本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種高效介導(dǎo)T1R2基因過表達慢病毒載體和慢病毒及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：味覺功能學(xué)研究表明，甜味主要由味覺細胞的G蛋白偶聯(lián)受體(Gproteincoupledreceptors，GPCRs)家族所介導(dǎo)，即味覺受體第1家族(tastereceptorfamily1members，T1Rs)。其中T1R2和T1R3是甜味受體，它們以T1R2+T1R3異二聚體的形式發(fā)揮作用，共同對甜味進行識別。甜味受體在結(jié)合配體后，下游G蛋白被激活，其α亞基與β、γ亞基分離，Gα亞基進入胞漿進而激活下游效應(yīng)器，最終導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣離子濃度升高。因此，通過構(gòu)建共表達T1R2、T1R3和Gα基因的細胞系，可用鈣流檢測方法對甜味物質(zhì)進行識別。構(gòu)建共表達T1R2、T1R3和Gα基因的細胞系，需要使用到帶有T1R2基因的過表達載體?，F(xiàn)有的方法采用的是將整合有T1R2基因的質(zhì)粒載體通過脂質(zhì)體對宿主細胞進行轉(zhuǎn)染，但是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)染效率較低，要構(gòu)建能穩(wěn)定共表達T1R2、T1R3和Gα三種基因的細胞系成功率也較低。因此，如何提高T1R2基因過表達載體的轉(zhuǎn)染效率是目前亟需解決的問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種T1R2基因過表達慢病毒載體、慢病毒、宿主細胞及其構(gòu)建方法。該方法所構(gòu)建的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染效率高，并能將T1R2基因整合到宿主細胞的基因組中，因此能特異、持續(xù)、高效地促進T1R2基因在宿主細胞中的穩(wěn)定表達。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種高效介導(dǎo)T1R2基因過表達慢病毒載體，以pCDH-CMV-MCS-SV40-Neo慢病毒表達載體為基礎(chǔ)進行構(gòu)建，并整合有T1R2基因，得到T1R2基因過表達慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-SV40-Neo-T1R2。本發(fā)明還提供上述pCDH-CMV-MCS-SV40-Neo-T1R2慢病毒表達載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：步驟(1)，人工合成T1R2基因；步驟(2)，以下列PCR擴增引物進行T1R2基因的PCR擴增：所述的PCR擴增引物為：T1R2-F：agattctagagctagcaccaccatggatggggcccagggcaaag；T1R2-R：accctaactgacacacggatccctagtccctcctcatggtg；步驟(3)，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI分別對T1R2基因的PCR產(chǎn)物和慢病毒表達載體pCDH-CMV-MCS-SV40-Neo進行雙酶切；步驟(4)，用T4DNA連接酶將酶切的得到的線性化的T1R2基因和酶切慢病毒表達載體得到的產(chǎn)物進行連接，將得到的連接液轉(zhuǎn)化EcoliXL1-BLUEMRF’感受態(tài)細胞，并進行PCR鑒定，對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和比對，比對正確的克隆即為構(gòu)建成功的T1R2基因過表達慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-SV40-Neo-T1R2；其中，步驟(4)PCR鑒定采用的PCR擴增引物與步驟(2)所采用的PCR擴增引物相同。步驟(4)測序所用引物為：CMV-F：cgcaaatgggcggtaggcgtg；SV40-R：ctggggactttccacacctg；T1R2seq1：cagctgatgctgcacttc；T1R2seq2：agctgcttgaggagatctg；本發(fā)明另外提供一種T1R2慢病毒的構(gòu)建方法，采用上述T1R2基因過表達慢病毒載體，方法是：使用慢病毒包裝質(zhì)粒pLP/VSVG、pLP1和pLP2對T1R2基因過表達慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-SV40-Neo-T1R2進行包裝，通過轉(zhuǎn)染HEK293細胞，得到T1R2基因過表達慢病毒。本發(fā)明還要求保護上述T1R2慢病毒的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的T1R2慢病毒。