本發(fā)明涉及一種絲素蛋白水凝膠，具體涉及一種可逆觸變絲素蛋白水凝膠的制備方法。

背景技術(shù)：

近年來，家蠶絲素蛋白水凝膠因其天然蛋白基材優(yōu)異的生物相容性、較低的免疫原性、低致敏性以及較好的物理機(jī)械性能，人們對(duì)其在組織修復(fù)、藥物控釋、創(chuàng)面輔料以及美容領(lǐng)域的研究報(bào)道已屢見不鮮。家蠶絲素蛋白溶液是一種動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定而熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，屬于一種半穩(wěn)定的天然高分子溶液體系。由于絲素蛋白在中性條件下所帶負(fù)電荷排斥作用以及蛋白質(zhì)表面水化層的保護(hù)作用，導(dǎo)致常溫下的布朗運(yùn)動(dòng)碰撞難以真正使得絲素分子鏈發(fā)生相互接觸產(chǎn)生交聯(lián)作用，所以常溫下的絲素蛋白溶液凝膠化是一個(gè)比較漫長(zhǎng)的過程。因此，一般高濃度溴化鋰溶出并透析后的新鮮絲素溶液的凝膠時(shí)間往往在一個(gè)月以上。

為此，人們通過許多物理或者化學(xué)的方法，實(shí)現(xiàn)了一定濃度下絲素蛋白溶液的快速凝膠化。其中有通過調(diào)節(jié)溶液pH值，或者添加多元醇、離子表面活性劑、超聲處理等物理方法破壞絲素蛋白膠粒表面水化層、離子層并改變?nèi)芤褐械挠H疏水環(huán)境的方法實(shí)現(xiàn)絲素蛋白分子鏈的接觸碰撞與自組裝的概率，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)絲素蛋白溶液的快速凝膠化。也有通過化學(xué)交聯(lián)的方法實(shí)現(xiàn)絲素蛋白分子鏈間的化學(xué)交聯(lián)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)絲素蛋白溶液的快速凝膠化。然而，無論是上述物理還是化學(xué)作用下的凝膠化都是一個(gè)單向發(fā)展的不可逆體系。

可逆凝膠體系是一種能夠響應(yīng)某種或某些刺激而循環(huán)變化粘彈性行為的一類凝膠物質(zhì)。具體表現(xiàn)為響應(yīng)刺激而表現(xiàn)出高彈性模量的凝膠與高流動(dòng)性的半凝膠液體間的智能可逆轉(zhuǎn)變，特別適合原位組織修復(fù)、藥物控釋或靶向給藥、創(chuàng)面輔料以及美容領(lǐng)域的應(yīng)用。

近年來，隨著基因工程的巨大進(jìn)步，人們已經(jīng)可利用基因工程精確定向、定量設(shè)計(jì)并翻譯出特定氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。通過定向設(shè)計(jì)多肽、蛋白親疏水鏈段或者表現(xiàn)出不同電荷鏈段的方法，人們已經(jīng)實(shí)現(xiàn)出蛋白或者多肽鏈依靠自身鏈段間的親疏水作用或靜電吸附作用而自聚集成可逆蛋白水凝膠。

絲素蛋白分子鏈中包括重鏈、輕鏈以及糖蛋白（P25鏈）。無論是重鏈、輕鏈還是P25糖蛋白鏈，都是由復(fù)雜的親水、疏水氨基酸序列組成的共聚物。為此，本發(fā)明通過去離子水浸泡再生家蠶絲素蛋白固化物的方法，萃取獲得了相比原絲素蛋白溶液親水性更強(qiáng)的絲蛋白溶液。所得的親水性絲素蛋白溶液可在相比原絲素蛋白溶液更低的濃度條件下更加快速的形成一種具備優(yōu)異機(jī)械可逆觸變絲素水凝膠。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述存在的問題，本發(fā)明提供了一種可逆觸變絲素蛋白水凝膠的制備方法。所述絲素蛋白水凝膠的制備方法快速方便，并且能夠在超低濃度下進(jìn)行制備，得到的絲素蛋白水凝膠具有顯著的可逆觸變粘彈性行為，在循環(huán)機(jī)械觸變及靜止?fàn)顟B(tài)下表現(xiàn)出可逆的凝膠與半凝膠態(tài)的轉(zhuǎn)變，能夠廣泛應(yīng)用于藥物控釋、靶向給藥、原位組織修復(fù)、創(chuàng)面輔料以及美容等領(lǐng)域。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種可逆觸變絲素蛋白水凝膠的制備方法，包括如下步驟：

