本發(fā)明涉及基因工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及后腎間充質(zhì)細胞的制備方法。

背景技術(shù)：

哺乳動物腎臟是由后腎輸尿管芽與后腎間充質(zhì)相互作用發(fā)育而來的，前者發(fā)育成為輸尿管和集合管，后者可分成兩群細胞，即帽狀間充質(zhì)細胞(標志物為Six2)和間質(zhì)間充質(zhì)細胞(標志物為Foxd1)。在腎臟發(fā)育/胚腎細胞相關(guān)研究中，有時需要將后腎間充質(zhì)細胞，甚至特定細胞表型的后腎間充質(zhì)細胞分離出來，既往的研究僅在所需的特定天數(shù)取出胚腎、剪斷、培養(yǎng)分離胚腎細胞，如需要特定細胞表型的后腎細胞(以Foxd1⁺細胞為例)，將分離的后腎間充質(zhì)細胞進行Foxd1熒光染色，然后通過流式細胞術(shù)篩選分離Foxd1⁺細胞。

目前已報道的分離特定細胞表型后腎間充質(zhì)細胞的方法不僅步驟繁瑣，且存在細胞成份不確定、細胞產(chǎn)量低等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種后腎間充質(zhì)細胞的制備方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明通過將Foxd1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠與DTR^flox轉(zhuǎn)基因小鼠進行交配，分離胚鼠腎臟，培養(yǎng)胚腎細胞，通過加入白喉毒素提取高純度的標志物Foxd1陽性(Foxd1⁺)的后腎間充質(zhì)細胞。

本發(fā)明提供的后腎間充質(zhì)細胞的制備方法，將Foxd1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠與DTR(白喉毒素受體)^flox轉(zhuǎn)基因小鼠進行交配，獲取雌鼠受孕開始后第13.5-15.5天內(nèi)的胚胎(優(yōu)選地，以發(fā)現(xiàn)有陰道栓記為E0.5天，將雌鼠喂養(yǎng)至第E13.5-15.5天)，分離胚腎，將胚腎剪碎后接種于干細胞專用培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，同時對各胚胎的基因型進行鑒定，篩選出基因型為Foxd1-cre；DTR-flox的雙轉(zhuǎn)基因型胚腎，培養(yǎng)60-72小時后向培養(yǎng)基中加入終濃度100-150ng/ml(優(yōu)選100ng/ml)的白喉毒素，每48小時用含100-150ng/ml(優(yōu)選100ng/ml)白喉毒素的干細胞專用培養(yǎng)基換液1次，直至培養(yǎng)5-7天，收集到的存活細胞即為Foxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞。

其中，F(xiàn)oxd1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson實驗室(Stock No:012463)。

DTR^flox轉(zhuǎn)基因小鼠由耶魯大學(xué)Lloyd Cantley教授惠贈(Guo J K,Shi H,Koraishy F,et al.The Terminator mouse is a diphtheria toxin–receptor knock-in mouse strain for rapid and efficient enrichment of desired cell lineages[J].Kidney international,2013,84(5):1041-1046.)。

本發(fā)明中涉及的干細胞專用培養(yǎng)基為C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基，由賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司生產(chǎn)，商品編號MUBMX-90011。

前述的方法，胚腎剪碎后接種于干細胞專用培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)2-3天。

前述的方法，對各胚胎的基因型進行鑒定，篩選基因型為Foxd1-cre；DTR-flox的雙轉(zhuǎn)基因型胚腎的具體方法如下，包括以下步驟：

S1、Foxd1-cre轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定

S11、胚鼠鼠尾基因組DNA提取；

S12、采用PCR法進行檢測：PCR反應(yīng)體系：DNA模板2μl，25μM上、下游引物各0.3μl，2×EasyTag SuperMix 10μl，ddH₂O補足至總體積20μl；PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，重復(fù)35個循環(huán)；72℃ 10min，4℃維持；

