本發(fā)明屬于基因敲除技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙基因缺失腸炎沙門氏菌、其構(gòu)建方法及含有該雙基因缺失腸炎沙門氏菌的疫苗。

背景技術(shù)：

腸炎沙門氏菌是一種人獸共患的重要病原菌，感染沙門氏菌的家禽是沙門氏菌最為常見的儲存庫，人類通常是由于攝入被污染的蛋類或未完全煮熟的禽肉而感染沙門菌的。世界范圍內(nèi)，因食入腸炎沙門菌污染的禽肉蛋制品引起的食物中毒，各國都有發(fā)生且數(shù)量不斷增加。因此,腸炎沙門氏菌不但嚴重阻礙了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，而且還威脅著人畜健康，已成為醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一個重要問題。目前，主要是使用抗生素類藥物來預(yù)防和治療沙門氏菌，但隨著抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致了沙門氏菌的耐藥性和耐藥譜的不斷變化以及多重耐藥現(xiàn)象。

疫苗是預(yù)防腸炎沙門氏菌感染的另一種有效措施，如今使用的疫苗有滅活苗和減毒活疫苗，滅活苗需要經(jīng)皮下多次接種，使用不方便，且不能誘導(dǎo)產(chǎn)生消化道局部保護力和細胞免疫，因而無法激發(fā)強有力的免疫力以抵御野生致病菌株的感染等不足。而活疫苗因能夠模擬自然感染狀況，具有誘導(dǎo)細胞、體液和黏膜免疫的特點，因此國際上提倡用活疫苗控制家禽SE感染，活疫苗的研發(fā)已經(jīng)得到世界衛(wèi)生組織的認可，并作為控制沙門氏菌病完整策略的一部分?；钜呙缰饕怯苫蛲蛔兓蚯贸龢?gòu)建的減毒突變株，目前在雞廣泛使用的減毒活疫苗，雖然都有一定的免疫保護效力，然而在多數(shù)實驗中，對野生株很難產(chǎn)生較強的定殖抑制效應(yīng)，還可誘發(fā)野生株的全身性傳播；此外，也不能有效誘導(dǎo)對其它非宿主適應(yīng)性血清型沙門菌的交叉保護。因此，目前還沒有一種非常有效的減毒活疫苗來控制家禽SE感染。隨著人感染腸炎沙門菌的持續(xù)流行，急需開發(fā)更加有效的疫苗以控制家禽SE細菌的傳播。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明解決的技術(shù)問題是：針對現(xiàn)有技術(shù)中腸炎沙門 氏菌活疫苗對野生株很難產(chǎn)生較強的定殖抑制效應(yīng)，容易誘發(fā)野生株的全身性傳播，且也不能有效誘導(dǎo)對其他非宿主適應(yīng)性血清型沙門菌交叉保護的技術(shù)問題，而提供一種在宿主中清除效果好，且免疫效果優(yōu)良的雙基因缺失腸炎沙門氏菌、其構(gòu)建方法及含有該雙基因缺失腸炎沙門氏菌的疫苗。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種雙基因缺失腸炎沙門氏菌，為rfaH基因和sopB基因都被敲除的腸炎沙門氏菌。

一種雙基因缺失腸炎沙門氏菌的構(gòu)建方法，采用同源重組的方法對所述腸炎沙門氏菌中的rfaH基因和sopB基因進行敲除。具體包括如下步驟：

1)根據(jù)腸炎沙門氏菌的基因組序列，設(shè)計出rfaH基因的上游同源臂序列rU的上游引物rfaH-1F和下游引物rfaH-1R，rfaH基因的下游同源臂序列rD的上游引物rfaH-2F和下游引物rfaH-2R，所述rfaH-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述rfaH-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述rfaH-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述rfaH-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

2)采用PCR擴增方法，以腸炎沙門菌的基因組DNA為模板，以rfaH-1F和rfaH-1R為引物擴增得到rfaH的上游同源臂rU，以rfaH-2F和rfaH-2R為引物擴增得到rfaH的下游同源臂rD；

3)以步驟2)擴增得到的rU和rD為模板，rfaH-1F和rfaH-2R為引物，進行交疊PCR反應(yīng)，獲得交疊PCR產(chǎn)物rUD；

4)將步驟3)得到的交疊PCR產(chǎn)物rUD與pMD19-T載體進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，采用藍白篩選和氨芐青霉素抗性篩選挑選陽性克隆，采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)挑選出的陽性克隆，提取質(zhì)粒，獲得重組pMD-ΔrfaH質(zhì)粒；