（1）絲素蛋白溶液的制備：將蠶絲通過脫膠、溶解、透析處理后獲得純化的絲素蛋白溶液；

（2）絲素蛋白固化物的制備：采用流延法將純化后的絲素蛋白溶液澆注于模具中，并于恒溫恒濕條件下進(jìn)行平衡干燥，獲得絲素蛋白固化物；

（3）親水性絲素蛋白鏈段溶液的制備：在25℃~40℃水浴下，按浴比1:10~1:100，以去離子水浸泡步驟（2）中的絲素蛋白固化物1~3h，萃取其中可溶性絲素蛋白，離心取上清液即為親水性絲素蛋白鏈段溶液；

（4）可逆觸變絲素蛋白水凝膠的制備：將步驟（3）中獲得的親水性絲素蛋白鏈段溶液于20~50℃下中靜置1~6h，即得一種可逆觸變絲素蛋白水凝膠。

進(jìn)一步地，所述步驟（1）中脫膠、溶解、透析的具體方法為：按浴比1:10~1:50，將剪碎的蠶絲在濃度為0.01~0.05% w/v的碳酸鈉溶液中微沸蒸煮30~60min，重復(fù)三次，每次蒸煮后都以去離子水洗凈蠶絲表面的絲膠，將脫膠后的蠶絲于50~70℃下烘干6h以上，并于50~60℃下按浴比9:100~15:100，溶于溴化鋰溶液中，溶解后采用去離子水透析3d以上，得到純化的絲素蛋白溶液。

進(jìn)一步地，所述蠶絲為桑蠶絲、柞蠶絲、蓖麻蠶絲、天蠶絲中的一種或幾種。

進(jìn)一步地，所述溴化鋰溶液的濃度為9-10M。

進(jìn)一步地，所述步驟（2）中平衡干燥的環(huán)境溫度為22~28℃，環(huán)境濕度為60~70%，干燥時(shí)間為19h以上。

進(jìn)一步地，所述步驟（3）中離心的轉(zhuǎn)速為3000-6000r/min。

如上所述的一種可逆觸變絲素蛋白水凝膠的制備方法得到的可逆觸變絲素蛋白水凝膠。

進(jìn)一步地，所述可逆觸變絲素蛋白水凝膠含固量最低可至0.2% w/v。

本發(fā)明的有益效果在于：

（1）本發(fā)明提供的一種可逆觸變絲素蛋白水凝膠的制備方法，通過去離子水浸泡萃取絲素蛋白分子中親水性較強(qiáng)的鏈段，得到絲素蛋白親水鏈段溶液，其中親水性氨基酸含量較多，非常容易產(chǎn)生分子鏈間聚集以及不規(guī)整的弱氫鍵作用，從而快速形成具有可逆觸變粘彈性行為的絲素蛋白水凝膠，與傳統(tǒng)再生家蠶絲素溶液凝膠過程相比，制備絲素蛋白水凝膠時(shí)間從一周至一月降到1～6h，且無需任何化學(xué)添加劑，制作方便；

（2）本發(fā)明提供的一種可逆觸變絲素蛋白水凝膠，與傳統(tǒng)再生家蠶絲素溶液凝膠相比，絲素蛋白水凝膠含固量更低，最低可至0.2% w/v，能夠?qū)崿F(xiàn)超低濃度下的凝膠化過程；

（3）本發(fā)明提供的一種可逆觸變絲素蛋白水凝膠，具有顯著的可逆觸變粘彈性行為：絲素蛋白水凝膠受到一定的機(jī)械觸變后會(huì)轉(zhuǎn)變成流動(dòng)性良好的半凝膠態(tài)，在一定溫度下靜置后又重新轉(zhuǎn)變?yōu)檎硰椥粤己玫乃z，可廣泛應(yīng)用于藥物控釋、靶向給藥、原位組織修復(fù)、創(chuàng)面輔料以及美容等領(lǐng)域。

