)的木聚糖酶對生物質(zhì)木聚糖水解有增強(qiáng)效應(yīng)。同樣，這些轉(zhuǎn)基因植物也顯示來自Ct-Xyn水解的葡聚糖轉(zhuǎn)換要比對照植物高50.1-93.5％。圖3A-3B說明經(jīng)自制的#1復(fù)合酶(FCt)、缺乏木聚糖酶B的#1復(fù)合酶(Ct-Xyn)和無酶(NCt)水解后，來自預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶B的轉(zhuǎn)基因植物(XynB.2063.17)組織和野生型對照(AxB)的葡萄糖(圖3A)和木糖(圖3B)的產(chǎn)量。結(jié)果證明經(jīng)過Ct-Xyn處理，來自轉(zhuǎn)基因事件XynB.2063.17的葡萄糖產(chǎn)量和木糖產(chǎn)量分別比來自對照植物AxB的高63.2％和109.4％。從FCt和Ct-Xyn處理(標(biāo)準(zhǔn)2)之間的木糖產(chǎn)量值的細(xì)小差別可以看出，事件XynB.2063.17顯示了明顯改善的木聚糖水解效果。這些結(jié)果表明，和全酶混合物提供的酶比較，植物中表達(dá)的木聚糖酶B在水解秸稈中有驚人的良好性能。表達(dá)纖維素的植物木質(zhì)纖維素生物質(zhì)被認(rèn)為是由含多種交織的生物聚合物(纖維素、半纖維素、木質(zhì)素及可提取物)的基質(zhì)構(gòu)成，這就需要幾種不同類型的大量的酶來有效釋放可發(fā)酵糖。其中，纖維素酶是關(guān)鍵酶。三種類型的纖維素酶：內(nèi)切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶共同起作用，使纖維素水解成葡萄糖。在水解過程中，內(nèi)切葡聚糖酶破壞纖維素鏈之間的交聯(lián)，而外切葡聚糖酶水解單個(gè)葡聚糖鏈，β-葡糖苷酶分解外切葡聚糖產(chǎn)物以形成葡萄糖單體(SticklenMB2008NatureReviewsGenetics9:433)。圖4A–4B顯示了表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物的水解結(jié)果。這些圖說明了從表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶(EGA)的轉(zhuǎn)基因事件EGA.2049.02和EGA.2049.10以及缺乏這種酶的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.4000.12(圖4A)產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量。這些圖也說明了從表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶B(EGB)的轉(zhuǎn)基因事件EGB.2042.03和轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.2004.8.02(圖4B)產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量。采用#1全復(fù)合酶(FCt)，缺乏內(nèi)切葡聚糖酶(Ct-EG)的復(fù)合酶和無酶(NCt)進(jìn)行水解處理。對于表達(dá)EGA的玉米事件，EGA.2049.02和EGA.2049.10達(dá)到了高于轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?TGC.4000.12)(圖4A)48.9-126.9％的葡聚糖轉(zhuǎn)化。對于EGA.2049.10來說，Ct-EG和FCt水解之間的葡萄糖產(chǎn)量的差別是可以忽略的，比TGC.4000.12低大約29.1％?；跇?biāo)準(zhǔn)2，對轉(zhuǎn)基因事件EGA.2049.02作了類似的觀察。根據(jù)圖4B，表達(dá)EGB的轉(zhuǎn)基因植物EGB.2042.0經(jīng)Ct-EG水解作用轉(zhuǎn)化的葡聚糖要比轉(zhuǎn)基因?qū)φ誘GC.2004.8.02高63.6％。出乎意料的是，EGB.2042.03經(jīng)Ct-EG水解作用產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量只比經(jīng)FCt水解作用的低12.2％，相比而言，作相應(yīng)處理的TGC.2004.8.02要低23.0％。這些數(shù)據(jù)顯示表達(dá)EGB的植物的水解作用比對照植物大約好50.0％。表達(dá)多種酶的植物為了開發(fā)高效和廉價(jià)的用于快速和廉價(jià)地對生物質(zhì)進(jìn)行解聚的酶生產(chǎn)系統(tǒng)，在玉米中表達(dá)了在水解復(fù)合酶中使用的幾種酶。圖5A–5D和圖6A–6B顯示了表達(dá)多種酶的轉(zhuǎn)基因植物XynA/AccA/B.2096.05、XynA/AccA/B.2096.01、EGA/XynA.2242.09、XynB/EGA/CBHB.2349.56、XynB/EGA/CBHB.2349.55和XynB/EGA/CBHA.2345.116的水解作用的結(jié)果。