5)用限制性內(nèi)切酶BglⅡ分別酶切自殺質(zhì)粒pYG4和重組pMD-ΔrfaH質(zhì)粒，回收自殺質(zhì)粒pYG4酶切后獲得的5797bp片段和重組pMD-ΔrfaH質(zhì)粒酶切后獲得的1885bp片段，將獲得的5797bp片段和1885bp片段于金屬浴中連接過夜；

6)將步驟5)連接后的產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-l/λpir感受態(tài)細胞，對轉(zhuǎn)化后的細胞進行培養(yǎng)，將培養(yǎng)菌液涂布于卡拉霉素抗性LB平板上，挑取單菌落，增菌后提取質(zhì)粒，獲得重組自殺質(zhì)粒pYG4-ΔrfaH；

7)在含有萘啶酸的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)受體菌腸炎沙門氏菌，在含有卡拉霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)供體菌含重組自殺質(zhì)粒pYG4-ΔrfaH的大腸桿菌S17-l/λpir，對所述受體菌和供體菌培養(yǎng)后分別收集菌體并重懸，將重懸后的供體菌和受體菌混合并于無抗生素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將培養(yǎng)得到的菌液涂布于含卡那霉素和萘啶酸的雙抗平板上，篩選陽性克隆單整合菌株，將篩選得到的單整合菌株于無抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，用蔗糖平板篩選，得到發(fā)生染色體內(nèi)重組的腸炎沙門氏菌株；以序列如SEQ ID NO.7所示的rfaH-1和序列如SEQ ID NO.8所示的rfaH-2為引物，采用PCR方法對發(fā)生染色體內(nèi)重組的腸炎沙門氏菌株進行篩選鑒定，挑選PCR擴增出631bp的菌株，得到敲除rfaH基因的腸炎沙門氏菌株；

8)根據(jù)腸炎沙門氏菌的基因組序列，設(shè)計出sopB基因的上游同源臂序列sU的上游引物sopB-1F和下游引物sopB-1R，sopB基因的下游同源臂序列sD的上游引物sopB-2F和下游引物sopB-2R，所述sopB-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述sopB-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述sopB-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述sopB-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

9)采用PCR擴增方法，以腸炎沙門菌的基因組DNA為模板，以sopB-1F和sopB-1R為引物擴增得到sopB的上游同源臂sU，以sopB-2F和sopB-2R為引物擴增得到sopB的下游同源臂sD；

10)以步驟9)擴增得到的sU和sD為模板，sopB-1F和sopB-2R為引物進行交疊PCR反應(yīng)，獲得交疊PCR產(chǎn)物sUD；

11)將步驟10)得到的交疊PCR產(chǎn)物sUD與pMD19-T載體進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，采用藍白篩選和氨芐青霉素抗性篩選挑選陽性克隆，采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)挑選出的陽性克隆，提取質(zhì)粒，獲得重組pMD-ΔsopB質(zhì)粒；

12)用限制性內(nèi)切酶BglⅡ分別酶切自殺質(zhì)粒pYG4和重組pMD-ΔsopB質(zhì)粒，回 收自殺質(zhì)粒pYG4酶切后獲得的5797bp片段和重組pMD-ΔsopB質(zhì)粒酶切后獲得的1917bp片段，將獲得的5797bp片段和1917bp片段于金屬浴中連接過夜；

13)將步驟12)連接后的產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-l/λpir感受態(tài)細胞，對轉(zhuǎn)化后的細胞進行培養(yǎng)，將培養(yǎng)菌液涂布于卡拉霉素抗性LB平板上，挑取單菌落，增菌后提取質(zhì)粒，獲得重組自殺質(zhì)粒pYG4-ΔsopB；

14)在含有萘啶酸的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)受體菌步驟7)得到的敲除rfaH基因的腸炎沙門氏菌株，在含有卡拉霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)供體菌含重組自殺質(zhì)粒pYG4-ΔsopB的大腸桿菌S17-l/λpir，對所述受體菌和供體菌培養(yǎng)后分別收集菌體并重懸，將重懸后的供體菌和受體菌混合并于無抗生素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將培養(yǎng)得到的菌液涂布于含卡那霉素和萘啶酸的雙抗平板上，篩選陽性克隆單整合菌株，將篩選得到的單整合菌株于無抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，用蔗糖平板篩選，得到發(fā)生染色體內(nèi)重組的腸炎沙門氏菌株；以序列如SEQ ID NO.13所示的sopB-1和序列如SEQ ID NO.14所示的sopB-2為引物，采用PCR方法對發(fā)生染色體內(nèi)重組的腸炎沙門氏菌株進行篩選鑒定，挑選PCR擴增出379bp的菌株，得到缺失rfaH基因和sopB基因的雙基因缺失腸炎沙門氏菌菌株。

