本發(fā)明涉及生物熒光探針領(lǐng)域，更具體地，涉及一種基于喹啉骨架的銅離子和硫離子雙靶點熒光探針及其制備方法，以及該雙靶點熒光探針在細(xì)胞成像中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

人體內(nèi)銅元素絕大多數(shù)都以Cu²⁺表現(xiàn)，同時銅元素又是人體內(nèi)最豐富的微量元素之一。銅離子在生理代謝過程中扮演著至關(guān)重要的角色，例如可以充當(dāng)活性氧的解毒物種、神經(jīng)傳遞素生物合成和降解。然而，細(xì)胞內(nèi)銅離子的紊亂將會嚴(yán)重危害人類的健康，特別是會誘發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，如Alzheimer、Menkes以及Wilson疾病。同樣，硫離子廣泛應(yīng)用于硫酸工業(yè)、化肥生產(chǎn)，以及染料、化妝品的制造等領(lǐng)域，人體內(nèi)硫化細(xì)菌的代謝以及含硫氨基酸的代謝都會產(chǎn)生硫離子。人體內(nèi)硫離子濃度的升高也會嚴(yán)重影響人類的健康，例如會造成人體肌肉損傷、疼痛、粘膜組織損害，嚴(yán)重時可以導(dǎo)致窒息。因此檢測人體細(xì)胞內(nèi)的銅離子和硫離子有著重要的意義。

熒光檢測具有高靈敏度、高選擇性、操作簡易、快速響應(yīng)等優(yōu)勢。細(xì)胞熒光成像作為生物和藥物科學(xué)領(lǐng)域里一種高效的探測手段備受關(guān)注。盡管近年來，大量的有關(guān)銅離子、硫離子的熒光探針被大量報道，但是尚未有能同時檢測這兩種離子并將其用于細(xì)胞內(nèi)成像、識別這兩種離子的熒光探針。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于喹啉骨架的銅離子和硫離子雙靶點熒光探針，以及提供該雙靶點熒光探針的制備方法和其在細(xì)胞成像中的應(yīng)用。

喹啉是一個大的共軛體系，可以很容易地產(chǎn)生π到π*的電子躍遷，喹啉基衍生物不僅具有較強的熒光，而且其雜環(huán)氮原子能參與配位，即同時具有識別和熒光功能。本發(fā)明的發(fā)明人依據(jù)此特性，設(shè)計、合成了一個簡單的喹啉骨架類探針，可以高效識別、檢測銅離子和硫離子，并同時實現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)識別這兩種離子。操作簡單、方便，重復(fù)性好、穩(wěn)定性高。

本發(fā)明的第一方面是提供一種基于喹啉骨架的銅離子和硫離子雙靶點熒光探針(以下簡稱QLBA)，該雙靶點熒光探針具有式I所示的結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明的第二方面是提供上述雙靶點熒光探針的制備方法，該方法包括：

在有機溶劑存在下，將式II所示化合物與喹哪啶酸酰氯接觸進行反應(yīng)，得到式I所示化合物，

本發(fā)明的第三方面是提供所述的雙靶點熒光探針在細(xì)胞成像中的應(yīng)用。

本發(fā)明的特點表現(xiàn)在：

(1)熒光探針QLBA合成簡單。

(2)QLBA對Cu²⁺具有高靈敏度和高選擇性識別檢測。

(3)得到的QLBA-Cu²⁺復(fù)合物可以進一步識別硫離子。

(4)運用高分辨質(zhì)譜、核磁、DET計算等技術(shù)手段詳細(xì)分析了探針對銅離子的識別機理。

(5)可以在活細(xì)胞內(nèi)識別銅離子和硫離子。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后具體實施方式部分予以詳細(xì)說明。

附圖說明

通過結(jié)合附圖對本發(fā)明示例性實施方式進行更詳細(xì)的描述，本發(fā)明的上述以及其它目的、特征和優(yōu)勢將變得更加明顯。

圖1(a)和圖1(b)為QLBA的氫譜。

圖2(a)和圖2(b)為QLBA的碳譜。

圖3(a)和圖3(b)分別為QLBA在CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液體系中的紫外吸收譜圖和熒光發(fā)射譜圖。