圖5A-5B說明了經(jīng)#1全復(fù)合酶(FCt)、缺乏木聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-Xyn)和不經(jīng)復(fù)合酶(NCt)處理后，預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶A(XynA)和輔酶的(Acc)的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynA/AccA/B.2096.01、XynA/AccA/B.2096.05以及轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.2004.8.02的酶水解的數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)基因事件XynA/AccA/B.2096.01，XynA/AccA/B.2096.05的Ct-Xyn水解作用產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量(圖5A)分別比對照植物TGC.2004.8.02的高80.4％和93.5％。根據(jù)圖5C，EGA/XynA.2242.09經(jīng)Ct-Xyn-E水解作用產(chǎn)糖量出奇的高可以用協(xié)同水解效應(yīng)來解釋。同樣的，基于XynA/AccA/B.2096.01、XynA/AccA/B.2096.05的轉(zhuǎn)基因組織的CT-Xyn水解作用產(chǎn)出的木糖產(chǎn)量的木聚糖轉(zhuǎn)化效率(圖5B)分別比對照植物TGC.2004.8.02的高143.4％和172.1％。觀察到的這些轉(zhuǎn)基因事件的木聚糖高效轉(zhuǎn)化率也可以歸因于多種酶的協(xié)同效應(yīng)。圖5說明了使用#1全復(fù)合酶(FCt)、缺乏木聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-Xyn)、缺乏內(nèi)切葡聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-EG)和缺乏木聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-Xyn-EG)進(jìn)行酶處理后，從轉(zhuǎn)基因玉米事件EGA/XynA.2242.09中產(chǎn)出的葡萄糖(圖5C)和木糖(圖5D)的產(chǎn)量，所述轉(zhuǎn)基因玉米事件同時(shí)表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶A(EGA)和木聚糖酶A(XynA)。在植物中表達(dá)XynA導(dǎo)致了水解作用后EGA/XynA.2242.09的葡萄糖和木聚糖產(chǎn)量的增加。例如，Ct-Xyn處理的轉(zhuǎn)基因事件顯示出高于對照植物50.1％的葡聚糖轉(zhuǎn)化效率(圖5C)和29.8％的木聚糖轉(zhuǎn)化效率(圖5D)。植物表達(dá)EGA導(dǎo)致了提高的葡聚糖水解效率，由此證明，在FCt、Ct-EG和Ct-Xyn-EG處理之間，葡萄糖產(chǎn)量的差異。圖6A–6B說明了從1)同時(shí)表達(dá)三種CWD酶的轉(zhuǎn)基因事件(XynB/EGA/CBHB.2349.56和XynB/EGA/CBHB.2349.55，同時(shí)表達(dá)木聚糖酶B、內(nèi)切葡聚糖酶A(EGA)、外切纖維素酶B；XynB/EGA/CBHA.2345.116，同時(shí)表達(dá)木聚糖B，內(nèi)切葡聚糖酶A和外切纖維素酶A)；2)野生型對照植物AxB中產(chǎn)出的葡萄糖(圖6A)和木糖(圖6B)的產(chǎn)量，顯示了全復(fù)合酶(FCt)和無復(fù)合酶(NCt)的處理結(jié)果。預(yù)處理包括0.17M的亞硫酸氫銨和碳酸銨(BSC)，液固比為10，55℃處理17小時(shí)。秸稈的酶水解在50℃，pH5.0，使用每克秸稈0.2/0.1ml的1500/XY進(jìn)行三天。根據(jù)圖6，結(jié)果顯示從表達(dá)三種CWD酶的轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)出的葡萄糖和木糖的產(chǎn)量要比野生型對照植物的高很多。出乎意料的是，非常溫和的化學(xué)預(yù)處理后，最佳實(shí)施事件XynB/EGA/CBHB.2345.56顯示出的葡萄糖和木糖的產(chǎn)量比陰性對照植物的高出43.6％和117.6％。表達(dá)CWD酶的第二代植物第一代(T0)XynA.2015.05植物被確認(rèn)為是好的水解候選植物。為了進(jìn)一步評(píng)估這個(gè)事件和相應(yīng)的酶(XynA)的構(gòu)造，種植來自這個(gè)事件的種子以便生成第二代T1后代。在圖7B中顯示了評(píng)價(jià)XynA.2015.05植物的T0和T1的水解結(jié)果。用于評(píng)估T0植物的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)同樣適用于評(píng)估T1植物產(chǎn)生的水解效率，并證明這種酶能夠跨物種有效。圖7B顯示出從使用pAG2015制備的柳枝稷的中產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量(圖7A)和從表達(dá)木聚糖酶A的T0轉(zhuǎn)基因事件XynA.2015.05T0、表達(dá)木聚糖酶A的T1轉(zhuǎn)基因事件XynA.2015.05T1和缺乏酶TGC.4000.11的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参镏挟a(chǎn)出的木糖產(chǎn)量(圖7B)。