一種腸炎沙門氏菌疫苗，其組分包括采用上述方法制得的雙基因缺失腸炎沙門氏菌。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1、本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)由rfaH基因編碼的RfaH蛋白是一種抗轉(zhuǎn)錄終止蛋白，它可以在細菌轉(zhuǎn)錄過程中協(xié)助RNA聚合酶越過ρ非依賴型轉(zhuǎn)錄終止子結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)下游基因的通讀，從而消除長轉(zhuǎn)錄子的極性。在大腸桿菌中，rfaH蛋白是一種毒力調(diào)控蛋白，它影響脂多糖(LPS)層、溶血素和莢膜等的合成；在鼠傷寒沙門氏菌中，這個蛋白也可影響LPS核心區(qū)和0抗原的表達及其他毒力基因的表達，rfaH基因缺失鼠傷寒沙門氏菌，侵入上皮細胞和抗原遞呈細胞的能力也都得到增強，而抵抗宿主細胞內(nèi)抗菌肽等物質(zhì)的抵抗力卻減弱，因而在宿主細胞內(nèi)凈增殖數(shù)量較野生株大大降低，損失引起系統(tǒng)性疾病的能力，但卻能有效保護野毒株的攻擊。腸炎沙門氏菌亦存在rfaH基因，敲除腸炎沙門氏菌rfaH基因同樣可以實現(xiàn)LPS及其它沙門氏菌毒力基因的減毒效果，同時能夠激發(fā)有效的免疫保護反應(yīng)，是構(gòu)建SE疫苗候選株的理想的敲除目標(biāo)基因。Sop蛋白是沙門氏菌的另一毒力因子，有肌醇磷酸酯磷酸酶活性，轉(zhuǎn)移到宿主細胞后，能誘導(dǎo)細胞骨架重排,可引起腹瀉癥狀。SopB突變株除能增強體液和細胞免疫外,還能增強粘膜免疫，此外還減少 液體分泌從而減輕腹瀉。本發(fā)明發(fā)明人在上述研究發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用自殺質(zhì)粒同源重組系統(tǒng)，通過基因同源重組和蔗糖敏感基因的反向篩選技術(shù)，首先構(gòu)建了rfaH基因(1-489)缺失的腸炎沙門氏菌-ΔrfaH缺失株(D315)，在此基礎(chǔ)上，又利用同樣的原理和技術(shù)，敲除了與腸炎沙門氏菌毒力相關(guān)的另一個基因sopB(1-1686)，獲得了遺傳穩(wěn)定的腸炎沙門氏菌氏菌ΔrfaH-ΔsopB雙基因缺失突變株(D316)。

2、本發(fā)明敲除雙基因的腸炎沙門氏菌細胞免疫和黏膜免疫得到增強，SE屬于腸道病原菌，局部的體液免疫對腸道的保護和菌體的清除效率高于全身免疫，胃腸炎的恢復(fù)與腸道局部產(chǎn)生sIgA密切有關(guān)，因此能增強粘膜免疫將有助于SE的清除；同時SE是胞內(nèi)菌，強的細胞免疫對消除SE感染將發(fā)揮重要作用；經(jīng)過試驗驗證，采用本發(fā)明敲除雙基因的腸炎沙門氏菌攻毒保護效果效果明顯。

3、本發(fā)明敲除雙基因的腸炎沙門氏菌對宿主和環(huán)境的安全性得到提高，因所得突變株在宿主細胞內(nèi)的抵抗力減弱，致使存活時間和排毒量都大大減少，在體內(nèi)3～4周內(nèi)就可以被定殖清除去，安全性能優(yōu)異。

4、本發(fā)明敲除雙基因的腸炎沙門氏菌對其他血清型的免疫交叉保護得到提高，原因是該雙基因缺失株的核心LPS(O-LPS)鏈的減短，增強了對其他表面蛋白的免疫反應(yīng)，而這些蛋白在不同沙門氏菌中是相對保守的，因而能提高交叉免疫保護性，提高對其他血清型沙門氏菌的預(yù)防效果。

5、本發(fā)明敲除雙基因的腸炎沙門氏菌雙突變能降低返主的風(fēng)險，更安全；且本發(fā)明敲除雙基因的腸炎沙門氏菌rfaH基因突變后突變菌株會變?yōu)榘氪植谛?，而野生菌株為光滑型，為區(qū)分SE的自然感染和疫苗免疫株提供方便。

附圖說明

圖1為rfaH上下游同源臂rU\rD的PCR擴增片段凝膠電泳圖。(1，DL-5000Marker DNA Marker(DL-5000)；2，ddH₂O陰性對照；3，rU片段；4，rD片段)

圖2為rU\rD交疊PCR擴增片段rUD凝膠電泳圖。(1，DL-5000Marker；2rU D片段)