附圖說明

圖1（a）為實(shí)施例一中制備得到的親水性絲素蛋白鏈段溶液，圖1（b）為可逆觸變絲素蛋白水凝膠的照片圖。

圖2為實(shí)施例一中制備得到的親水性絲素蛋白鏈段溶液與絲素蛋白固化物水溶液表面張力對(duì)比圖。

圖3為實(shí)施例一中制備得到的可逆觸變絲素蛋白水凝膠在不同的時(shí)間點(diǎn)觸變前后粘彈性的變化。

圖4為實(shí)施例一中制備得到的可逆觸變絲素蛋白水凝膠的掃描電鏡圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例一：

（1）絲素蛋白溶液的制備：將剪碎的繭殼按浴比1:50在濃度為0.05% w/v的碳酸鈉溶液中重復(fù)三次微沸蒸煮30min，每次蒸煮后都以去離子水洗凈繭絲表面有力的絲膠，再將脫膠后的繭絲于60℃烘干6h。將脫膠并烘干后絲素于60℃下按15:100的浴比溶于9.3M溴化鋰溶液，并于去離子水透析3d得純化的絲素蛋白溶液。

（2）絲素蛋白固化物的制備：以去離子水將上述純化后的絲素蛋白溶液稀釋至0.06g/ml，以流延法將5ml稀釋后的絲素蛋白溶液澆注于直徑為55mm的塑料培養(yǎng)皿。將以上澆注后的體系置于25℃、65%濕度環(huán)境下平衡干燥24h，即得絲素蛋白固化物。

（3）親水性絲素蛋白鏈段溶液的制備：按1：100的浴比以去離子水浸泡步驟（2）中的絲素蛋白固化物3h，水浴溫度37℃，再將浸泡后的體系在4000r/min的轉(zhuǎn)速下離心，得到的的上清液即為親水性絲素蛋白鏈段溶液，該溶液的含固量為0.2%。

（4）可逆觸變絲素蛋白水凝膠的制備：將以上步驟（3）中獲得的親水性絲素蛋白鏈段溶液于25℃環(huán)境中靜置4h，即得一種可逆觸變絲素蛋白水凝膠，絲素蛋白水凝膠受到一定的機(jī)械觸變后會(huì)轉(zhuǎn)變成流動(dòng)性良好的半凝膠態(tài)，在一定溫度下靜置后又重新轉(zhuǎn)變?yōu)檎硰椥粤己玫乃z，圖1為可逆觸變絲素蛋白水凝膠凝膠前后的照片圖。

表面張力的測(cè)定：采用平板測(cè)試法分別測(cè)試等濃度下親水性絲素蛋白鏈段溶液與絲素蛋白固化物水溶液表面張力，測(cè)試結(jié)果如下圖2所示。

可逆粘彈性行為的測(cè)試：以粘度儀頻率掃的方法測(cè)試制備得到的可逆觸變絲素蛋白水凝膠在不同的時(shí)間點(diǎn)凝膠前后的粘彈性行為變化，結(jié)果如圖3所示。

電鏡形貌測(cè)試：將制備得到的可逆觸變絲素蛋白水凝膠以液氮冷凍并真空凍干并噴金后，在臺(tái)式掃描電鏡下觀察凝膠表面形貌，結(jié)果如圖4所示。

實(shí)施例二：

（1）絲素蛋白溶液的制備：將剪碎的繭殼按浴比1:50在濃度為0.05% w/v的碳酸鈉溶液中重復(fù)三次微沸蒸煮30min，每次蒸煮后都以去離子水洗凈繭絲表面有力的絲膠，再將脫膠后的繭絲于60℃烘干6h。將脫膠并烘干后絲素于60℃下按12:100的浴比溶于9.3M溴化鋰溶液，并于去離子水透析3d得純化絲素溶液。

