本發(fā)明屬于腫瘤研究領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)涉及分離和檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的新方法，其是一種不依賴(lài)于血液細(xì)胞腫瘤標(biāo)志物的方法。

背景技術(shù)：

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTC)是指從腫瘤上脫落并進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞。隨著腫瘤細(xì)胞的不斷增殖，部分細(xì)胞可以通過(guò)分泌一種抑制黏附因子表達(dá)的物質(zhì)，增加其運(yùn)動(dòng)能力并使之與腫瘤母體脫離，這些脫落的腫瘤細(xì)胞再分泌一種蛋白溶解酶，以破壞周邊宿主結(jié)締組織并進(jìn)入脈管系統(tǒng)。診療操作也可使腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散進(jìn)入外周血循環(huán)。

最近的研究認(rèn)為CTC含有能夠引發(fā)轉(zhuǎn)移性腫瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞，是大多數(shù)癌癥的死亡原因。腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移涉及了多個(gè)過(guò)程，包括局部腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移并進(jìn)入淋巴系統(tǒng)或血液循環(huán)系統(tǒng)(血管內(nèi))，在循環(huán)過(guò)程中存活，外滲到遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，最后發(fā)展成病灶。對(duì)CTC細(xì)胞進(jìn)行分析有助于我們理解腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。CTC同時(shí)也可以作為個(gè)體化治療的重要的標(biāo)志物。CTC技術(shù)可以運(yùn)用于包括預(yù)測(cè)癌癥患者的臨床結(jié)果，潛在轉(zhuǎn)移早期診斷，監(jiān)測(cè)治療效果。然而，癌癥患者每毫升血液中含有數(shù)十億個(gè)紅細(xì)胞和數(shù)百萬(wàn)個(gè)白細(xì)胞，只含有1～10個(gè)的CTC細(xì)胞，CTC細(xì)胞的數(shù)量如此之低使得分離和分析這些細(xì)胞成為一種挑戰(zhàn)。

分離富集CTC最常見(jiàn)的方法是利用腫瘤細(xì)胞表達(dá)的上皮細(xì)胞標(biāo)志物(如上皮細(xì)胞黏附分子EpCAM)和抗體來(lái)捕獲和選擇。Veridex公司的CellSearch是FDA批準(zhǔn)的唯一一種CTC臨床檢測(cè)系統(tǒng)，它能有效定義上皮來(lái)源的CTC，即EpCAM、DAPI和細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性，而CD45陰性。CellSearch是基于陽(yáng)性選擇，利用抗體包被的磁珠來(lái)捕獲EpCAM陽(yáng)性的細(xì)胞，然后成像并計(jì)數(shù)。CellSearch被FDA批準(zhǔn)用于對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌進(jìn)行治療監(jiān)測(cè)。

另外，ScreenCell系統(tǒng)是一種可一次性利用腫瘤細(xì)胞的大小對(duì)其進(jìn)行分離的過(guò)濾裝置。此過(guò)濾裝置利用膜原理對(duì)全血中體積較大的CTC進(jìn)行截留，而將非腫瘤細(xì)胞濾過(guò)除去。

然而，與腫瘤細(xì)胞本身一樣，CTC細(xì)胞是一個(gè)高度異質(zhì)的群體，一些CTC有能力產(chǎn)生新的腫瘤，而另一些則沒(méi)有；一些CTC表現(xiàn)出腫瘤干細(xì)胞的特性，而另一些則不是。CTC會(huì)發(fā)生一些上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)和細(xì)胞大小的變化，因此，這些方法不能檢測(cè)到所有的CTC。更加重要的是，一些CTC可能來(lái)自機(jī)械脫落而不是主動(dòng)侵襲，以及一些CTC可能失去生存能力或功能，因此與腫瘤轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，因此，這些方法計(jì)算的CTC細(xì)胞數(shù)不能準(zhǔn)確地反應(yīng)癌癥的預(yù)后和治療效果。

另一種實(shí)用的CTC分離方法是通過(guò)膠原粘附基質(zhì)檢測(cè)，可以檢測(cè)和分離具有侵襲表型的CTC。這種方法是基于腫瘤細(xì)胞附著和攝取膠原蛋白的粘附基質(zhì)的能力。然而，該方法并非基于實(shí)際的遷移或侵襲，因此，并不能確定分離得到的細(xì)胞具有真實(shí)的侵襲能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有方法的局限性，我們基于腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力以及能夠進(jìn)入血液循環(huán)的能力開(kāi)發(fā)了一種CTC的分離和檢測(cè)的新方法。