水解通過全復(fù)合酶(FCt)，缺乏木聚糖酶的復(fù)合酶(Ct-Xyn)和非酶混合物的處理完成。對于Ct-Xyn處理，以葡萄糖和木糖產(chǎn)量判斷，第一代轉(zhuǎn)基因事件XynA.2015.05T1顯示和第一代事件XynA.2015.05T0相似，但與對照植物TGC.4000.12的糖產(chǎn)量相比高出55.3％的葡聚糖和101.6％的木聚糖。這些數(shù)據(jù)表明，在植物中表達(dá)的酶是可遺傳的，并能夠在轉(zhuǎn)基因植物的后代中保持活性。植物物種的多樣性除了轉(zhuǎn)基因玉米事件，通過轉(zhuǎn)化載體pAG2015獲得了表達(dá)木聚糖酶A的柳枝稷植物。當(dāng)來自好的玉米水解實(shí)施者XynA.2015.05的木聚糖酶A在通過相同的構(gòu)建體(pAG2015)轉(zhuǎn)化的柳枝稷中表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因柳枝稷XynA.pv2015.3c也顯示了與對照柳枝稷Alamo相比更好的葡聚糖和木糖轉(zhuǎn)化。圖8說明了經(jīng)全復(fù)合酶(FCt)、缺乏木聚糖酶的復(fù)合酶(Ct-Xyn)和無酶(NCT)的處理后，從水解的預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因柳枝稷事件XynA.pv2015.3，XynA.pv2015.4c和野生型對照柳枝稷植物(Alamo)中產(chǎn)出的葡萄糖(圖8A)和木糖(圖8B)的產(chǎn)量。兩個(gè)轉(zhuǎn)基因事件XynA.pv2015.3c和XynA.pv2015.4c比對照柳枝稷(Alamo)表現(xiàn)出更好的水解。表現(xiàn)最好的事件XynA.pv2015.3c顯示高出對照植物30.0％的葡聚糖轉(zhuǎn)換率和50.0％的木聚糖轉(zhuǎn)換率。這些數(shù)據(jù)表明，相同的水解特性在表達(dá)酶的植物中可能是跨物種保守的。表達(dá)經(jīng)內(nèi)含肽修飾的酶的植物為了避免CWD酶的積累對植物生長的有害影響，研發(fā)了經(jīng)內(nèi)含肽修飾的酶，并在植物中表達(dá)以達(dá)到令人滿意的水解效果而不引起植物的表型異常。圖9展示了經(jīng)過FCt、Ct-Xyn和NCt處理后，從經(jīng)過水解的預(yù)處理的表達(dá)經(jīng)內(nèi)含肽修飾的XynA的轉(zhuǎn)基因植物iXynA.2229.110和野生型對照植物AxB產(chǎn)出的葡萄糖(圖9A)和木糖(圖9B)的產(chǎn)量。預(yù)處理溫度比誘發(fā)在iXynA.2229.110中剪接內(nèi)含肽的50℃高。通過Ct-Xyn水解的iXynA.2229.110顯示出與對照植物AxB相比高出66.0％的葡聚糖轉(zhuǎn)換率和57.3％的木聚糖轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)基因植物iXynA.2229.110都是正常的。從碳水化合物組成分析得到的數(shù)據(jù)顯示在表達(dá)一種或多種水解酶的轉(zhuǎn)基因植物和對照植物產(chǎn)出的葡聚糖和木聚糖的總量之間無顯著差異。水解結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下經(jīng)過酶水解，表達(dá)CWD酶的轉(zhuǎn)基因植物實(shí)現(xiàn)了與對照植物相比高出141％的葡萄糖產(chǎn)量和172％的木糖產(chǎn)量。實(shí)施例4-水解作用的時(shí)間進(jìn)程為了更好的評(píng)估植物表達(dá)的酶對水解作用的影響。對候選轉(zhuǎn)基因植物的水解進(jìn)行了時(shí)間進(jìn)程的評(píng)估。圖10比較了轉(zhuǎn)基因植物XynB2063.17，XynA.2015.05T1和對照植物TGC.2004.8.02的全復(fù)合酶(FCt)水解的時(shí)間進(jìn)程。水解動(dòng)力學(xué)遵循典型的分布圖：迅速開始水解，緊隨其后的是緩慢上升階段，以及最后達(dá)到平衡。24小時(shí)后水解減慢，48小時(shí)后達(dá)到平衡。貫穿整個(gè)時(shí)間進(jìn)程，植物中表達(dá)木聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物與對照植物相比顯示始終更好的水解，很明顯在為期3天的水解過程中葡萄糖產(chǎn)量高出了30.0-40.0％。在植物中表達(dá)的木聚糖酶可以看作是改善生物質(zhì)半纖維素和纖維素水解的酶預(yù)處理。圖11說明了使用FCt和Ct-EG處理的表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶A(EGA)的轉(zhuǎn)基因植物EGA.2049.10與轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.4000.11相比酶水解的時(shí)間進(jìn)程。植物內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)對水解作用的影響顯示了這些植物在Ct-EG水解的時(shí)間進(jìn)程中葡萄糖產(chǎn)量的差別。