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一種高效介導(dǎo)Gα基因過表達(dá)的慢病毒載體和慢病毒及其構(gòu)建方法與流程

文檔序號:12457378閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種高效介導(dǎo)Gα基因過表達(dá)慢病毒載體,其特征在于以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒表達(dá)載體為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建,并整合有Gα基因,得到Gα基因過表達(dá)慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-Gα。

2.權(quán)利要求1所述的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-Gα慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法,其特征在于,包括如下步驟:

步驟(1),人工合成Gα基因;

步驟(2),以下列PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行Gα基因的PCR 擴(kuò)增:

所述的PCR擴(kuò)增引物為:

Gα-F:agattctagagctagcaccaccatggatggcccgctcgctg;

Gα-R:agatccttgcggccgctcagaagagcccacagtc;

步驟(3),用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI分別對Gα基因的PCR 產(chǎn)物和慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP進(jìn)行雙酶切;

步驟(4),用T4 DNA連接酶將酶切的得到的線性化的Gα基因和酶切慢病毒表達(dá)載體得到的產(chǎn)物進(jìn)行連接,將得到的連接液轉(zhuǎn)化Ecoli XL1- BLUE MRF’感受態(tài)細(xì)胞,并進(jìn)行PCR鑒定,對PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行測序和比對,比對正確的克隆即為構(gòu)建成功的Gα基因過表達(dá)慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-Gα;

其中,步驟(4)PCR鑒定采用的PCR擴(kuò)增引物與步驟(2)所采用的PCR擴(kuò)增引物相同。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-Gα慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法,其特征在于,步驟(4)測序所用引物為:

pCDH-CMV-F:cgcaaatgggcggtaggcgtg;

EF13:ccaacttctcggggactgtg。

4.一種Gα慢病毒的構(gòu)建方法,采用權(quán)利要求1所述的Gα基因過表達(dá)慢病毒載體,其特征在于,使用慢病毒包裝質(zhì)粒pLP/VSVG、pLP1和pLP2對Gα基因過表達(dá)慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-Gα進(jìn)行包裝、,通過轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,得到Gα慢病毒。

5.權(quán)利要求4所述的Gα慢病毒的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的Gα慢病毒。

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