本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及優(yōu)化信號(hào)肽以提高重組腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表達(dá)的方法。

背景技術(shù)：

腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis，Nm)是一種致病性革蘭氏陰性菌，主要引起兒童細(xì)菌性腦脊髓膜炎和敗血癥，是嚴(yán)重威脅人類健康的病原體，致病性腦膜炎球菌主要有A、B、C、Y、W135五個(gè)血清群，其中A、C、Y、W135群以莢膜多糖為抗原研制出了有效的疫苗來預(yù)防相應(yīng)血清型腦膜炎奈瑟菌所引發(fā)的腦膜炎，但是由于B型腦膜炎球菌莢膜多糖和人神經(jīng)細(xì)胞的粘附分子同源，免疫原性很低，不適合用于疫苗的制備，因此，B群腦膜炎奈瑟菌的非莢膜多糖抗原疫苗研制也就成為了關(guān)注的重點(diǎn)。

目前有一些候選抗原如外膜囊泡、外膜蛋白比較受到關(guān)注，其中外膜脂蛋白2086(LP2086)又稱H因子結(jié)合蛋白(Factor H-binding Protein,fHBP)，是一個(gè)分子量為28KD的保守蛋白，表達(dá)于所有腦膜炎奈瑟菌表面且能夠產(chǎn)生殺菌抗體而成為了最有希望的抗原。H因子(fH)是補(bǔ)體替代途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子，它在因子I介導(dǎo)的C3b裂解為滅活片段iC3b過程中發(fā)揮輔助因子作用，也促進(jìn)替代途徑c3轉(zhuǎn)化酶C3bBb的衰變。fH通過和fHBP結(jié)合可下調(diào)補(bǔ)體的激活性以逃避補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷作用。通過fH與細(xì)菌表面結(jié)合這個(gè)重要機(jī)制，病原體在未經(jīng)免疫的人血清或血液中存活并逃避先天性宿主防御。在疫苗中加入fHBP成分也許可以收到雙重的功效，它不僅可以誘發(fā)殺菌的抗體，還可以通過阻斷fH結(jié)合到細(xì)菌表面來提高細(xì)菌對(duì)宿主殺傷作用的敏感性。Novartis公司以fHBP、NadA和PorA免疫原組成的4CmenB疫苗于2013年11月被歐盟批準(zhǔn)用于2個(gè)月以上的人群使用，Pfizer公司由兩種fHBP變體型組成的B群腦膜炎疫苗于2014年10月通過美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于10至25歲人群。但由于腦膜炎球菌僅表達(dá)微量的fHBP蛋白，通過在大腸桿菌中以重組蛋白的形式表達(dá)fHBP能夠在一定程度上增加其表達(dá)量，然而重組蛋白形式的fHBP的表達(dá)量依然較低，不能獲得足夠的蛋白滿足后續(xù)研發(fā)需求，所以提高其表達(dá)效率以滿足研究和生產(chǎn)的需要的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于目前技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明提供提高重組腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表達(dá)的方法，本發(fā)明通過分別更換了P4外膜蛋白(Haemophilus influenza P4protein，P4)信號(hào)肽、脂蛋白-28(lipoprotein-28，LP)信號(hào)肽和主要外膜脂蛋白信號(hào)肽(major outer membrane lipoprotein，MLP)的重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP，表達(dá)量較帶原始信號(hào)肽的B群腦膜炎奈瑟菌fHBP相比分別提高了2.68+0.32、1.94+0.17和2.91+0.25倍，較好解決了fHBP蛋白表達(dá)量低的問題，為重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白的工藝研發(fā)及疫苗應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

此外，令人驚訝地，我們發(fā)現(xiàn)了用主要外膜脂蛋白信號(hào)肽替換原始信號(hào)肽比目前可用的最佳的外源信號(hào)肽P4外膜蛋白信號(hào)肽取得了更好的效果。

本發(fā)明的采用如下技術(shù)方案：

優(yōu)化信號(hào)肽提高重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表達(dá)的方法，包括以下步驟：

帶不同外源信號(hào)肽fHBP表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；

基于不同外源信號(hào)肽對(duì)fHBP蛋白表達(dá)的影響。

作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述質(zhì)粒構(gòu)建的步驟包括：

提取29315株B群腦膜炎球菌基因組，以其為模板，采用引物w468、w469PCR擴(kuò)增fHBP目的基因；

通過NdeI/EcoRI核酸內(nèi)切酶對(duì)目的基因及pET-30a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，并連接獲得帶自身信號(hào)肽的pET30-rBfHBP質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證目的基因正確性；