在整個(gè)時(shí)間進(jìn)程中，經(jīng)Ct-EG水解后，表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶的植物EGA.2049.10與對照植物TGC.4000.11相比顯示，葡聚糖轉(zhuǎn)化率始終高出48.9％和63.6％。出乎意料是，已經(jīng)從具有內(nèi)切葡聚糖酶表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物中，實(shí)現(xiàn)了更有效和更快速的水解作用。圖12說明了表達(dá)EGA和XynA的轉(zhuǎn)基因事件EGA/XynA.2242.09和轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.4000.11的酶水解的時(shí)間進(jìn)程。說明了用FCt、Ct-EG和Ct-Xyn處理的轉(zhuǎn)基因事件EGA/XynA.2242.09的葡萄糖產(chǎn)量(圖12A)和木糖產(chǎn)量(圖12B)始終要高于對照植物TGC.4000.11的。這些數(shù)據(jù)表明，這些高的糖產(chǎn)量是由于植物中內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的同時(shí)表達(dá)。圖13說明了經(jīng)過FCt和Ct-Xyn處理的表達(dá)XynA和輔酶(黑曲霉FAEB)的轉(zhuǎn)基因植物XynA/AccB.2092.103和轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锏拿杆獾臅r(shí)間進(jìn)程。在整個(gè)時(shí)間進(jìn)程中，預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因植物XynA/AccB.2092.103的秸稈的Ct-Xyn水解達(dá)到了高于轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?0％以上的葡聚糖轉(zhuǎn)化率(圖13A)和24％以上的的木聚糖轉(zhuǎn)化率(圖13B)。根據(jù)圖12和圖13，觀察到表達(dá)多種酶的轉(zhuǎn)基因植物的更好的水解作用，這種作用在對XynA/AccB.2092.103和EGA/XynA.2242.09進(jìn)行水解的整個(gè)進(jìn)程中的葡萄糖和木糖的產(chǎn)量中得以體現(xiàn)。更好的水解作用可以通過多種酶作用的協(xié)同效應(yīng)來解釋。根據(jù)圖10，11，12A和13A，結(jié)果顯示出除通過在植物中表達(dá)CWD酶取得了較高的水解率外，表達(dá)CWD酶的轉(zhuǎn)基因事件在水解的時(shí)間進(jìn)程中的動(dòng)力學(xué)圖譜與對照植物相比，葡萄糖產(chǎn)量變化表現(xiàn)出較高的起始斜率，表明更快的初始水解。根據(jù)圖10，除了更好的水解作用，表達(dá)水解酶的轉(zhuǎn)基因植物與對照植物相比也表現(xiàn)出更快的初始水解(圖10)。當(dāng)在植物中表達(dá)后，水解酶在植物細(xì)胞內(nèi)積累。處理過程中，他們可以在原位立即開始起作用而不需要長距離運(yùn)輸和擴(kuò)散。因此預(yù)計(jì)這些酶的效率會(huì)高，由于來自物質(zhì)轉(zhuǎn)移的較低阻力和預(yù)期的植物中的酶與木質(zhì)素或其他非靶向分子的非選擇性結(jié)合的降低。在植物中，植物生物質(zhì)降解酶的過量表達(dá)不顯示導(dǎo)致纖維素的減少，而是使木聚糖酶插嵌變松散，然后進(jìn)行不可逆的細(xì)胞壁修飾。所有這些因素均可能有助于植物表達(dá)的酶更快的水解。實(shí)施例5-通過提高預(yù)處理溫度提高水解使用用于預(yù)處理的預(yù)處理化學(xué)物質(zhì)、相對高的溫度通常對水解產(chǎn)生更佳的預(yù)處理影響。為了檢測預(yù)處理溫度的影響，將鑒定的最高水解執(zhí)行者進(jìn)行65℃和75℃的預(yù)處理。這些植物的葡萄糖水解產(chǎn)量顯示在圖14中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些包括內(nèi)切葡聚糖酶A(O77044)的CWD酶在植物中表達(dá)的時(shí)候其熱穩(wěn)定性可以提高。高耐熱性的酶(如12內(nèi)切葡聚糖酶C(O33897)家族)在植物中表達(dá)后其熱穩(wěn)定性可以得到進(jìn)一步提高，提供了在處理過程中使用提高的預(yù)處理溫度的機(jī)會(huì)來達(dá)到改善水解的目的。圖14說明了預(yù)處理溫度對來自高性能轉(zhuǎn)基因事件XynB.2063(表達(dá)木聚糖酶B)、XynA.2015.05T1(表達(dá)木聚糖酶A)、EGA.2049.10(表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶A)、XynA/AccB.2092.103(表達(dá)木聚糖酶A和輔酶B)、XynA/EGA.2242.09(表達(dá)木聚糖酶A和內(nèi)切葡聚糖酶A)和iXynA.2229.110(表達(dá)經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶A)以及對比的野生型對照植物AxB以及缺乏酶的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.4000.11.