圖4(a)為將50μM的不同金屬離子加入QLBA(10μM)的CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液后的熒光發(fā)射譜圖。圖4(b)為QLBA(10μM)在CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液中與Cu²⁺(30μM)，和其他金屬離子(30μM)的熒光發(fā)射譜圖，1,QLBA；2,Cu²⁺；3,Cu²⁺+Na⁺；4,Cu²⁺+K⁺；5,Cu²⁺+Mg²⁺；6,Cu²⁺+Ca²⁺；7,Cu²⁺+Co²⁺；8,Cu²⁺+Zn²⁺；9,Cu²⁺+Mn²⁺；10,Cu²⁺+Fe³⁺；11,Cu²⁺+Al³⁺；12,Cu²⁺+Cr³⁺；13,Cu²⁺+Pb²⁺；14,Cu²⁺+Hg²⁺；15,Cu²⁺+Cd²⁺(λex＝370nm)。

圖5(a)示出了在QLBA(10μM)的CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液中不斷滴加Cu²⁺的熒光發(fā)射譜圖，其中插圖為在QLBA(10μM)在CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液中不斷滴加Cu²⁺在508nm處的熒光值與Cu²⁺滴加濃度的滴定曲線。圖5(b)示出了銅離子濃度在0～10μM的熒光強度(435nm)與銅離子濃度的關(guān)系。

圖6(a)示出了在QLBA-Cu²⁺(10μM)的CH₃OH-HEPES(20mM，pH7.2)溶液中加入不同常見陰離子的熒光圖譜，1,QLBA；2,QLBA+Cu²⁺；3,QLBA+Cu²⁺+S^2-；then addition of 4,F^-；5,Cl^-；6,Br^-；7,NO₃^-；8,NO₂^-；9,SO₄^2-；10,SO₃^2-；11,OAc^-；12,H₂PO₄^-；13,ClO₄^-；14,賴氨酸；15,半胱氨酸)。圖6(b)示出了QLBA-Cu²⁺(10μM)在CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液中加入30μM S^2-，然后加入(4,F^-；5,Cl^-；6,Br^-；7,I^-；8,NO₂^-；9,SO₄^2-；10,SO₃^2-；11,OAc^-；12,H₂PO₄^-；13,ClO₄^-；14,賴氨酸；15,半胱氨酸)的CH₃OH-HEPES緩沖溶液(1/9,v/v,pH 7.2)的熒光發(fā)射譜圖。(λex＝370nm)

圖7(a)示出了在(10μM)的CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)緩沖溶液中不斷滴加硫離子的熒光發(fā)射譜圖。圖7(b)示出了硫離子濃度在0～10μM范圍內(nèi)與其熒光強度(435nm)與呈線性關(guān)系。

圖8為QLBA與2當(dāng)量Cu²⁺的質(zhì)譜。

圖9(a)為QLBA的核磁氫譜，圖9(b)為QLBA+0.5當(dāng)量Cu²⁺的核磁氫譜，圖9(c)為QLBA+1.0當(dāng)量Cu²⁺，及圖9(d)為QLBA+2.0當(dāng)量Cu²⁺在DMSO-d₆溶劑中的核磁氫譜。

圖10(a)和圖10(b)示出了DFT計算分析的QLBA/QLBA-Cu²⁺最優(yōu)化結(jié)構(gòu)。

圖11示出了不同濃度QLBA的細(xì)胞毒性。

圖12a為HeLa細(xì)胞作為對照組實驗的共聚焦顯微鏡成像；圖12b為HeLa與20μM QLBA共孵育4h后的共聚焦顯微鏡成像；圖12c為HeLa與20μM QLBA共孵育4h，加入20μM Cu²⁺的共聚焦顯微鏡成像；圖12d為HeLa與20μM QLBA共孵育4h，加入20μM Cu²⁺孵育30min，然后加入10μM硫離子的共聚焦顯微鏡成像；圖12e為HeLa與20μM QLBA共孵育4h，加入20μM Cu²⁺孵育30min，然后加入20μM硫離子的共聚焦顯微鏡成像。

具體實施方式

下面將參照附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。雖然附圖中顯示了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，然而應(yīng)該理解，可以以各種形式實現(xiàn)本發(fā)明而不應(yīng)被這里闡述的實施方式所限制。