圖3為缺失菌株構(gòu)建圖。

圖4為缺失rfaH基因菌株的PCR鑒定圖。(1，DL-5000Marker；2缺失菌株；3，親本菌株)

圖5為sopB上下游同源臂sU\sD的PCR擴增片段凝膠電泳圖。(1，DL-5000Marker DNA Marker(DL-5000)；2，sU片段；3，sD片；4，ddH₂O陰性對照段)

圖6為sU\sD交疊PCR擴增片段sUD凝膠電泳圖。(1，DL-5000Marker；2sUD片段)

圖7為缺失rfaH基因和sopB基因菌株的PCR鑒定圖。(1，DL-5000Marker；2缺失菌株；3，親本菌株)

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例和說明書附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。本實施案例在以本發(fā)明技術(shù)為前提下進行實施，現(xiàn)給出詳細的實施方式和具體的操作過程來說明本發(fā)明具有創(chuàng)造性，但本發(fā)明的保護范圍不限于以下的實施例。

下述實施例中使用的腸炎沙門氏菌D1203(由重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院中心實驗室分離、鑒定并保存)；下述步驟為敲除rfaH基因和sopB基因的具體步驟，所述rfaH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述sopB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示

實施例1腸炎沙門菌的增殖及基因組的提取

將腸炎沙門菌D1203接種于液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，取1.5mL培養(yǎng)菌液，放置于Eppendorf離心管中，10000g離心2min，棄上清液，加入1.5mLPBS緩沖液重懸沉淀，10000g離心2min，棄上清液，向沉淀中加入240μLTE重懸菌體，并加入15μL溶菌酶，0℃冰浴30min，加入質(zhì)量濃度10％SDS 15μL，混合均勻后加入蛋白酶K，65℃水浴30min，加入5M NaCl溶液200μL，震蕩，加入500μL酚/氯仿/異戊醇(體積比1:24:25)溶液，混合均勻，12000g離心10min，取上清液至離心管中，記錄其體積，加入等體積的冷凍無水乙醇，放置于-80℃冰箱10min，12000g離心10min，棄上清液，自然風(fēng)干，加入30μL ddH2O溶解，放置-20℃冰箱保存，用于PCR反應(yīng)的模板。

實施例2rfaH基因敲除突變株的構(gòu)建

2.1交疊PCR

根據(jù)GeneBank上已發(fā)表的腸炎沙門菌基因組序列，設(shè)計出rfaH基因的上游同源臂序列rU的上游引物rfaH-1F和下游引物rfaH-1R，rfaH基因的下游同源臂序列rD的上游引物rfaH-2F和下游rfaH-2R，所述rfaH-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述rfaH-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述rfaH-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所 述rfaH-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。以上述提取的腸炎沙門菌D1203基因組DNA為模板，PCR方法擴增rfaH上、下游同源臂序列rU、rD。rU、rD的50μLPCR擴增體系如表1：

表1PCR擴增體系

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共25個循環(huán)；最后72℃延伸5min。

將采用上述PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件擴增得到的上、下游同源臂擴增產(chǎn)物rU和rD經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠檢測，結(jié)果可見得到與預(yù)期大小(919bP和933bp)相符的兩條帶(圖1)，分別切取兩條帶，按照Omega公司的凝膠回收試劑盒的使用說明進行回收純化。

由于rfaH-1R、rfaH-2F相互有部分互補序列，混合純化后的rU和rD，并以其為模板，rfaH-1F/rfaH-2R為引物進行交疊PCR。交疊PCR 50μLPCR擴增體系同前，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，共25個循環(huán)；最后72℃延伸5min。

2.2中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-ΔrfaH的構(gòu)建

交疊PCR產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠檢測，可見約2000bP條帶rUD(圖2)，切取該條帶，按照Omega公司的膠回收試劑盒的使用說明進行回收純化，得到交疊PCR產(chǎn)物rUD。將回收目的片段rUD與pMD19-T載體連接。連接體系(10μL)：10×連接酶緩沖液1μL，T4DNA連接酶1μL，pMD19-T載體1μL，rUD 5μL，滅菌ddH₂O 2μL，16℃金屬浴過夜。

將上述得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑選(基于藍白斑和氨芐青霉素 抗性)陽性克隆，并于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性克隆，提取質(zhì)粒，進行酶切、PCR鑒定和序列測定。將測定正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-ΔrfaH。

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α具體步驟如下：

取大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，置于冰上融化，吸取重組連接產(chǎn)物10μL于已融化的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，混勻后冰浴30min，42℃熱激90s，冰浴3min，加入1ml LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)1h，10000g離心2min，棄上清，向沉淀中加入100μL LB重懸菌體，將菌液涂布于100μg/mL氨芐青霉素抗性LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。