本發(fā)明的第一方面提供了一種CTC分離方法。

本發(fā)明的CTC分離方法包括以下步驟：

(1)通過(guò)密度梯度離心從血液樣本中富集單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)；

(2)對(duì)富集的PBMC進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)，收集具有侵襲性的細(xì)胞；

(3)對(duì)步驟(2)收集到的細(xì)胞進(jìn)行染色和分選。

在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，步驟(1)中密度梯度離心使用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行；優(yōu)選地，富集的PBMC用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗、重懸；更優(yōu)選地，所述無(wú)血清培養(yǎng)基為RPMI-1640。

在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，步驟(2)中侵襲實(shí)驗(yàn)為T(mén)ranswell小室侵襲實(shí)驗(yàn)；優(yōu)選地，所述侵襲實(shí)驗(yàn)為富集的PBMC對(duì)Matrigel的侵襲實(shí)驗(yàn)。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(2)中所述侵襲實(shí)驗(yàn)包括如下步驟：

a)在Transwell小室的內(nèi)室中鋪上一層Matrigel，37℃放置至少1小時(shí)以使其凝固；

b)把PBMC懸液加入Transwell小室的內(nèi)室中，在外室加入含血清培養(yǎng)基(優(yōu)選含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基)，置于5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)3～5天；

c)拿出培養(yǎng)盤(pán)，取出Transwell小室，小心棄掉內(nèi)室中的培養(yǎng)基，并用濕潤(rùn)的棉簽去除內(nèi)室上表面的細(xì)胞和Matrigel，收集內(nèi)室下表面的細(xì)胞。

在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，步驟(3)中對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行DAPI染色，并通過(guò)抗細(xì)胞角蛋白抗體和抗CD45抗體進(jìn)行細(xì)胞染色，選擇DAPI染色陽(yáng)性、細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性且CD45陰性的細(xì)胞；優(yōu)選地，細(xì)胞分選通過(guò)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行。

本發(fā)明的方法分離得到的CTC是具有侵襲性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，可進(jìn)一步用于腫瘤轉(zhuǎn)移研究等。

本發(fā)明的第二方面提供了一種CTC檢測(cè)方法。

本發(fā)明的CTC檢測(cè)方法包括以下步驟：

(1)通過(guò)密度梯度離心從血液樣本中富集單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)；

(2)對(duì)富集的PBMC進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)，收集具有侵襲性的細(xì)胞；

(3)對(duì)步驟(2)收集到的細(xì)胞進(jìn)行染色和計(jì)數(shù)。

在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，步驟(1)中密度梯度離心使用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行；優(yōu)選地，富集的PBMC用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗、重懸；更優(yōu)選地，所述無(wú)血清培養(yǎng)基為RPMI-1640。

在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，步驟(2)中侵襲實(shí)驗(yàn)為T(mén)ranswell小室侵襲實(shí)驗(yàn)；優(yōu)選地，所述侵襲實(shí)驗(yàn)為富集的PBMC對(duì)Matrigel的侵襲實(shí)驗(yàn)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(2)中所述侵襲實(shí)驗(yàn)包括如下步驟：

a)在Transwell小室的內(nèi)室中鋪上一層Matrigel，37℃放置至少1小時(shí)以使其凝固；

b)把PBMC懸液加入Transwell小室的內(nèi)室中，在外室加入含血清培養(yǎng)基(優(yōu)選含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基)，置于5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)3～5天；

c)拿出培養(yǎng)盤(pán)，取出Transwell小室，小心棄掉內(nèi)室中的培養(yǎng)基，并用濕潤(rùn)的棉簽去除內(nèi)室上表面的細(xì)胞和Matrigel。

在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，步驟(3)中對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行DAPI染色，并通過(guò)抗細(xì)胞角蛋白抗體和抗CD45抗體進(jìn)行細(xì)胞染色，對(duì)DAPI染色陽(yáng)性、細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性且CD45陰性的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；優(yōu)選地，細(xì)胞計(jì)數(shù)通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行；更優(yōu)選地，染色和計(jì)數(shù)直接在Transwell小室的內(nèi)室下表面進(jìn)行。