本發(fā)明提供一種基于喹啉骨架的銅離子和硫離子雙靶點熒光探針，該雙靶點熒光探針具有式I所示的結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明還提供上述雙靶點熒光探針的制備方法，該方法包括：

在有機溶劑存在下，將式II所示化合物與喹哪啶酸酰氯接觸進行反應(yīng)，得到式I所示化合物，

所述有機溶劑可以為本領(lǐng)域常規(guī)的非質(zhì)子有機溶劑，優(yōu)選為二氯甲烷、甲苯和正己烷中的至少一種。在有機合成過程中，所用上述有機溶劑均需要經(jīng)過干燥處理。

優(yōu)選地，所述式II所示化合物與喹哪啶酸酰氯的摩爾比為1：0.8-1.2。

優(yōu)選地，所述方法包括：將喹哪啶酸酰氯與有機溶劑的混合溶液滴加至式II所示化合物與有機溶劑的混合溶液中。

優(yōu)選地，所述滴加在低溫條件下進行，優(yōu)選為冰浴攪拌。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)的溫度為-4至5℃，時間為4-8小時。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)的條件為冰浴攪拌。

本發(fā)明所述式II所示化合物和喹哪啶酸酰氯均可通過商購獲得。

本發(fā)明的方法還可以包括常規(guī)的后處理步驟，例如冷卻、旋蒸溶劑、柱層析等。

本發(fā)明還提供所述的雙靶點熒光探針在細(xì)胞成像中的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選實施方式，所述方法的反應(yīng)方程式如下所示，

包括以下步驟：

將式II所示化合物溶于二氯甲烷，加入反應(yīng)瓶中，常溫攪拌，然后置于冰浴條件下攪拌。將喹哪啶酸酰氯溶于二氯甲烷，用恒壓滴液漏斗逐滴滴加到以上反應(yīng)瓶中。滴加完畢，冰浴條件下攪拌。隨后，旋蒸除去溶劑二氯甲烷，得到褐色固體出產(chǎn)品，并通過柱層析分離純化，得到淺黃色固體粉末的QLBA。

通過以下實施例對本發(fā)明進行進一步說明。

實施例1

將式II所示化合物(1.05g,5mmol)溶于二氯甲烷(30mL)，加入到200mL的兩口瓶中，放入磁力轉(zhuǎn)子，常溫攪拌10分鐘，然后置于冰浴條件下攪拌。將事先制備的等物質(zhì)量的喹哪啶酸酰氯溶于20mL二氯甲烷，用恒壓滴液漏斗逐滴滴加到以上反應(yīng)瓶中。滴加完畢，冰浴條件下攪拌5小時。隨后，旋蒸除去溶劑二氯甲烷，得到褐色固體出產(chǎn)品，并通過柱層析分離純化，得到1.12g淺黃色固體粉末QLBA，產(chǎn)率為62％。

圖1(a)和圖1(b)為QLBA的氫譜。圖2(a)和圖2(b)為QLBA的碳譜。

測試?yán)?

1QLBA的光物理表征

1.1測試QLBA的吸收譜圖。配置10μM的QLBA的CH3OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液，取2mL加入石英比色皿中，使用紫外-可見分光光度計測試其吸收譜圖。

測試QLBA的熒光發(fā)射譜圖。配置10μM的QLBA溶液于CH3OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液，取2mL加入比色皿中，在熒光分光光度計上測試QLBA的熒光發(fā)射譜圖。激發(fā)波長為360nm，發(fā)射區(qū)間為390-700nm。

測試?yán)?

2QLBA對不同金屬離子的選擇性研究

2.1檢測體系中，比色皿中有2毫升CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液。檢測時每個比色皿中含有不同的金屬離子，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，F(xiàn)e²⁺，Mn²⁺，Hg²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Al³⁺，Pd²⁺，Cu²⁺，F(xiàn)e³⁺鹽溶液濃度均為30μM，同時含有10μM的QLBA。在熒光分光光度計上進行熒光強度的檢測(激發(fā)波長為360nm)。

2.2采集并處理數(shù)據(jù)。

測試?yán)?