的葡萄糖產(chǎn)量的影響。植物的水解作用在65℃或75℃條件下使用FCt來完成。這說明從65℃至75℃增加預(yù)處理的溫度，對于對照植物AxB和TGC.4000.11來說提高了葡萄糖的產(chǎn)量，而對于表達(dá)酶的轉(zhuǎn)基因植物則不然。這一事實(shí)可以解釋為植物表達(dá)的酶對可利用的生物質(zhì)底物的飽和作用。使用65℃的預(yù)處理溫度，所有表達(dá)酶的轉(zhuǎn)基因植物與野生型對照植物AxB和轉(zhuǎn)基因?qū)φ誘GC.4000.11相比，顯示了高出11.0-33.4％的水解效率，達(dá)到了理論葡萄糖產(chǎn)量的80-84％。圖15說明了表達(dá)高耐熱性的內(nèi)切葡聚糖酶A(EGC)的轉(zhuǎn)基因柳枝稷植株EGC.2253.4b經(jīng)過65℃、75℃和95℃的溫度進(jìn)行酶水解的預(yù)處理后葡萄糖的產(chǎn)量。如圖所示，轉(zhuǎn)基因事件EGC.2253.4b的葡萄糖產(chǎn)量始終高于對照植物Alamo的，在95℃預(yù)處理時(shí)分別達(dá)到89.4％和71.4％的轉(zhuǎn)化率。圖16A–16B說明了經(jīng)過酶水解處理的預(yù)處理溫度和時(shí)間對轉(zhuǎn)基因事件XynA/EGA.2342.05和缺乏酶的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.2243.01的葡萄糖(圖16A)和木糖(圖16B)的產(chǎn)量的影響。通過使用0.175M的亞硫酸氫銨和碳酸銨，在pH值為8.1，溫度為55℃、60℃和75℃，每個(gè)溫度處理2、4、6和16小時(shí)，3000rpm轉(zhuǎn)速的條件下進(jìn)行預(yù)處理。酶水解用0.2ml的1500/g預(yù)處理的秸稈和0.1ml的XY/g預(yù)處理的秸稈，在固含量2％、pH為5.0、1xBritton-Robinson緩沖液(BR；終pH4.9)、0.02％疊氮化鈉、50℃和250rpm轉(zhuǎn)速的條件下處理72小時(shí)。如圖所示，在所有預(yù)處理溫度和處理的時(shí)間中，表達(dá)木聚糖酶A和內(nèi)切葡聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因事件XynA/EGA.2342.105始終比對照植物TGC.2243.01表現(xiàn)要好。這些數(shù)據(jù)還表明了延長預(yù)處理時(shí)間會(huì)使來自植物的葡萄糖和木糖的產(chǎn)量幾乎呈線性增加，而且處理16小時(shí)會(huì)明顯改善轉(zhuǎn)基因和對照植物的水解作用。17A–17B說明了預(yù)處理溫度對從轉(zhuǎn)基因事件XynA/EGA.2242.09.01和XynA/EGA.2242.09.07(表達(dá)木聚糖酶A和內(nèi)切葡聚糖酶A)以及野生型對照植物AxB和轉(zhuǎn)基因TGC.4000.11中產(chǎn)出的葡萄糖(圖17A)和木糖(圖17B)產(chǎn)量的影響。使用全Accellerase復(fù)合酶在55℃至65℃以及75℃下對植物進(jìn)行酶水解。酶量包括每克預(yù)處理的秸稈0.2ml的1500以及每克預(yù)處理的秸稈0.1ml的XY。表達(dá)CWD酶的轉(zhuǎn)基因植物達(dá)到了高達(dá)83.5-89.1％的葡萄糖產(chǎn)量和50.0-64.3％木糖產(chǎn)量，而對照植物僅達(dá)到了63.0-76.6％的葡萄糖產(chǎn)量和35.7-45.3％的木糖產(chǎn)量。當(dāng)預(yù)處理溫度提高到65℃時(shí)會(huì)達(dá)到顯著性的水解作用。對于某些玉米秸稈來說，將溫度提高到75℃會(huì)改善對照植物而不是表達(dá)酶的轉(zhuǎn)基因植物的水解作用。根據(jù)圖15，對于表達(dá)高耐熱性的內(nèi)切葡聚糖酶C(EGC)的轉(zhuǎn)基因柳枝稷，出奇地發(fā)現(xiàn)使用提高的預(yù)處理溫度能夠改善水解作用，尤其在95℃時(shí)顯著高于對照植物Alamo?？偟膩碚f，從高性能的轉(zhuǎn)基因植物得到的預(yù)處理的秸稈，在提高的溫度(65℃和75℃)下獲得了超過80％的葡萄糖水解率，與不表達(dá)異源性水解酶的對照植物相比高出25％的水解率。因此，植物中高耐熱性的水解酶的表達(dá)將為實(shí)現(xiàn)目標(biāo)組分的水解提供更多的機(jī)會(huì)。實(shí)施例6-減少酶用量和發(fā)酵能力因?yàn)楸磉_(dá)CWD酶的轉(zhuǎn)基因植物證明了，在相似水解條件下與對照植物相比有更高的水解產(chǎn)量和更快的動(dòng)力學(xué)，所以對減少外源酶用量進(jìn)行了測試。圖18說明了經(jīng)過使用不同用量的自制的#1復(fù)合酶，比如全復(fù)合酶(FCt)、75％的復(fù)合酶(0.75FCt)、50％的復(fù)合酶(0.50FCt)、25％的復(fù)合酶(0.25FCt)、10％的復(fù)合酶(0.10FCt)以及無酶(0FCt)的水解處理后，來自表達(dá)木聚糖酶B的轉(zhuǎn)基因植物XynB.2063.17、表達(dá)木聚糖酶A的XynA.2015.5T1和對照植物TGC.2004.8.4的葡萄糖產(chǎn)量。這些數(shù)據(jù)證明通過表達(dá)CWD酶的轉(zhuǎn)基因材料的應(yīng)用，在不降低糖產(chǎn)量的情況下，減少外源酶的用量的可行性。