本發(fā)明的CTC檢測(cè)方法不僅可以用于腫瘤轉(zhuǎn)移研究，還可以用于癌癥的預(yù)后及治療效果評(píng)估。

本發(fā)明的有益效果為：

1.本發(fā)明的方法不僅依靠細(xì)胞表面標(biāo)記的檢測(cè)，還基于CTC功能進(jìn)行分離和檢測(cè)，因而不受CTC異質(zhì)性的影響，分離得到的CTC均為具有侵襲能力的腫瘤細(xì)胞。

2.相比現(xiàn)有技術(shù)中的最常用的免疫磁珠篩選方法(例如CellSearch)，本發(fā)明的方法能夠分離得到更多的具有侵襲能力的CTC。

3.本發(fā)明的CTC分離和檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，不需要特殊的儀器，既可以在實(shí)驗(yàn)室中用于腫瘤轉(zhuǎn)移研究，也可以將CTC檢測(cè)作為癌癥的預(yù)后和治療效果的生物標(biāo)志物液體活檢。

附圖說(shuō)明

圖1 CTC侵襲實(shí)驗(yàn)(CICA)方法示意圖。三個(gè)步驟：I.密度梯度離心富集單個(gè)核細(xì)胞；II.富集的單個(gè)核細(xì)胞對(duì)Matrigel的侵襲實(shí)驗(yàn)；III.免疫染色并在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。

圖2 CICA檢測(cè)CTC細(xì)胞。對(duì)照裸鼠(Control組)或移植A549的小鼠(Tumor組)的血液樣品都用CICA方法分析。細(xì)胞核用DAPI染色(藍(lán)色)。GFP陽(yáng)性細(xì)胞(綠色)、細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性細(xì)胞(紅色)和CD45陽(yáng)性細(xì)胞(紅色)都是在熒光顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

圖3 CICA方法的變異系數(shù)。3只肺腫瘤轉(zhuǎn)移的小鼠血液被平均分為3份并同時(shí)進(jìn)行CICA分析。平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差都標(biāo)注在圖中。

圖4 CICA方法檢測(cè)晚期癌癥患者CTC。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1移植異種腫瘤的小鼠CTC的檢測(cè)

為了開(kāi)發(fā)基于細(xì)胞侵襲能力的CTC分離和檢測(cè)方法，我們首先建立了具有轉(zhuǎn)移性腫瘤的小鼠模型。A549是一種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，能夠穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(GFP)和熒光素酶(Luc)，被用來(lái)在裸鼠的側(cè)翼生成腫瘤。當(dāng)側(cè)翼腫瘤達(dá)到直徑1厘米時(shí)進(jìn)行手術(shù)切除，60～70％的小鼠術(shù)后3個(gè)月出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移。

在手術(shù)后3個(gè)月進(jìn)行全血收集。使用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液對(duì)全血進(jìn)行密度梯度離心，收集單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用無(wú)血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基清洗、重懸PBMC。

對(duì)富集的PBMC進(jìn)行Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前在Transwell小室的內(nèi)室中鋪上一層Matrigel，在37℃放置至少1小時(shí)以使其凝固。然后把PBMC懸液加入Transwell小室的內(nèi)室中，在外室加入含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，放入5％CO₂培養(yǎng)箱中37℃進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)3～5天后，拿出培養(yǎng)盤(pán)，取出Transwell小室，小心棄掉內(nèi)室中的培養(yǎng)基，并用濕潤(rùn)的棉簽去除內(nèi)室上表面的細(xì)胞和Matrigel。

對(duì)Transwell小室下表面的細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色并在熒光顯微鏡下觀察。侵襲性細(xì)胞在熒光顯微鏡下可以很直觀地觀察到，并對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(參見(jiàn)圖2第2列)。雖然沒(méi)有經(jīng)過(guò)腫瘤細(xì)胞注射的小鼠(Control組)也能夠檢測(cè)到少量單個(gè)核細(xì)胞(參見(jiàn)圖2Control組第1列DAPI染色結(jié)果)，但是這些細(xì)胞都不是GFP陽(yáng)性細(xì)胞，而在移植有腫瘤的小鼠的血液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞中可以檢測(cè)到GFP陽(yáng)性細(xì)胞(參見(jiàn)圖2 Tumor組第2列)。