2.3重組自殺質(zhì)粒pYG4-ΔrfaH的構(gòu)建

小量提取自殺質(zhì)粒pYG4和重組質(zhì)粒pMD-ΔrfaH，分別用限制性內(nèi)切酶BglⅡ酶切，酶切體系(50μL)：10×H Buffer緩沖液5μL，質(zhì)粒(pMD-ΔrfaH或PYG4)30μL，BglⅡ2μL,滅菌ddH₂O 13μL，37℃水浴酶切2h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，質(zhì)粒pYG4酶切成1個片段(5797bp)，質(zhì)粒pMD-ΔrfaH酶切成2個片段(2707bp和1885bp)。DNA純化試劑盒回收純化pYG4片段和pMD-ΔrfaH的1885bp片段，上述兩純化片段在6℃金屬浴連接過夜。金屬浴連接體系(10μl)：10×連接酶緩沖液1μL，T4DNA連接酶1μL，pYG4片段4μL，ΔrfaH片段3μL，滅菌ddH₂O 1μL。

將金屬浴連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-l/λpir感受態(tài)細胞，涂布卡拉霉素(100μg/ml)LB平板，挑取單菌落，增菌后提取質(zhì)粒，進行酶切、PCR鑒定和序列測定。將鑒定正確 的重組自殺質(zhì)粒命名為pYG4-ΔrfaH。

熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸桿菌S17-l/λpir具體步驟如下：

取大腸桿菌S17-l/λpir感受態(tài)細胞，置于冰上融化，吸取重組連接產(chǎn)物20μL于已融化的大腸桿菌S17-l/λpir感受態(tài)細胞中，混勻后冰浴30min，42℃熱激90s，冰浴3min，加入1ml LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)1h，10000g離心2min，棄上清，向沉淀中加入100μL LB重懸菌體，將菌液涂布于100μg/mL卡拉霉素抗性LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。

2.4接合轉(zhuǎn)移及腸炎沙門菌ΔrfaH單缺失株的篩選

ΔrfaH缺失株的構(gòu)建路線如圖3，通過二步法篩選出基因突變株。具體步驟：在含有奈碇酸(NaL，40μg/ml)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)受體菌腸炎沙門氏菌D1203(Nal^R)，在含有卡拉霉素(Kan，100μg/mL)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)含pYG4-ΔrfaH自殺質(zhì)粒的大腸桿菌S17-l/λpir供體菌，37℃培養(yǎng)過夜后分別收集菌體，LB培養(yǎng)基重懸菌體，各取100μL細菌懸液混合，于無抗生素的LB平板上過夜培養(yǎng)，收集菌體，系列稀釋后，取適量菌液涂布于含卡那霉素(Kan，100μg/mL)和萘啶酸(NaL，40μg/ml)的雙抗平板上，篩選陽性克隆單整合菌株。

將獲得的整合菌株置于無抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)后于5％蔗糖平板篩選發(fā)生染色體內(nèi)重組的菌株。由于sacB片段的反向選擇作用，帶有sacB片段的整合株無法在含有5％蔗糖的平板進行上生長，而長出來的菌落都是發(fā)生了染色體內(nèi)重組，從而去掉了載體序列(包括sacB片段)的重組菌株。重組有兩種情況，其中50％的可能性產(chǎn)生敲除株，50％的可能性產(chǎn)生野生親本株。根據(jù)GeneBank上已發(fā)表的腸炎沙門菌基因組序列，設(shè)計一對引物rfaH-1/rfaH-2，rfaH-1序列如SEQ ID NO.7所示，rfaH-2序列如SEQ ID NO.8所示，通過PCR方式篩選鑒定敲除株。PCR反應(yīng)體系同前，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸1.5min，共25個循環(huán)；最后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)結(jié)束，1.0％瓊脂糖凝膠檢測，如圖4，敲除株擴增出一個條帶，位于631bp處，野生株擴增出一個條帶，位于1120bp左右。將敲除株的PCR擴增產(chǎn)物送至大連寶生工生物工程有限公司進行序列測定。測序結(jié)果表明成功敲除掉rfaH基因489bp序列，將該敲除菌株命名為D315。

實施例3腸炎沙門菌ΔrfaHΔsopB雙缺失株的構(gòu)建

3.1交疊PCR

根據(jù)GeneBank上已發(fā)表的腸炎沙門菌基因組序列，設(shè)計出sopB基因的上游同源臂序列sU的上游引物sopB-1F和下游引物sopB-1R，sopB基因的下游同源臂序列sD的上游引物sopB-2F和下游引物sopB-2R，所述sopB-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述sopB-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述sopB-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述sopB-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。以腸炎沙門菌D1203基因組DNA為模板，PCR方法擴增sopB上、下游同源臂序列sU、sD。sU、sD的50μL PCR擴增體系及PCR反應(yīng)條件同rU和rD的擴增。