例如，使用0.75FCt的用量，轉(zhuǎn)基因事件XynA.2015.15T1取得了高于60％的葡聚糖轉(zhuǎn)換，這類似于使用FCt用量的大約65％的葡聚糖轉(zhuǎn)換。相比之下，使用FCt的用量，轉(zhuǎn)基因?qū)φ誘GC.2004.8.4能達(dá)到大約50.0％的葡聚糖轉(zhuǎn)換，使用0.75FCt的用量大約有40％的葡聚糖轉(zhuǎn)換。這些數(shù)據(jù)表明，表達(dá)CWD酶的植物的水解作用比對照植物的更有效，外源酶用量更少。圖19說明了經(jīng)過使用全復(fù)合酶(FCt)、20％的全復(fù)合酶(0.2FCt)以及無酶(NCt)的水解處理后，從轉(zhuǎn)基因植物XynE/EGC/CBHA.2339.03、XynE/EGC/CBHA.2339.04和XynE/EGC/CBHA.2339.05(表達(dá)木聚糖酶E，內(nèi)切葡聚糖酶C和外切纖維素酶A)和野生型對照型植物BxA中產(chǎn)出葡萄糖的產(chǎn)量。這些數(shù)據(jù)顯示50％-70％的葡萄糖產(chǎn)量可以從僅使用全復(fù)合酶用量20％的轉(zhuǎn)基因植物XynE/EGC/CBHA.2339.03，XynE/EGC/CBHA.2339.04和XynE/EGC/CBHA.2339.05中獲得，這比對照植物的高出35-77％。值得關(guān)注的是，僅用20％用量的全復(fù)合酶進(jìn)行水解后，轉(zhuǎn)基因事件XynE/EGC/CBHA.2339.03產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量仍然比使用全復(fù)合酶水解處理的對照植物BxA產(chǎn)出的的葡萄糖產(chǎn)量高出15％。圖20A-20B顯示了使用全復(fù)合酶(FCt)、20％的全復(fù)合酶(0.2FCt)和無酶(NCt)水解后，外源酶用量的減少對轉(zhuǎn)基因事件XynA/EGA.2309.54和XynA/EGA.2309.107(表達(dá)木聚糖酶A和內(nèi)切葡聚糖酶A)以及對照植物BxA的葡萄糖產(chǎn)量的影響。通過使用20％用量的全復(fù)合酶，從表達(dá)酶的轉(zhuǎn)基因植物中獲得了60％-70％的葡萄糖產(chǎn)量，與此相比，使用全復(fù)合酶獲得了80％的葡萄糖產(chǎn)量。比較起來，在0.2FCt的處理中，陰性對照僅產(chǎn)生了53％的葡萄糖，F(xiàn)Ct處理中產(chǎn)生了70％的葡萄糖。參見圖20B，在0.2FCt的處理中，從表達(dá)CWD酶的轉(zhuǎn)基因植物中獲得了約38％的木糖產(chǎn)量，與此相比，F(xiàn)Ct處理中獲得了約47％的木糖產(chǎn)量，對陰性對照植物來說，在FCt和0.2FCt的處理中，木糖的產(chǎn)量均低的多。XynA/EGA.2309.54和XynA/EGA.2309.107的20％FCt的葡萄糖產(chǎn)量能夠比陰性對照的高出16-29.3％，木糖高出27.6-31％。圖21A-21B說明了經(jīng)過使用無酶(0)、20％全復(fù)合酶(0.2FCt)、40％全復(fù)合酶(0.4FCt)、60％全復(fù)合酶(0.6FCt)、80％全復(fù)合酶(0.8FCt)和全復(fù)合酶(1500/XY)水解處理后，外源酶量的減少對從轉(zhuǎn)基因植物EGA/XynA.2242.09.16(表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶CBHA.2069.1.3)和轉(zhuǎn)基因?qū)φ誘GC.4000.11產(chǎn)出的葡萄糖(圖21A)和木糖(圖21B)的影響。在液固比為7，75℃條件下，用0.25M亞硫酸氫銨和碳酸銨(pH8.56)進(jìn)行預(yù)處理20小時(shí)。通過使用大約2％的固含量，在pH為5，50℃的條件下，進(jìn)行酶水解3天。出乎意料的是，數(shù)據(jù)表明，對于兩種表達(dá)酶的轉(zhuǎn)基因植物，60％FCt的水解可以達(dá)到80％的葡萄糖理論產(chǎn)量和大約60％的木糖理論產(chǎn)量，而對于陰性對照TGC.4000.11僅分別是60％和49％。這些結(jié)果說明了減少外源酶用量的可能性，并且同時(shí)通過利用表達(dá)CWD酶的轉(zhuǎn)基因植物實(shí)現(xiàn)了植物秸稈的有效水解。為了評(píng)估從表達(dá)CWD酶的轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)出來的水解產(chǎn)物的發(fā)酵性能，使用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)D5A進(jìn)行了同步糖化和發(fā)酵(SSF)實(shí)驗(yàn)。圖22顯示了在生物質(zhì)固含量為6％的條件下，對轉(zhuǎn)基因植物EGA.2049.10(表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶A)和EGA/XynA.2242.09(表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶A和木聚糖酶A)以及對照植物AxB和TGC.4000.11進(jìn)行的SSF過程中產(chǎn)出的乙醇的產(chǎn)量。