為了確定這些GFP陽(yáng)性細(xì)胞是否是上皮細(xì)胞，我們對(duì)這些侵襲細(xì)胞進(jìn)行抗細(xì)胞角蛋白抗體和CD45抗體染色，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞都是細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性和CD45陰性的，說(shuō)明這些細(xì)胞都是腫瘤細(xì)胞。而且，移植腫瘤的小鼠的所有細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性細(xì)胞都為GFP陽(yáng)性細(xì)胞，而在對(duì)照組小鼠中沒(méi)有檢測(cè)到細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性細(xì)胞(參見(jiàn)圖2)。

我們稱(chēng)這種細(xì)胞侵襲的CTC檢測(cè)方法為“CICA”。我們通過(guò)CICA方法從3只接種了A549的小鼠血液中分離CTC，并通過(guò)分離得到的CTC細(xì)胞數(shù)來(lái)分析CICA方法的變異系數(shù)。每一只小鼠的血樣平均分成3份并分別做CICA，結(jié)果變異系數(shù)小于15％(參見(jiàn)圖3)，這表明，CICA的方法分離具有侵襲能力的CTC結(jié)果是一致的。

實(shí)施例2 CICA檢測(cè)CTC與浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

為了證明CICA的效用性，我們?cè)谠S多對(duì)照和A549移植瘤裸鼠上用CICA做檢測(cè)。收集各移植腫瘤小鼠和對(duì)照小鼠的全血并用CICA的方法對(duì)CTC進(jìn)行檢測(cè)。我們?cè)趯?duì)照組小鼠中沒(méi)有檢測(cè)到細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性的CTC。相反，大多數(shù)移植腫瘤的小鼠的血液樣本中含有22～78個(gè)具有侵襲能力GFP陽(yáng)性的CTC(表1)。更有趣的是，一些移植腫瘤的小鼠沒(méi)有檢測(cè)到遷移的CTC(表1)。這些結(jié)果表明，CICA分離到的CTC與轉(zhuǎn)移相關(guān)。

表1不同小鼠的CICA檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例3 CICA與基于EpCAM的方法的比較

目前，CTC最常見(jiàn)的分離方法是利用CTC胞上皮標(biāo)志物來(lái)進(jìn)行的免疫磁珠分選。為了比較這兩種方法，我們把移植A549的腫瘤小鼠的血液分成兩份，并分別用這兩種方法來(lái)分離CTC。結(jié)果表明，EpCAM免疫磁珠方法比CICA方法分離得到的CTC細(xì)胞多了40％以上(參見(jiàn)表2)。

然而，當(dāng)免疫磁珠方法篩選得到的CTC進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，只有約50％的細(xì)胞顯示了侵襲能力。更有趣的是，免疫磁珠法篩選得到的侵襲細(xì)胞比直接用CICA方法分離的要少。由于免疫磁珠法篩選不會(huì)影響細(xì)胞的侵襲能力，這些結(jié)果表明，雖然以抗EpCAM抗體為基礎(chǔ)的免疫選擇篩選得到的CTC更多，但是其中有許多是不具有侵襲能力的，并且還有一些具有侵襲能力的CTC沒(méi)檢測(cè)到。

表2 CICA法與EpCAM選擇法的比較

實(shí)施例4晚期癌癥患者的CTC細(xì)胞檢測(cè)

為了測(cè)試CICA是否能夠檢測(cè)人類(lèi)CTC，我們用CICA方法對(duì)許多種晚期癌癥患者的血樣進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用正常健康人的血樣做為對(duì)照。無(wú)論腫瘤類(lèi)型，利用CICA方法分離得到的癌癥患者血液中的CTC顯示為細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性和CD45陰性(參見(jiàn)圖4)。在正常健康人血液中不能檢測(cè)到CTC，而在癌癥患者中檢測(cè)到的CTC數(shù)量可變(參見(jiàn)表3)。這些數(shù)據(jù)表明，CICA方法可以用來(lái)分離人類(lèi)的CTC。

表3.正常健康人和癌癥患者用CICA法計(jì)算的CTC細(xì)胞數(shù)