將采用上述方法擴增得到的上、下游同源臂擴增產(chǎn)物sU、sD經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠檢測，結(jié)果可見得到與預(yù)期大小(920bP和964bp)相符條帶(圖5)，分別切取兩條帶，按照Omega公司的凝膠回收試劑盒的使用說明進行回收純化。

由于sopB-1R、sopB-2F相互有部分互補序列，混合純化后的sU和sD，并以其為模板，sopB-1F/sopB-2R為引物進行交疊PCR。交疊PCR 50μL擴增體系同前。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，共25個循環(huán)；最后72℃延伸5min，得到交疊PCR反應(yīng)產(chǎn)物sUD。

3.2中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-ΔsopB的構(gòu)建

交疊PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見得到與預(yù)期大小(1917bP)相符條帶sUD(圖6)，切取該條帶，按照Omega公司的膠回收試劑盒的使用說明進行回收純化。將回收目的片段sUD與pMD19-T載體連接，連接體系(10μL)：10×連接酶緩沖液1μL，T4DNA連接酶1μL，pMD19-T載體1μL，rUD 5μL，滅菌ddH₂O 2μL，16℃金屬浴過夜。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑選(基于藍白斑和氨芐青霉素抗性)陽性克隆，并于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性克隆，提取質(zhì)粒，進行酶切、PCR鑒定和序列測定。將測定正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-ΔsopB。

3.3重組自殺質(zhì)粒pYG4-ΔsopB的構(gòu)建

小量提取自殺質(zhì)粒pYG4和重組質(zhì)粒pMD-ΔsopB，分別用限制性內(nèi)切酶BglⅡ酶切，酶切體系(50μL)：10×H Buffer緩沖液5μL，質(zhì)粒(pMD-ΔrfaH或PYG4)30μL，Bgl 2μL,滅菌ddH₂O 13μL，37℃水浴酶切2h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，質(zhì)粒pYG4酶切成1個片段(5797bp)，質(zhì)粒pMD-ΔrfaH酶切成2個片段(2707bp和1917bp)，DNA純化試劑盒回收純化pYG4片段和pMD-ΔrfaH的1917bp片段，將回收的上述兩純化片段在6℃金屬浴連接過夜。連接體系(10ul)：10×連接酶緩沖液1μL，T4DNA連接酶1μL，pYG4片段4μL，ΔsopB片段3μL，滅菌ddH₂O 1μL。

將金屬浴連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-l/λpir感受態(tài)細胞，涂布卡拉霉素(100μg/ml)LB平板，挑取單菌落，增菌后提取質(zhì)粒，進行酶切、PCR鑒定和序列測定。將鑒定正確的重組自殺質(zhì)粒命名為pYG4-ΔsopB。

3.4接合轉(zhuǎn)移及腸炎沙門菌ΔrfaHΔsopB雙缺失株的篩選

以含pYG4-ΔsopB自殺質(zhì)粒的大腸桿菌S17-l/λpir為供體菌，前述2.4中所獲得的缺失rfaH基因的菌株D315為受體菌進行接合轉(zhuǎn)移。供體菌和受體菌分別接種于含有卡拉霉素(Kan，100μg/mL)和奈碇酸(NaL，40μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜后收集菌體，并用LB培養(yǎng)基重懸菌體，各取100μL細菌懸液混合，于無抗生素的LB平板上過夜培養(yǎng)。收集菌體系列稀釋后，取適量菌液涂布于含卡那霉素(Kan，100μg/mL)和萘啶酸 (NaL，40μg/ml)的雙抗平板上，篩選陽性克隆單整合菌株。將整合菌株置于含有5％蔗糖的平板進行篩選，帶有sacB片段的整合株無法在該平板上生長，而長出來的菌落都是發(fā)生了染色體內(nèi)重組，從而去掉了載體序列(包括sacB片段)的重組菌株。

重組有兩種情況，其中50％的可能性產(chǎn)生敲除株，50％的可能性產(chǎn)生野生親本株。根據(jù)GeneBank上已發(fā)表的腸炎沙門菌基因組序列，設(shè)計一對引物sopB-1/sopB-2，sopB-1的序列如SEQ ID NO.13所示，sopB-2序列如SEQ ID NO.14所示，通過PCR方式篩選鑒定敲除株。PCR反應(yīng)體系同前，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸2.5min，共25個循環(huán)；最后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)結(jié)束，1.0％瓊脂糖凝膠檢測，如圖7，敲除株擴增出一個條帶，位于379bp左右，野生株擴增出一個條帶，位于2065bp左右。將敲除株的PCR擴增產(chǎn)物送至大連寶生工生物工程有限公司進行序列測定,測序結(jié)果表明又成功敲除掉sopB基因的1686bp序列，將該雙基因敲除菌株命名為D316。