以pET30-rBfHBP質(zhì)粒為模板，采用引物w482、w488擴(kuò)增出的目的基因，再次以引物w483、w488進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得5’端帶有P4信號(hào)肽序列的fHBP目的基因。

作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述質(zhì)粒構(gòu)建的步驟還包括：

以pET30-rBfHBP質(zhì)粒為模板，分別采用引物w484、w488及w485、w488經(jīng)過兩次PCR，獲得5’端帶有LP信號(hào)肽的fHBP目的基因；

以pET30-rBfHBP質(zhì)粒為模板，采用w486、w488及w487、w488經(jīng)過兩次PCR擴(kuò)增，獲得帶有MLP信號(hào)肽序列的fHBP目的基因；

將上述帶不同信號(hào)肽的fHBP目的基因片段與pET-30a質(zhì)粒采用NdeI/BamHI進(jìn)行雙酶切，并連接分別獲得帶P4、LP、MLP信號(hào)肽的fHBP原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-P4SP-rBfHBP、pET30a-LPSP-rBfHBP、pET30a-MLPSP-rBfHBP，并測(cè)序驗(yàn)證其正確性。

作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述確定fHBP蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的步驟包括：

將帶自身信號(hào)肽的pET30-rBfHBP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)來確定fHBP蛋白表達(dá)條件。確定表達(dá)條件為水平搖床中，以37℃，180rpm，細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OD600＝0.6時(shí)加入終濃度為0.1mM的IPTG誘導(dǎo)2h。

將帶P4、LP、MLP三種外源信號(hào)肽的pET30a-P4SP-rBfHBP、pET30a-LPSP-rBfHBP、pET30a-MLPSP-rBfHBP表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，以上述條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)篩選表達(dá)工程菌株，；

將表達(dá)不同外源信號(hào)肽的fHBP工程菌株分別各挑取三個(gè)克隆，利用相同條件再次進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。

本發(fā)明的優(yōu)化信號(hào)肽提高重組腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表達(dá)的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、在相同條件下，更換了P4外膜蛋白信號(hào)肽、脂蛋白-28信號(hào)肽和主要外膜脂蛋白信號(hào)肽的重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP表達(dá)量較帶原始信號(hào)肽的B群腦膜炎奈瑟菌fHBP相比分別提高了2.68+0.32、1.94+0.17和2.68+0.32倍；2、提供了能夠提高fHBP蛋白表達(dá)量的信號(hào)肽，為提高B群腦膜炎奈瑟菌fHBP表達(dá)的研究及應(yīng)用提供了一種新的思路。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為帶不同信號(hào)肽的fHBP蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果本發(fā)明中帶不同信號(hào)肽fHBP蛋白的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在OD600＝0.6時(shí)加入0.1mM終濃度的IPTG分別誘導(dǎo)2h的蛋白表達(dá)情況，泳道1：蛋白marker；泳道2、3：無IPTG及加入IPTG誘導(dǎo)后帶自身信號(hào)肽fHBP蛋白表達(dá)情況；泳道4、5：無IPTG及加入IPTG誘導(dǎo)后帶P4信號(hào)肽fHBP蛋白表達(dá)情況；泳道6、7：無IPTG及加入IPTG誘導(dǎo)后帶LP信號(hào)肽fHBP蛋白表達(dá)情況；泳道8、9：無IPTG及加入IPTG誘導(dǎo)后帶MLP信號(hào)肽fHBP蛋白表達(dá)情況。

圖2為不同克隆的帶不同信號(hào)肽fHBP蛋白表達(dá)結(jié)果本發(fā)明中將表達(dá)帶外源信號(hào)肽工程菌株，分別挑取三個(gè)不同的克隆在OD600＝0.6時(shí)加入0.1mM終濃度的IPTG分別誘導(dǎo)2h蛋白表達(dá)情況，泳道1：帶自身信號(hào)肽fHBP蛋白表達(dá)情況；泳道2-4：不同克隆的帶P4信號(hào)肽fHBP蛋白表達(dá)結(jié)果；泳道5-7：不同克隆的帶LP信號(hào)肽fHBP蛋白表達(dá)結(jié)果；泳道8-10：不同克隆的帶MLP信號(hào)肽fHBP蛋白表達(dá)結(jié)果。

圖3為帶不同信號(hào)肽fHBP蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較本發(fā)明中帶不同外源信號(hào)肽的fHBP蛋白相對(duì)帶自身信號(hào)肽fHBP蛋白表達(dá)量大小比較的圖譜，其中帶自身信號(hào)肽的fHBP蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.00，帶P4信號(hào)肽的fHBP蛋白相對(duì)表達(dá)量為2.68+0.32,帶LP信號(hào)肽的fHBP蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.94+0.17,帶MLP信號(hào)肽的fHBP蛋白相對(duì)表達(dá)量為2.91+0.25。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