S13、結(jié)果檢測：配制1.5％瓊脂糖凝膠，每孔加入PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl，在140V電壓下電泳20min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電脈結(jié)果，如果出現(xiàn)約450bp大小的擴增條帶，則鑒定為Foxd1-cre轉(zhuǎn)基因小鼠；

其中，S12中所用引物序列如下：

上游引物F1 5’-TCTGGTCCAAGAATCCGAAG-3’，下游引物R1 5’-GGGAGGATTGGGAAGACAAT-3’；

S2、Foxd1-cre；DTR-flox雙轉(zhuǎn)基因型小鼠的鑒定

S21、以上述鑒定為Foxd1-cre轉(zhuǎn)基因小鼠的胚胎為材料，提取胚鼠鼠尾基因組DNA；

S22、采用PCR法進行檢測：PCR反應(yīng)體系：DNA模板2μl，25μM上、下游引物各0.3μl，2×EasyTag SuperMix 10μl，ddH₂O補足至總體積20μl；PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 30s，50℃ 45s，72℃ 30s，重復(fù)35個循環(huán)；72℃ 10min，4℃維持；

S23、配制1.5％瓊脂糖凝膠，每孔加入PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl，在140V電壓下電泳20min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電脈結(jié)果，如果出現(xiàn)約650bp大小的擴增條帶，則鑒定為Foxd1-cre；DTR-flox雙轉(zhuǎn)基因型小鼠；

其中，S22中所用引物序列如下：

上游引物F2 5’-ACCATGAAGCTGCTGCCGTC-3’，下游引物R2 5’-TCAGTGGGAATTAGTCATGC-3’；

S3、從上述鑒定為Foxd1-cre；DTR-flox雙轉(zhuǎn)基因型小鼠的胚胎中分離胚腎，即為基因型為Foxd1-cre；DTR-flox的雙轉(zhuǎn)基因型胚腎。

本發(fā)明以Foxd1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠與DTR^flox轉(zhuǎn)基因小鼠為基礎(chǔ)，通過交配獲得胚鼠，在Foxd-cre；DTR-flox雙轉(zhuǎn)基因胚鼠體內(nèi)，不表達Foxd1的細胞將表達DTR，這類細胞接觸白喉毒素后將死亡，而表達Foxd1的細胞不表達DTR，接觸白喉毒素后仍存活(圖1)。胚腎Foxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞在Cre與loxP發(fā)生作用，使位于loxP間的DTRpA基因片段(白喉毒素受體)沉默，從而不表達DTR，因此對白喉毒素?zé)o反應(yīng)；而非Foxd1⁺的其它胚腎細胞，由于loxP-DTRpA-loxP繼續(xù)表達DTR，加入白喉毒素后細胞將死亡。利用這一原理提取高純度的Foxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞。用Real-time PCR檢測未經(jīng)培養(yǎng)基中加入白喉毒素進行提取分離的后腎間充質(zhì)細胞以及采用上述方法提取的Foxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞的Foxd1和Six2的表達情況，結(jié)果如圖2所示，F(xiàn)oxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞高表達Foxd1，且?guī)缀醪槐磉_Six2，由此可以確定通過本發(fā)明方法成功提取到了高純度的Foxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

(一)與目前已報道的分離特定細胞表型后腎間充質(zhì)細胞的方法相比，本方法操作簡單，所提取的Foxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞成分單一，純度高；

(二)Foxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞提取量可控，可實現(xiàn)Foxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞的大規(guī)模生產(chǎn)制備。

附圖說明

圖1為本發(fā)明Foxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞的制備原理。

圖2為本發(fā)明實施例1中Foxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞與后腎間充質(zhì)細胞Foxd1和Six2的表達水平比較。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實施例1 Foxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞的制備