實施例4細菌在體內(nèi)定殖清除

雙基因敲除突變菌株D316和野生菌株分別接種LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，2％接種新鮮LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.7，將菌液于10000g離心5min，重懸于滅菌PBS，將細菌濃度調(diào)節(jié)到10⁸CFU/mL。

1日齡海蘭白雛雞隨機分成3組，每組20只。其中1組口服1×10⁷CFU/0.1mL突變菌株D316，1組口服1×10⁷CFU/0.1mL野生菌株，1組口服0.1mLPBS作為對照組。分別于免疫后1周、2周、3周、4周隨機剖殺各免疫組和對照組雞各5只，無菌采取肝臟、脾臟和盲腸，稱重，無菌PBS研磨后分2份，其中1份適當(dāng)稀釋后涂布沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)后計數(shù)；另一份做增菌培養(yǎng)后，涂布沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板，PCR確定。

細菌在體內(nèi)定殖清除情況見表2。接種后的第1、2、3、4周，對照組雞肝臟、脾臟和盲腸均未檢出沙門氏菌，突變菌在肝臟、脾臟和盲腸中都最終被完全清除，野生株在在肝臟、脾臟和盲腸中的數(shù)量顯著高于對照組，第四周時宿主仍不能完全清除。

表2接種D316后各內(nèi)臟器官的菌株分布(mean±SEM log10cfu/g)

實施例5免疫保護性

40只雌性1日海蘭白雛雞，隨機分為2組，每組20只。其中1組在1日齡和5周齡時分別口服1×10⁷CFU/0.1mL突變菌株D316，另1組在1日齡和5周齡時分別口服0.1mLPBS作為對照組。在9周齡時，兩組雞都口服1×10⁹CFU/0.2mL野生菌株進行攻毒。分別于攻毒后1周、2周、隨機剖殺各免疫組和對照組雞各10只，無菌采取肝臟、脾臟和盲腸，稱重，無菌PBS研磨后分2份，其中1份適當(dāng)稀釋后涂布沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)后計數(shù)；另一份做增菌培養(yǎng)后，涂布沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板，PCR確定。

保護率及攻毒菌株在體內(nèi)定殖清除情況見表3。接種后的第1、2周，免疫組內(nèi)臟器官攜帶攻毒菌株的雞只數(shù)都低于對照組，說明缺失株免疫后能降低雞只腸炎沙門菌的帶菌率。同時，免疫組在肝臟、脾臟和盲腸的帶菌量也低于對照組，說明所構(gòu)建的缺失株能提供良好的免疫保護效果。

表3攻毒保護率及各內(nèi)臟器官的菌株分布(mean±SEM log10cfu/g)

實施例6腸炎沙門氏菌疫苗

根據(jù)上述實施例驗證結(jié)果，本發(fā)明敲除雙基因的缺失腸炎沙門氏菌具有優(yōu)異的免疫保護效果，且在體內(nèi)能夠定殖清除掉，可以作為疫苗使用，進一步，本實施例提供一種腸炎沙門氏菌口服疫苗，其組分包括本發(fā)明敲除rfaH基因和sopB基因的雙基因缺失沙門氏菌，所述雙基因缺失沙門氏菌在所述口服疫苗中的濃度可以為1×10⁷CFU/0.1mL。