在本發(fā)明中，圖1和圖2為相同誘導(dǎo)條件下，帶不同信號(hào)肽的fHBP表達(dá)量比較,圖3為帶不同信號(hào)肽的fHBP相對(duì)表達(dá)量。具體情況參照以下實(shí)施例。

本發(fā)明提供的不同信號(hào)肽對(duì)重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表達(dá)的方法，包括以下步驟，

步驟S1：質(zhì)粒構(gòu)建，其中包括步驟S1a：采用Axygen試劑盒提取29315株B群腦膜炎球菌(購自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心)基因組，以B群腦膜炎球菌基因組為模板，采用引物w468、w469(表2)PCR擴(kuò)增fHBP目的基因；步驟S1b：通過NdeI/EcoRI對(duì)目的基因及pET-30a進(jìn)行雙酶切，連接獲得帶自身信號(hào)肽的pET30-rBfHBP質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證目的基因正確性；步驟S1c：以pET30-rBfHBP質(zhì)粒為模板，采用引物w482、w488擴(kuò)增出的目的基因，再次以引物w483、w488進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得5’端帶有P4信號(hào)肽序列的fHBP目的基因；

步驟S1d：以pET30-rBfHBP質(zhì)粒為模板，分別采用引物w484、w488及w485、w488經(jīng)過兩次PCR獲得5’端帶有LP信號(hào)肽的fHBP目的基因，以pET30-rBfHBP質(zhì)粒為模板，采用w486、w488及w487、w488經(jīng)過兩次PCR擴(kuò)增獲得帶有MLP信號(hào)肽序列的fHBP目的基因；將帶不同信號(hào)肽的fHBP目的基因片段與pET-30a采用NdeI/BamHI進(jìn)行雙酶切，連接獲得帶P4、LP、MLP信號(hào)肽的fHBP原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-P4SP-rBfHBP、pET30a-LPSP-rBfHBP、pET30a-MLPSP-rBfHBP，并測(cè)序驗(yàn)證其正確性。

進(jìn)一步為，將pET30a-rBfHBP、pET30a-P4SP-rBfHBP、pET30a-LPSP-rBfHBP、pET30a-MLPSP-rBfHBP四個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)。

表1不同信號(hào)肽堿基序列

步驟S2：確定fHBP蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件：其中包括步驟S2a：將帶自身信號(hào)肽的fHBP蛋白基因序列連接到載體pET-30a，其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)來確定fHBP蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件。大腸桿菌在誘導(dǎo)前實(shí)時(shí)檢測(cè)其OD值，分別取OD600值為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的時(shí)間點(diǎn)加入1mM終濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)4h，SDS-PAGE電泳比較不同OD值時(shí)誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)情況，確定最優(yōu)誘導(dǎo)OD值。根據(jù)最優(yōu)誘導(dǎo)OD值，調(diào)整IPTG濃度，按照終濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0進(jìn)行誘導(dǎo)4h，SDS-PAGE電泳比較不同濃度IPTG對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響，確定最佳IPTG濃度。再根據(jù)最佳誘導(dǎo)OD值和IPTG濃度，分別誘導(dǎo)2h、4h、6h、8h，SDS-PAGE電泳比較不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響，確定最適誘導(dǎo)時(shí)間

表2構(gòu)建質(zhì)粒引物序列

通過對(duì)帶自身信號(hào)肽的fHBP蛋白進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化，在37℃，180rpm條件下獲得最佳誘導(dǎo)條件為在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600＝0.6)加入終濃度為0.1mM的IPTG誘導(dǎo)2h獲得最高表達(dá)量。但即使在最佳誘導(dǎo)條件下，帶自身信號(hào)肽的fHBP蛋白表達(dá)量依然不是很高，成為后續(xù)蛋白純化及疫苗研發(fā)實(shí)驗(yàn)的瓶頸。

步驟S4：基于不同外源信號(hào)肽對(duì)fHBP蛋白表達(dá)的影響，其中包括步驟S4a：將帶P4、LP、MLP三種外源信號(hào)肽的fHBP蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，分別挑取克隆，鑒定無誤后，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；步驟S4b：將三種帶外源信號(hào)肽質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21感受體細(xì)胞，分別挑取三個(gè)不同的克隆，利用相同條件再次進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。