3Cu²⁺和S^2-的滴定實驗

3.1配置10μM QLBA溶液，溶劑為CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液，取1mL加入比色皿中。

3.2配置20mM的CuCl₂和20mM的Na₂S水溶液。

3.3向比色皿中分別滴加Cu²⁺，Cu²⁺的濃度范圍為0～30μM，在熒光分光光度計上依次測試熒光發(fā)射譜圖。

3.4同法，向比色皿中分別滴加10μM Cu²⁺，然后依此溶液體系為基礎(chǔ)，逐滴加入S^2-，測試熒光發(fā)射譜圖。

3.5采集并處理數(shù)據(jù)。

測試?yán)?

4QLBA與Cu²⁺的作用機制分析

4.1配置QLBA和5當(dāng)量的CuCl₂的溶液，進行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析得到QLBA與Cu²⁺的結(jié)合比例。

4.2配置QLBA的D6-DMSO溶液，測核磁氫譜，然后逐滴加入CuCl₂的D6-DMSO溶液，每滴加一次，測試一次氫譜。將測試所得的核磁縱向比對，找出變化規(guī)律。

4.3在計算機上利用高斯09軟件進行密度泛函理論(DFT)計算分析。

測試?yán)?

5細(xì)胞培養(yǎng)方法

將HeLa細(xì)胞放置于37℃，二氧化碳含量為5％的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基為含10％FBS的RPMI-1640。在細(xì)胞密度約為90％時使用胰酶細(xì)胞消化液進行傳代，平均2天傳代一次。

測試?yán)?

6細(xì)胞毒性檢測

收集對數(shù)期HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞溶液濃度至50000個/mL，在96孔板中每孔加入100μL。在5％CO₂，37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后，加入不同濃度梯度的QLBA100μL，使各梯度濃度為(0，2，5，10，20，50，100μM)。每個梯度五個復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，每孔加入20μL的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)的PBS溶液(5mg/mL)，共孵育4h。吸去上清，每孔加入150μL的DMSO，置搖床上低速震蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 570nm處測量各孔的吸光值。

測試?yán)?

7細(xì)胞成像

7.1QLBA與HeLa細(xì)胞作用成像實驗。將HeLa細(xì)胞傳代至直徑為20mm的共聚焦玻底培養(yǎng)皿，在5％CO₂，37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后。將QLBA加入培養(yǎng)基中，QLBA的濃度為20μM，孵育6h后，移去培養(yǎng)液，用1×PBS清洗細(xì)胞六次。在共聚焦顯微鏡下(Olympus FV1000-IX81confocallaser scanning microscope)觀測。激發(fā)光選用汞激光器(72.0％405nm)。

7.2細(xì)胞內(nèi)檢測QLBA與Cu²⁺和S^2-細(xì)胞成像實驗。將HeLa細(xì)胞傳代至直徑為20mm的共聚焦玻底培養(yǎng)皿，在5％CO₂，37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后。將QLBA加入培養(yǎng)基中，QLBA的濃度為20μM，孵育4小時后，加入20μM Cu²⁺孵育30min后移去培養(yǎng)液，用1×PBS清洗細(xì)胞4次。在共聚焦顯微鏡下(Olympus FV1000-IX81confocal laser scanning microscope)觀測。激發(fā)光選用汞激光器(72.0％405nm)。進行上述平行實驗兩組，加入銅離子孵育30min結(jié)束后，再分別向這兩組平行實驗中加入10μM和20μM硫離子，孵育30min后移去培養(yǎng)液，用1×PBS清洗細(xì)胞4次。在共聚焦顯微鏡下觀測。

8整理數(shù)據(jù)與分析

8.1QLBA在CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液體系中的紫外吸收和熒光發(fā)射譜圖。如圖3(a)和圖3(b)所示，QLBA擁有300～400nm的吸收范圍。508nm處為其最大發(fā)射波長。

8.2QLBA與不同金屬離子的選擇性研究

QLBA基于喹啉骨架設(shè)計而成，其雜環(huán)氮原子的喹啉衍生物可以作為金屬離子的螯合位點，所以進行QLBA與不同金屬離子之間的選擇性研究，本發(fā)明共選取了14種常見金屬離子(Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Cr³⁺，Mn²⁺，Hg²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Al³⁺，Pd²⁺，Cu²⁺，F(xiàn)e³⁺)。