（2）絲素蛋白固化物的制備：以去離子水將上述純化后家蠶絲素蛋白溶液稀釋至0.05g/ml，以流延法將5ml稀釋后的再生家蠶絲素蛋白溶液澆注于直徑為55mm的塑料培養(yǎng)皿。將以上澆注后的體系置于25℃、65%濕度環(huán)境下平衡干燥20h，即得絲素蛋白固化物。

（3）親水性絲素蛋白鏈段溶液的制備：按1：50的浴比以去離子水浸泡步驟（2）中的絲素蛋白固化物2h，水浴溫度35℃，再將浸泡后的體系在4000r/min的轉(zhuǎn)速下離心，得到的上清液即為親水性絲素蛋白溶液，該溶液的含固量為0.4%。

（4）可逆觸變絲素蛋白水凝膠的制備：將以上步驟（3）中獲得的親水性絲素蛋白溶液于37℃環(huán)境中靜置3h，即得一種可逆觸變絲素蛋白水凝膠。

實(shí)施例三：

（1）絲素蛋白溶液的制備：將剪碎的繭殼按浴比1:50在濃度為0.05% w/v的碳酸鈉溶液中重復(fù)三次微沸蒸煮30min，每次蒸煮后都以去離子水洗凈繭絲表面有力的絲膠，再將脫膠后的繭絲于60℃烘干6h。將脫膠并烘干后絲素于60℃下按15:100的浴比溶于9.3M溴化鋰溶液，并于去離子水透析3d得純化絲素溶液。

（2）絲素蛋白固化物的制備：以去離子水將上述純化后家蠶絲素蛋白溶液稀釋至0.04g/ml，以流延法將5ml稀釋后的再生家蠶絲素蛋白溶液澆注于直徑為55mm的塑料培養(yǎng)皿。將以上澆注后的體系置于25℃、65%濕度環(huán)境下平衡干燥19h，即得絲素蛋白固化物。

（3）親水性絲素蛋白鏈段溶液的制備：按1：30的浴比以去離子水浸泡步驟（2）中的絲素蛋白固化物2h，水浴溫度30℃，再將浸泡后的體系在4000r/min的轉(zhuǎn)速下離心，得到的上清液即為親水性絲素蛋白溶液，該溶液的含固量為0.5%。

（4）可逆觸變絲素蛋白水凝膠的制備：將以上步驟（3）中獲得的親水性絲素蛋白溶液于45℃環(huán)境中靜置1h，即得一種可逆觸變絲素蛋白水凝膠。

實(shí)施例四：

（1）絲素蛋白溶液的制備：將剪碎的繭殼按浴比1:50在濃度為0.05% w/v的碳酸鈉溶液中重復(fù)三次微沸蒸煮30min，每次蒸煮后都以去離子水洗凈繭絲表面有力的絲膠，再將脫膠后的繭絲于60℃烘干6h。將脫膠并烘干后絲素于60℃下按15:100的浴比溶于9.3M溴化鋰溶液，并于去離子水透析3d得純化絲素溶液。

（2）絲素蛋白固化物的制備：以去離子水將上述純化后家蠶絲素蛋白溶液稀釋至0.03g/ml，以流延法將5ml稀釋后的再生家蠶絲素蛋白溶液澆注于直徑為55mm的塑料培養(yǎng)皿。將以上澆注后的體系置于25℃、65%濕度環(huán)境下平衡干燥36h，即得絲素蛋白固化物。

（3）親水性絲素蛋白鏈段溶液的制備：按1：50的浴比以去離子水浸泡步驟（2）中的絲素蛋白固化物2h，水浴溫度40℃，再將浸泡后的體系在4000r/min的轉(zhuǎn)速下離心，得到的上清液即為親水性絲素蛋白溶液，該溶液的含固量為0.4%。

（4）可逆觸變絲素蛋白水凝膠的制備：將以上步驟（3）中獲得的親水性絲素蛋白溶液于50℃環(huán)境中靜置2h，即得一種可逆觸變絲素蛋白水凝膠。

實(shí)施例五：

（1）絲素蛋白溶液的制備：將剪碎的繭殼按浴比1:10在濃度為0.01% w/v的碳酸鈉溶液中重復(fù)三次微沸蒸煮60min，每次蒸煮后都以去離子水洗凈繭絲表面有力的絲膠，再將脫膠后的繭絲于50℃烘干8h。將脫膠并烘干后絲素于50℃下按15:100的浴比溶于9M溴化鋰溶液，并于去離子水透析4d得純化絲素溶液。