具體為，將帶P4、LP、MLP三種外源信號(hào)肽的fHBP蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化如BL21(DE3)后，分別挑取克隆，鑒定無誤后，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。37℃、180rpm于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600＝0.6，加入0.1mM終濃度的IPTG繼續(xù)37℃、180rpm誘導(dǎo)2h，SDS-PAGE電泳鑒定蛋白表達(dá)水平。使用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)對(duì)目的蛋白進(jìn)行相對(duì)定量，將帶自身信號(hào)肽的fHBP的相對(duì)表達(dá)量定為1.00，則帶P4信號(hào)肽fHBP的相對(duì)表達(dá)量為2.03，帶LP信號(hào)肽fHBP的相對(duì)表達(dá)量為1.48，帶MLP信號(hào)肽fHBP的相對(duì)表達(dá)量為2.06(圖1)。這些結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)的三種外源信號(hào)肽替換原信號(hào)肽都能夠不同程度地增加fHBP蛋白的表達(dá)量，且增加蛋白表達(dá)量水平由高到低依次為：MLP信號(hào)肽、P4信號(hào)肽、LP信號(hào)肽。

由于P4信號(hào)肽與MLP信號(hào)肽對(duì)fHBP蛋白表達(dá)增加水平相差較小，為了進(jìn)一步比較這兩種信號(hào)肽的效果同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，三種帶外源信號(hào)肽質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)大腸桿菌分別挑取三個(gè)不同的克隆，利用相同條件再次進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)水平(圖2)。使用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行相對(duì)定量，將帶自身信號(hào)肽的fHBP相對(duì)表達(dá)量定為1.00，則帶P4信號(hào)肽三個(gè)克隆的fHBP相對(duì)表達(dá)量分別為2.59、2.72、2.36，帶LP信號(hào)肽的三個(gè)克隆的fHBP相對(duì)表達(dá)量為1.77、2.09、1.95，帶MLP信號(hào)肽的三個(gè)克隆的fHBP相對(duì)表達(dá)量為2.75、3.16、2.82(圖3)。結(jié)果表明MLP信號(hào)肽增加fHBP蛋白表達(dá)程度最高。

在本發(fā)明中，fHBP蛋白作為腦膜炎球菌疫苗的重要抗原而備受關(guān)注，但是fHBP蛋白表達(dá)于腦膜炎球菌膜表面，由于空間位置有限，表達(dá)具有飽和性，因此限制了抗原的產(chǎn)量，難以純化獲得足夠量的蛋白作為疫苗抗原。因此在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白成了一個(gè)可行的策略，重組蛋白表達(dá)量的高低直接關(guān)系到后續(xù)疫苗的研發(fā)乃至最終的經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益。在大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)量較腦膜炎球菌自身表達(dá)的蛋白有了極大的提高，但是相比其他重組蛋白，fHBP重組蛋白的表達(dá)量還是很低，給后續(xù)的純化帶來一定難度，因此需要通過其他策略來增加其表達(dá)量。改造信號(hào)肽是一種有效增加重組蛋白表達(dá)量的方式，采用外源信號(hào)肽替換fHBP自身信號(hào)肽，在重組蛋白表達(dá)過程中引導(dǎo)蛋白加工分泌，從而獲得具有生物活性的重組蛋白。輝瑞公司通過將B群腦膜炎球菌fHBP蛋白自身信號(hào)肽替換為流感嗜血桿菌P4信號(hào)肽后，fHBP蛋白表達(dá)量有所提高。為了將fHBP蛋白自身信號(hào)肽替換為外源信號(hào)肽，一般將外源信號(hào)肽堿基序列添加在正向引物的5’端，但是本實(shí)驗(yàn)中需要添加的信號(hào)肽堿基序列長(zhǎng)約60bp，若直接將其添加至引物5’端給引物的合成及PCR帶來一定難度，因此采用了兩輪PCR擴(kuò)增，每輪PCR擴(kuò)增使正向引物帶上部分信號(hào)肽序列，最終獲得帶完整外源信號(hào)肽的fHBP基因。將B群fHBP蛋白自身信號(hào)肽替換為大腸桿菌主要膜蛋白(MLP)信號(hào)肽及脂蛋白(LP-28)信號(hào)肽后，與fHBP自身信號(hào)肽進(jìn)行比較，均增加了蛋白的表達(dá)量，同時(shí)替換為MLP信號(hào)肽后fHBP的表達(dá)量比替換為P4信號(hào)肽表達(dá)量還略高(表3)，這表明MLP很可能是另一個(gè)能夠增加fHBP表達(dá)量且能運(yùn)用于研發(fā)的信號(hào)肽。

表3不同信號(hào)肽氨基酸序列及其對(duì)fHBP蛋白表達(dá)的影響

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的技術(shù)人員在本發(fā)明公開的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。