這些數(shù)據(jù)顯示通過使用表達(dá)CWD酶的轉(zhuǎn)基因植物獲得了高出對照植物大約77.8％的纖維素轉(zhuǎn)化率。另外，對生物質(zhì)進(jìn)行溫和地預(yù)處理，表達(dá)酶的植物EGA.2049.10和EGA/XynA.2242.09的SSF所產(chǎn)的乙醇濃度為8.9g/l，或65％的乙醇產(chǎn)量，相比之下對照植物乙醇濃度為4.5g/l，或乙醇產(chǎn)量為42％，這相當(dāng)于乙醇產(chǎn)量有55％的提高。如圖18-21中所示，提高的水解可以被解釋為，具有減少外源酶用量而仍然保持相似的水解作用的潛力。植物中CWD酶的表達(dá)說明了有機(jī)會(huì)從表達(dá)CWD酶的作物或生物質(zhì)中生產(chǎn)低價(jià)糖以生產(chǎn)生物燃料，生化藥劑和生化材料?？焖俚某跏妓獾暮锰幨翘峁┝嗽谳^短的操作時(shí)間內(nèi)達(dá)到相似或更好的水解的可能性，同步糖化和發(fā)酵過程(圖22)的優(yōu)勢，以及減少需要的設(shè)備容量和操作成本的機(jī)會(huì)。植物細(xì)胞壁降解酶的生產(chǎn)是一種與通過對轉(zhuǎn)基因植物的直接水解從生物質(zhì)中生產(chǎn)可發(fā)酵糖相關(guān)的降低成本的方法。實(shí)施例7-熱化學(xué)效果：溫和預(yù)處理的生物質(zhì)溶解性圖23說明了經(jīng)過去離子水(DI)、0.06M或0.25M稀硫酸(DSA)；或0.25M亞硫酸氫銨和0.23M碳酸銨(BSC；pH8.1)預(yù)處理后，基于表達(dá)外切葡聚糖酶CBHA(CBHA.2069.3.17)的轉(zhuǎn)基因植物和野生型對照植物(AxB)的重量損失的溫和預(yù)處理的生物質(zhì)的溶解性。在75℃，液固比為8的條件下進(jìn)行預(yù)處理16小時(shí)。此圖強(qiáng)調(diào)了烘干的玉米秸稈樣品重量減輕的數(shù)據(jù)，這些玉米秸稈來源于轉(zhuǎn)基因植物和野生型對照植物。對預(yù)處理的生物質(zhì)進(jìn)行清洗和離心分離過程后進(jìn)行測量。與DI預(yù)處理相比，0.25MBSC(pH8.1)的預(yù)處理引起了轉(zhuǎn)基因植物(CBHA.2069.3.17)超過17.5％的生物質(zhì)損失，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?AxB)超過12.2％的生物質(zhì)損失。表達(dá)外切葡聚糖酶(CBHA.2069.3.17)的轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锵啾?，顯示出在所有預(yù)處理下更多的生物質(zhì)損失。實(shí)施例8-熱化學(xué)效果：溫和預(yù)處理下生物質(zhì)損失和木質(zhì)素的去除使用去離子水(DI)以及0.17M亞硫酸氫銨和0.165M碳酸銨(BSC)，在pH為8.1、液固比為8、75℃條件下預(yù)處理16小時(shí)后，通過從轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.2209獲得的烘干的秸稈樣品，測定生物質(zhì)損失和木質(zhì)素的去除。對預(yù)處理的生物質(zhì)進(jìn)行清洗和離心分離過程后進(jìn)行測量。表3說明了使用0.17MBSC(pH8.1)的預(yù)處理與用去離子水的預(yù)處理相比，會(huì)導(dǎo)致更多的生物量損失和更多的木質(zhì)素去除。表3：預(yù)處理的生物質(zhì)中預(yù)處理后的生物質(zhì)損失和酸不溶性木質(zhì)素實(shí)施例9-熱化學(xué)效果：溫和預(yù)處理中的脫乙酰作用圖24A-24B說明了溫度和時(shí)間對植物生物質(zhì)的脫乙酰作用的影響，這通過對從表達(dá)外切纖維素酶A的轉(zhuǎn)基因植物(CBHA.2063.3.17)和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?AxB)中獲得的烘干的玉米秸稈進(jìn)行評(píng)估。預(yù)處理包括去離子水(DI)，0.06M稀硫酸(DSA)，0.25MDSA，或0.25M亞硫酸氫銨與0.23M碳酸銨(BSC)；在pH8.1，液固比為8，75℃和95℃下處理16小時(shí)，或85℃處理7小時(shí)。通過對濾液樣品進(jìn)行高效液相色譜分析確定醋酸(HAc)的濃度，所述濾液樣品來自于使用HPX-87H柱(Bio-RadLaboratories、Hercules，CA)酸柱的預(yù)處理的生物質(zhì)，酸柱的操作條件為：0.6ml/min、60℃、0.004M硫酸作為流動(dòng)相。使用0.25MBSC(pH8.1)的預(yù)處理與使用去離子水和0.06MDSA的預(yù)處理相比導(dǎo)致顯著的脫乙酰作用。實(shí)施例10-熱化學(xué)效果：溫和預(yù)處理下很少或沒有糖降解(糠醛和羥甲基糠醛(HMF))圖25A-25B說明了用去離子水(DI)、0.06M稀硫酸(DSA)、0.25MDSA，或0.25M亞硫酸氫銨和0.23M碳酸銨(BSC；pH值8.1)處理后，來自表達(dá)外切葡聚糖酶CBHA的轉(zhuǎn)基因植物(CBHA.2069.3.17)和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?AxB)的烘干的玉米秸稈樣本中的糖降解產(chǎn)物羥甲基糠醛(HMF)和糠醛的產(chǎn)量。