（2）絲素蛋白固化物的制備：以去離子水將上述純化后家蠶絲素蛋白溶液稀釋至0.03g/ml，以流延法將5ml稀釋后的再生家蠶絲素蛋白溶液澆注于直徑為55mm的塑料培養(yǎng)皿。將以上澆注后的體系置于22℃、60%濕度環(huán)境下平衡干燥36h，即得絲素蛋白固化物。

（3）親水性絲素蛋白鏈段溶液的制備：按1：10的浴比以去離子水浸泡步驟（2）中的絲素蛋白固化物1h，水浴溫度25℃，再將浸泡后的體系在6000r/min的轉(zhuǎn)速下離心，得到的上清液即為親水性絲素蛋白溶液，該溶液的含固量為0.4%。

（4）可逆觸變絲素蛋白水凝膠的制備：將以上步驟（3）中獲得的親水性絲素蛋白溶液于30℃環(huán)境中靜置4h，即得一種可逆觸變絲素蛋白水凝膠。

實(shí)施例六：

（1）絲素蛋白溶液的制備：將剪碎的繭殼按浴比1:20在濃度為0.03% w/v的碳酸鈉溶液中重復(fù)三次微沸蒸煮30min，每次蒸煮后都以去離子水洗凈繭絲表面有力的絲膠，再將脫膠后的繭絲于70℃烘干6h。將脫膠并烘干后絲素于50℃下按9:100的浴比溶于10M溴化鋰溶液，并于去離子水透析5d得純化絲素溶液。

（2）絲素蛋白固化物的制備：以去離子水將上述純化后家蠶絲素蛋白溶液稀釋至0.03g/ml，以流延法將5ml稀釋后的再生家蠶絲素蛋白溶液澆注于直徑為55mm的塑料培養(yǎng)皿。將以上澆注后的體系置于28℃、70%濕度環(huán)境下平衡干燥36h，即得絲素蛋白固化物。

（3）親水性絲素蛋白鏈段溶液的制備：按1：40的浴比以去離子水浸泡步驟（2）中的絲素蛋白固化物3h，水浴溫度30℃，再將浸泡后的體系在3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心，得到的上清液即為親水性絲素蛋白溶液，該溶液的含固量為0.5%。

（4）可逆觸變絲素蛋白水凝膠的制備：將以上步驟（3）中獲得的親水性絲素蛋白溶液于20℃環(huán)境中靜置6h，即得一種可逆觸變絲素蛋白水凝膠。

上述結(jié)果可以表明，本發(fā)明提供的一種可逆觸變絲素蛋白水凝膠的制備方法，通過去離子水浸泡萃取絲素蛋白分子中親水性較強(qiáng)的鏈段，得到絲素蛋白親水鏈段溶液，其中親水性氨基酸含量較多，非常容易產(chǎn)生分子鏈間聚集以及不規(guī)整的弱氫鍵作用，從而快速形成具有可逆觸變粘彈性行為的絲素蛋白水凝膠，與傳統(tǒng)再生家蠶絲素溶液凝膠過程相比，制備絲素蛋白水凝膠時(shí)間從一周至一月降到1～6h，且無需任何化學(xué)添加劑，制作方便；同時(shí)與傳統(tǒng)再生家蠶絲素溶液凝膠相比，絲素蛋白水凝膠含固量更低，最低可至0.2% w/v，能夠?qū)崿F(xiàn)超低濃度下的凝膠化過程；此外，可逆觸變絲素蛋白水凝膠具有顯著的可逆觸變粘彈性行為：絲素蛋白水凝膠受到一定的機(jī)械觸變后會(huì)轉(zhuǎn)變成流動(dòng)性良好的半凝膠態(tài)，在一定溫度下靜置后又重新轉(zhuǎn)變?yōu)檎硰椥粤己玫乃z，可廣泛應(yīng)用于藥物控釋、靶向給藥、原位組織修復(fù)、創(chuàng)面輔料以及美容等領(lǐng)域。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。