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：本發(fā)明所構(gòu)建的T1R2基因過表達慢病毒載體對宿主細胞的轉(zhuǎn)染效率高達80％～90％，比起現(xiàn)有的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率提高了1倍以上。此外由于慢病毒能將T1R2基因整合到宿主細胞的基因組中，因此使用該方法能特異、持續(xù)、高效地促進基因T1R2在宿主細胞中的穩(wěn)定表達。過表達T1R2基因的細胞可用于構(gòu)建共表達T1R2、T1R3和Gα基因的細胞系，可用鈣流檢測方法對甜味物質(zhì)進行識別。附圖說明圖1是pCDH-CMV-MCS-SV40-Neo慢病毒表達載體圖譜；圖2是pLP/VSVG慢病毒包裝質(zhì)粒圖譜；圖3是pLP1慢病毒包裝質(zhì)粒圖譜；圖4是pLP2慢病毒包裝質(zhì)粒圖譜。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。主要實驗試劑及廠家：1)限制性內(nèi)切酶(Thermoscientific)2)DNA連接酶(Thermoscientific)3)DNA回收試劑盒(美基生物)4)PrimeSTARMaxPremix(2X)(Takara)5)T4DNA連接酶(ThermoScientific)6)EcoliXL1-BLUEMRF’感受態(tài)細胞(Stratagene)7)FItran：慢病毒包裝專用轉(zhuǎn)染試劑(輝駿生物)8)DMEM完全培養(yǎng)基(含10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)(Gibco)9)TrizolReagent(Ambion)10)BestarTMqPCRRTKit(德國DBI)11)SybrGreenqPCRmastermix(德國DBI)pCDH-CMV-MCS-SV40-Neo，以及慢病毒包裝質(zhì)粒pLP/VSVG、pLP1和pLP2均可商購于廣州輝駿生物科技有限公司。實施例1：T1R2基因過表達慢病毒載體構(gòu)建。1、人工合成T1R2基因，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。2、使用PrimeSTAR高保真酶，以人工合成的T1R2基因為模板，通過如表1所示引物進行的PCR擴增：表1PCR反應(yīng)體系與條件如表2：表2試劑體積模板1μL上游引物(10μM)1μL下游引物(10μM)1μLPrimeSTARMax(2x)10μLddH2O7μL總體積20μLPCR程序如表3：表33、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物大小是否與預(yù)期一致，切割在瓊脂糖凝膠電泳膠中的目的片段條帶，用DNA回收試劑盒回收純化；4、用EcoRI和BamHI限制性內(nèi)切酶分別對T1R2基因的PCR產(chǎn)物和慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-SV40-Neo進行雙酶切(于37℃酶切3h)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表4：表45、瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，切割在瓊脂糖凝膠電泳膠中的T1R2基因片段條帶和線性化的慢病毒載體，用膠回收試劑盒回收DNA；6、用T4DNA連接酶于16℃水浴下，將兩種酶切產(chǎn)物進行連接，過夜。反應(yīng)如表5：表5試劑體積10XT4DNA連接酶buffer2μLT4DNA連接酶(400U/μL)1μLT1R2基因片段10μL線性化的慢病毒載體4μLddH2O3μL總體積20μL7、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞：從-80℃冰箱取出1管100μLEcoliXL1-BLUEMRF’感受態(tài)細胞，放冰上解凍(解凍至無冰狀態(tài))后，取10μL上述步驟6中的連接產(chǎn)物加到感受態(tài)細胞中混勻，靜置30min，42℃水浴熱激1min，冰上靜置2min。加LB液體培養(yǎng)基500μL，37℃振蕩培養(yǎng)1小時。3000rpm離心5min，留100μl左右上清液混勻細菌后涂到LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。8、挑取數(shù)個菌落，做菌落PCR檢測轉(zhuǎn)化子，反應(yīng)體系和條件見步驟2；9、將菌落PCR鑒定得到的陽性克隆進行測序驗證，測序引物如表6：表6實施例2：T1R2慢病毒包裝1、給匯合度達80％以上的HEK293細胞換上無抗生素培養(yǎng)基DMEM+10％(v/v)FBS，37℃、5％(v/v)CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2個小時。2、將包裝質(zhì)粒混合物(pLP/VSVG+pLP1+pLP2，各3μg)和4μgT1R2基因過表達慢病毒載體在400μL0.9％(w/v)生理鹽水中混合，并加入50μL轉(zhuǎn)染試劑Fitran，室溫靜置孵化20min后緩慢均勻滴入步驟1的含有HEK293細胞的培養(yǎng)皿中，適當搖勻；此時記為轉(zhuǎn)染開始時間。