最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。

<110> 重慶理工大學(xué)；

<120> 一種雙基因缺失腸炎沙門氏菌、其構(gòu)建方法及含有該雙基因缺失腸炎沙門氏菌的疫苗；

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rfaH基因的核苷酸序列

<400> 1

atgcaatcct ggtatttact gtactgcaaa cgcgggcaac ttcagcgtgc tcaggaacac 60

ctcgaaagac aagcggtaag ttgcctgaca ccgatgatca ccctggaaaa aatggtacgc 120

ggaaaacgta cctccgtcag cgaaccgctc tttcctaatt atctgttcgt tgaatttgat 180

ccggaagtga tacataccac tacaatcaac gccacgcgcg gcgtcagcca ttttgtgcgc 240

tttggcgcgc atcctgcgat cgtgccttcc agcgttattc atcagctttc tatctacaag 300

cccgaaggcg ttgtcgatcc tgaaaccccc tatcccggcg atagcgtcat catcacggaa 360

ggcgcatttg aagggctgaa agcgattttt accgaaccgg atggcgaaac gcgttcgatg 420

ttactgctta atttactcaa taaagaagtg aagcagagcg taaaaaacac cggttttcgc 480

aagatttag 489

<210> 2

<211> 1686

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sopB基因的核苷酸序列

<400> 2

atgcaaatac agagcttcta tcactcagct tcactaaaaa cccaggaggc ttttaaaagc 60

ctacaaaaaa ccttatacaa cggaatgcag attctctcag gccagggcaa agcgccggct 120

aaagcgcccg acgctcgccc ggaaattatt gtcctgcgag aacctggcgc gacatggggg 180

aattatctac agcatcagaa gacgtctaac cactcgctgc ataacctcta taacttacag 240

cgcgatcttc ttaccgtcgc ggcaaccgtt ctgggtaaac aagacccggt tctaacgtca 300

atggcaaacc aaatggagtt agccaaagtt aaagcggacc ggccagcaac aaaacaagaa 360

gaagccgcgg caaaagcatt gaagaaaaat cttatcgaac ttattgcagc acgcactcag 420

cagcaggatg gcttacctgc aaaagaagct catcgctttg cggcagtagc gtttagagat 480

gctcaggtca agcagcttaa taaccagccc tggcaaacca taaaaaatac actcacgcat 540

aacgggcatc actataccaa cacgcagctc cctgcagcag agatgaaaat cggcgcaaaa 600

gatatctttc ccagtgctta tgagggaaag ggcgtatgca gttgggatac caagaatatt 660

catcacgcca ataatttgtg gatgtccacg gtgagtgtgc atgaggacgg taaagataaa 720

acgctttttt gcgggatacg tcatggcgtg ctttccccct atcatgaaaa agatccgctt 780

ctgcgtcacg tcggcgctga aaacaaagcc aaagaagtat taactgcggc actttttagt 840

aaacctgagt tgcttaacaa agccttagcg ggcgaggcgg taagcctgaa actggtatcc 900

gtcgggttac tcaccgcgtc gaatattttc ggcaaagagg gaacgatggt cgaggaccaa 960

atgcgcgcat ggcaatcgtt gacccagccg ggaaaaatga ttcatttaaa aatccgcaat 1020

aaagatggcg atctacagac ggtaaaaata aaaccggacg tcgccgcatt taatgtgggt 1080

gttaatgagc tggcgctcaa gctcggcttt ggccttaagg catcggatag ctataatgcc 1140

gaggcgctac atcagttatt aggcaatgat ttacgccctg aagccagacc aggtggctgg 1200

gttggcgaat ggctggcgca atacccggat aattatgagg tcgtcaatac attagcgcgc 1260

cagattaagg atatatggaa aaataaccaa catcataaag atggcggcga accctataaa 1320

ctcgcacaac gccttgccat gttagcccat gaaattgacg cggtacccgc ctggaattgt 1380

aaaagcggca aagatcgtac aggaatgatg gattcagaaa tcaagcgaga gcacatttct 1440

ttacatcaga cccatatgtt aagtgcgcct ggtagtcttc cggatagcgg tggacagaaa 1500

attttccaaa aagtattact gaatagcggt aacctggaga ttcagaaaca aaatacgggc 1560

ggggcgggaa acaaagtaat gaaaaattta tcgccagagg tgctcaatct ttcctatcaa 1620

aaacgagttg gggatgaaaa tatttggcag tcagtaaaag gcatttcttc attaatcaca 1680

tcttga 1686

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rfaH-1F的核苷酸序列

<400> 3

gaagatctgc aaaggcatac tccgacagag ta 32

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rfaH-1R的核苷酸序列

<400> 4

gttataaatt tggagtgtga aggttattgc gtgaatgact cttatccgct tgttcgg 57

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rfaH-2F的核苷酸序列

<400> 5

cacgcaataa ccttcacact ccaaatttat aacctatcgt tcagaatacg acctcaaat 59

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rfaH-2R的核苷酸序列

<400> 6

gaagatctga aattggcgtt ttctgctcac gc 32

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rfaH-1的核苷酸序列

<400> 7

ttgcacagca ccggcatggc g 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rfaH-2的核苷酸序列

<400> 8

aacgacgcgg gcttgagcta cg 22

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sopB-1F的核苷酸序列

<400> 9

gaagatctgc agcagtataa gatggagcag ag 32

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sopB-1R的核苷酸序列

<400> 10

gttataaatt tggagtgtga aggttattgc gtgagcgttt ttaatattcc tgaataggg 59

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sopB-2F的核苷酸序列

<400> 11

cacgcaataa ccttcacact ccaaatttat aacgtcttga ggtaactata tggaaagtc 59

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sopB-2R的核苷酸序列

<400> 12

gaagatctgt accggccgca tgcaaatatc 30

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sopB-1的核苷酸序列

<400> 13

atgctgcaaa gtcaggatgt cgtc 24

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sopB-2的核苷酸序列

<400> 14

tgtaccgatc tcccccatga tcg 23