如圖4(a)和圖4(b)所示，加入了不同的金屬離子后，Cu²⁺對QLBA的熒光顯示出了顯著的淬滅，而對其他離子并沒有明顯的變化。然后在此體系中繼續(xù)加入其他離子并沒有引起其他明顯變化，此結(jié)果說明QLBA對Cu²⁺有特異響應(yīng)，且在其他離子存在的條件下，不會干擾QLBA對Cu²⁺的特異響應(yīng)。

8.3Cu²⁺對QLBA的滴定實驗

如圖5(a)和圖5(b)所示，在QLBA(10μM)的CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液體系中，隨著Cu²⁺的滴加濃度不斷增加，QLBA的最大發(fā)射波長(435nm)處的熒光值不斷下降，當(dāng)Cu²⁺的滴加濃度達到10μM時，QLBA的熒光強度基本淬滅。當(dāng)Cu²⁺的滴加濃度在0～10μM時，QLBA的最大發(fā)射波長(435nm)和Cu²⁺濃度呈現(xiàn)較好的線性。通過LOD＝3*Sb/S計算其檢測限，QLBA對Cu²⁺的檢測限為2.2×10^-7M。

8.4QLBA-Cu²⁺體系對S^2-的檢測

如圖6(a)所示，QLBA-Cu²⁺(10μM)體系中加入了不同的陰離子后，S^2-可以使QLBA-Cu²⁺原先已淬滅的熒光顯著增強，而其他離子并沒有明顯的變化。然后在此體系中繼續(xù)加入其他離子并沒有引起其他明顯變化，如圖6(b)所示，此結(jié)果說明QLBA-Cu²⁺對硫離子特異響應(yīng)，且在其他離子存在的條件下，不會干擾QLBA對Cu²⁺的特異響應(yīng)。

如圖7(a)和圖7(b)所示，在QLBA-Cu²⁺(10μM)的CH₃OH-HEPES(20mM，pH 7.2)溶液體系中，隨著硫離子的滴加濃度不斷增加，體系在435nm處的熒光值逐漸增強，當(dāng)硫離子的滴加濃度達到10μM時，QLBA-Cu²⁺體系的熒光強度基本達到最大值。并且，在0～10μM范圍內(nèi)時，體系的最大發(fā)射波長(435nm)和硫離子濃度呈現(xiàn)較好的線性。通過LOD＝3*Sb/S計算其檢測限，QLBA對Cu²⁺的檢測限為0.46μM。

8.5QLBA與Cu²⁺和Fe³⁺的作用機制研究

圖8的質(zhì)譜結(jié)果顯示，m/z 365.1389(計算值365.1397)對應(yīng)于[QLBA+H]⁺,m/z 426.0533(計算值426.0536)對應(yīng)于[QLBA+Cu-H]⁺，此質(zhì)譜實驗結(jié)果可以明確顯示探針QLBA與銅離子之間是1:1的配位關(guān)系。

圖9表明苯并咪唑上的雜原子N、喹啉單元中的N以及酰胺鍵中的N參與到與銅離子的配位結(jié)合。

通過DFT計算分析，QLBA與Cu²⁺的結(jié)合位點如圖10(a)和圖10(b)所示。Cu²⁺和QLBA結(jié)構(gòu)上的N(1)，N(2)，N(3)原子的距離分別為。圖10中的QLBA，及復(fù)合物QLBA-Cu²⁺結(jié)構(gòu)均為最優(yōu)結(jié)構(gòu)。

8.6細(xì)胞成像

8.6.1細(xì)胞毒性

通過MTT法研究QLBA的細(xì)胞毒性，結(jié)果如圖11所示，當(dāng)QLBA濃度達到20μM時孵育24h后，細(xì)胞存活率達90％以上。

8.6.2QLBA的細(xì)胞內(nèi)識別銅離子以及進一步識別硫離子

圖12a-圖12e中的結(jié)果顯示當(dāng)QLBA與HeLa細(xì)胞共孵育后4h后進行共聚焦顯微成像，細(xì)胞顯示藍色熒光，加入等量銅離子后熒光被淬滅，然后加入硫離子共培養(yǎng)，熒光又會恢復(fù)。此結(jié)果顯示QLBA能夠用作細(xì)胞內(nèi)識別Cu²⁺，同時又可以進一步識別硫離子。

以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的各實施例，上述說明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實施例。在不偏離所說明的各實施例的范圍和精神的情況下，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。