3、轉(zhuǎn)染4-6h后準備換液，倒掉舊的培養(yǎng)基后，吸取適量PBS輕輕漂洗細胞1-2次，換上含有2％(v/v)FBS的DMEM培養(yǎng)基。4、轉(zhuǎn)染后72小時收集上清，將收集到的上清于3000rpm4℃離心10min，取上清用0.45um微孔濾器過濾。5、將濾液于40mL超速離心管中，4℃，25000r/min離心20min，棄上清液。6、而后以500ul冰PBS重旋病毒沉淀于4℃溶解過夜，得到慢病毒液，即T1R2慢病毒。實施例3：細胞轉(zhuǎn)染1、在6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)HEK293細胞，待細胞完全貼壁匯合度為40％-50％后，即可進行細胞轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染前，每孔細胞換成500μL新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，并且每孔加入1μL的聚凝胺(polybrene)，放置于培養(yǎng)箱孵育1h。2、在上述6孔細胞培養(yǎng)板的2個孔中，分別加入5μL實施例2得到的T1R2慢病毒液，其中一孔細胞加10μL的空載慢病毒液(空載慢病毒液與T1R2慢病毒液的唯一區(qū)別是不含有T1R2基因，其余制備方法都相同)，另一孔做空白細胞對照，充分的搖勻后放入37℃、5％(v/v)CO2、95％相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3、轉(zhuǎn)染6小時后，吸走孔內(nèi)的培養(yǎng)基，并用PBS洗兩次；換成新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，放入37℃、5％(v/v)CO2、95％相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、待細胞生長至80％融合度時，加入40μL的G418(40mg/ml)進行藥篩(G418的終濃度為800ug/ml)；5、第二天觀察到細胞多數(shù)漂浮，去除前一天藥篩的漂浮細胞，待細胞貼壁加入40ul的G418(40mg/ml)維持；6、加藥后細胞多漂浮，每天更換完全培養(yǎng)基和40ul的G418(40mg/ml)直至空白細胞HEK293全部凋亡后，給純化后的HEK293-T1R2換上新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；7、篩選得到純化的HEK293-T1R2細胞更換上新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)進行傳代擴大培養(yǎng)，每次更換細胞培養(yǎng)基均需要加入原藥物濃的一半來維持細胞生長，即G418的終濃度為400ug/ml。實施例4：使用實時熒光定量PCR進行T1R2基因的表達檢測。1、HEK293-T1R2細胞總RNA提取：1)將10cm細胞培養(yǎng)皿中匯合度達80％的實施例3得到的HEK293-T1R2細胞用預(yù)冷PBS緩沖液洗2遍，加1mlTrizol裂解液重懸。2)接著加入0.2ml三氯甲烷，劇烈搖動10s，室溫放置3分鐘。3)4℃，12000rpm離心20min。4)將上清水相轉(zhuǎn)移至另一新的無RNA酶離心管中，并加入等體積的異丙醇，混勻，-80℃放置1h。5)4℃，12000rpm離心10min，去上清。6)加入1ml體積濃度為75％乙醇洗滌沉淀。7)4℃，5000rpm離心3min，去上清，室溫晾干。8)加入40μLRNase-free水溶解RNA。2、去基因組DNA和cDNA的合成將RNA加入到gDNA吸附柱，室溫10,000g離心1min，收集濾液即為去除基因組DNA的RNA。把RNA在65℃條件下熱變性5分鐘后，立即置于冰上冷卻。使用BestarTMqPCRRTKit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA，反應(yīng)體系如表7：表7反應(yīng)條件：37℃,15min98℃,5min4℃,保持反應(yīng)結(jié)束后，-20℃保存。3、cDNA的實時熒光定量PCR將T1R2基因和內(nèi)參基因18SrRNA的cDNA樣本分別取樣在熒光定量PCR儀上進行反應(yīng)，每個樣本設(shè)置3個平行實驗。PCR反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)體系如表8：表8熒光定量PCR使用的引物如表9：表9反應(yīng)條件為：循環(huán)結(jié)束后從60℃升高到98℃獲取熔解曲線。本發(fā)明所構(gòu)建的T1R2基因過表達慢病毒載體對宿主細胞的轉(zhuǎn)染效率高達80％～90％。實驗以18SrRNA為內(nèi)參基因，采用2-△ΔCt法進行分析，經(jīng)所構(gòu)建的pCDH-CMV-MCS-SV40-Neo-T1R2慢病毒載體轉(zhuǎn)染的HEK293細胞中T1R2基因的相對表達量是未轉(zhuǎn)入T1R2基因的HEK293細胞的5835倍。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。當前第1頁1 2 3