首先將Foxd1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠與DTR^flox轉(zhuǎn)基因小鼠進行交配，每天早晚兩次觀察雌鼠是否受孕(是否有陰道栓)，如發(fā)現(xiàn)有陰道栓記為E0.5天，將雌鼠拿出單獨喂養(yǎng)直到第E13.5-15.5天，將雌鼠斷頸處死、消毒后，立即取出子宮、分離胚胎，在直視顯微鏡下用顯微手術(shù)器械分離胚腎，不同胚鼠的胚腎分別放入盛有生理鹽水的EP管中，其對應(yīng)胚鼠的鼠尾也放在編號對應(yīng)的EP管待基因型鑒定備用。將胚腎剪碎接種于干細胞專用培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)，同時對各胚鼠的基因型進行鑒定，篩選出基因型為Foxd1-cre；DTR-flox雙轉(zhuǎn)基因型的胚腎。具體方法如下：

S1、Foxd1-cre轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定

S11、胚鼠鼠尾基因組DNA提取；

S12、采用PCR法進行檢測：PCR反應(yīng)體系：DNA模板2μl，25μM上、下游引物各0.3μl，2×EasyTag SuperMix 10μl，ddH₂O補足至總體積20μl；PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，重復(fù)35個循環(huán)；72℃ 10min，4℃維持；

S13、結(jié)果檢測：配制1.5％瓊脂糖凝膠，每孔加入PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl，在140V電壓下電泳20min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電脈結(jié)果，如果出現(xiàn)約450bp大小的擴增條帶，則鑒定為Foxd1-cre轉(zhuǎn)基因小鼠；

其中，S12中所用引物序列如下：

上游引物F1 5’-TCTGGTCCAAGAATCCGAAG-3’，下游引物R1 5’-GGGAGGATTGGGAAGACAAT-3’；

S2、Foxd1-cre；DTR-flox雙轉(zhuǎn)基因型小鼠的鑒定

S21、以上述鑒定為Foxd1-cre轉(zhuǎn)基因小鼠的胚胎為材料，提取胚鼠鼠尾基因組DNA；

S22、采用PCR法進行檢測：PCR反應(yīng)體系：DNA模板2μl，25μM上、下游引物各0.3μl，2×EasyTag SuperMix 10μl，ddH₂O補足至總體積20μl；PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 30s，50℃ 45s，72℃ 30s，重復(fù)35個循環(huán)；72℃ 10min，4℃維持；

S23、配制1.5％瓊脂糖凝膠，每孔加入PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl，在140V電壓下電泳20min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電脈結(jié)果，如果出現(xiàn)約650bp大小的擴增條帶，則鑒定為Foxd1-cre；DTR-flox雙轉(zhuǎn)基因型小鼠；

其中，S22中所用引物序列如下：

上游引物F2 5’-ACCATGAAGCTGCTGCCGTC-3’，下游引物R2 5’-TCAGTGGGAATTAGTCATGC-3’；

S3、從上述鑒定為Foxd1-cre；DTR-flox雙轉(zhuǎn)基因型小鼠的胚胎中分離胚腎，即為基因型為Foxd1-cre；DTR-flox的雙轉(zhuǎn)基因型胚腎。

將篩選出基因型為Foxd1-cre；DTR-flox雙轉(zhuǎn)基因型的胚腎剪碎接種于干細胞專用培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)72小時，然后向干細胞專用培養(yǎng)基中加入白喉毒素(100ng/ml)，每48小時換液(含100ng/ml白喉毒素的干細胞專用培養(yǎng)基)直至培養(yǎng)一周，此時剩余的細胞即為Foxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞。用Real-time PCR檢測未分離的后腎間充質(zhì)細胞和提取的Foxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞的Foxd1和Six2的表達情況。引物序列見表1：

表1 Real-time PCR檢測用引物

結(jié)果如圖2所示，F(xiàn)oxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞高表達Foxd1，且?guī)缀醪槐磉_Six2，由此可以確定通過以上方法成功提取得到了高純度的Foxd1⁺后腎間充質(zhì)細胞。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。