預(yù)處理的進(jìn)行在溫度為75℃和95℃下處理16小時(shí)以及85℃處理7小時(shí)。預(yù)處理的生物質(zhì)的濾液中HMF和糠醛的濃度用高效液相色譜分析來測量，使用HPX-87H柱(Bio-RadLaboratories、Hercules、CA)酸柱，操作在0.6ml/min、60℃和0.004M硫酸作為流動(dòng)相的條件下進(jìn)行。這些數(shù)據(jù)顯示，與導(dǎo)致樣本中糖降解以及HMF和糠醛檢出的使用去離子水(DI)、0.06M稀硫酸(DSA)或0.25MDSA的預(yù)處理相比，使用0.25MBSC(pH8.1)進(jìn)行預(yù)處理后，HMF和糠醛很少或沒有從表達(dá)外切葡聚糖CBHA的轉(zhuǎn)基因植物(CBHA.2069.3.17)或非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?AxB)的樣本中發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例11-植物中酶的自動(dòng)水解表達(dá)細(xì)胞壁降解酶的植物自動(dòng)水解作用的實(shí)施例如圖26所示。此圖說明了經(jīng)過預(yù)處理的單獨(dú)表達(dá)XynB的玉米植物(XynB.2063.15)和同時(shí)表達(dá)三種酶：XynA和輔助酶A和B(XynA/AccA/B.2096.01)的植株的結(jié)果。所述結(jié)果與預(yù)處理的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?AxB)作了比較。使用0.17M的亞硫酸氫銨和0.165M的碳酸銨(pH值8.1)，在液固比(L/S)為10，55℃條件下進(jìn)行預(yù)處理16小時(shí)。在50℃的溫度、pH5.0，無外源復(fù)合酶(NCt)的條件下，使用2％固含量的植物中產(chǎn)生的酶處理3天完成酶水解。后酸水解在小于1.0的pH，121℃的溫度下進(jìn)行60分鐘。表達(dá)木聚糖酶的兩種轉(zhuǎn)基因植物與對照AxB植物相比，通過自動(dòng)水解，顯示出3–5倍以上的木糖產(chǎn)量。圖27說明了同時(shí)表達(dá)木聚糖酶B，內(nèi)切葡聚糖酶和CHBA的玉米植株(XynB/EGA/CBHA.2345.116)和表達(dá)木聚糖酶B，內(nèi)切葡聚糖酶和CBHB的植物(XynB/EGA/CBHB.2349.55)與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?AxB)相比的自動(dòng)水解的結(jié)果。植物使用0.17M亞硫酸氫銨和0.165M碳酸銨BSC(pH值8.1)，在L/S為10，55℃下進(jìn)行16小時(shí)預(yù)處理。在使用植物中表達(dá)的酶的預(yù)處理和水解之間沒有中間洗滌程序。水解在以下條件下完成：2％固含量，無復(fù)合酶(NCt)，50℃和pH5.0，處理3天。與對照植物AxB相比，通過自動(dòng)水解，表達(dá)木聚糖酶和其他纖維素酶的轉(zhuǎn)基因植物顯示出顯著高的木糖產(chǎn)量。實(shí)施例12-機(jī)械去纖維化對未磨碎的秸稈的影響機(jī)械去纖維化對加工的未磨碎秸稈的葡萄糖和木糖產(chǎn)量的影響數(shù)據(jù)顯示在圖28A-28B中。這些數(shù)據(jù)來自預(yù)處理的表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因植物(EGA/XynA.2242.09T1)和對比的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.4000的試驗(yàn)。預(yù)處理是采用0.25M亞硫酸氫銨和0.23M的碳酸銨(pH值8.56，在L/S為8，75℃條件下處理16小時(shí)后進(jìn)行機(jī)械去纖維化(6％的固含量)完成的。酶水解作用是在50℃的溫度，pH5.0的條件下，通過使用1500/XY(0.2/0.1ml每克秸稈)的4％固含量的植物中產(chǎn)生的酶，處理3天來完成的。整個(gè)時(shí)間進(jìn)程中，同時(shí)表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的轉(zhuǎn)基因玉米植物與對照植物TGC.4000相比，始終顯示較高的葡萄糖和木糖產(chǎn)量，水解3天后，轉(zhuǎn)基因玉米植物分別達(dá)到83％和63％的葡萄糖和木糖產(chǎn)量。在本申請通篇中引用的參考文獻(xiàn)均出于本文顯而易見的目的而被納入本文，如同將它們?nèi)募{入本文一樣。出于說明的目的，這些參考文獻(xiàn)的特定部分被引用到本文特定的位置。在特定位置的參考文獻(xiàn)的引用表明將參考文獻(xiàn)中教導(dǎo)的方法納入本文。然而，在特定位置的參考文獻(xiàn)的引用，不限制將所有引用的參考文獻(xiàn)教導(dǎo)的方法，出于任何目的而納入本文。因此應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不限于具體公開的實(shí)施方式，旨在涵蓋如從屬權(quán)利要求、如上的說明和/或如附圖所示所定義的，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的所有變型。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3