本發(fā)明涉及法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種嗜水氣單胞菌核酸的分析方法以及該分析方法在判斷溺亡者真實死因上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在法醫(yī)學(xué)檢案實踐中，時常遇到溺死案件的檢驗鑒定。由于我國江河湖海眾多，環(huán)境復(fù)雜，以及尸體腐敗等因素影響，溺死鑒定問題一直為法醫(yī)病理學(xué)工作者所關(guān)注。盡管硅藻檢驗作為鑒定溺死的重要輔助手段已得到普遍認可，但易受尸檢，取材和檢驗過程污染。單從水中尸體的肺檢出硅藻不足以鑒定溺死，多器官未檢出硅藻亦不能排除溺死，故硅藻檢驗的作用受到一定限制。國內(nèi)外許多學(xué)者已研究了一些其他輔助鑒定溺死的方法，如血液生物化學(xué)，組織化學(xué)，葉綠素（A）等檢驗技術(shù)。但各種方法均存在一定誤差和局限性。因此，鑒定溺死時最好采用多種檢驗方法進行綜合分析判定。能夠研發(fā)出一種高靈敏、高檢出率的廣泛應(yīng)用于確定溺死者是否真正溺死、有助于溺死區(qū)域的檢測方法和技術(shù)，對于當前法醫(yī)行業(yè)具有重要的意義。

與傳統(tǒng)的硅藻形態(tài)學(xué)檢驗方法相比，PCR擴增技術(shù)檢測微生物DNA標記用于溺死鑒定主要有以下優(yōu)點： ①檢測范圍廣，除可應(yīng)用于藻類分類及鑒定外，還可用于小微型浮游生物及不能用顯微鏡進行形態(tài)辨別的浮游生物檢驗；②靈敏度高，所需樣本量明顯小于傳統(tǒng)硅藻檢驗法；③可用于推斷死因是否真正為溺死。利用浮游生物的保守序列從DNA中分離出各種類的變異序列，可以在定性的同時揭示群落特征，如進一步建立不同水域和同一水域不同時間浮游生物群落特征變化監(jiān)控系統(tǒng)，并與傳統(tǒng)硅藻檢驗法相結(jié)合，對溺死鑒定則有更重要的實用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供了一種對嗜水氣單胞菌的分析方法，以及利用對嗜水氣單胞菌的分析方法在法醫(yī)檢測中，具體是在判斷溺亡者真實死因上的應(yīng)用。

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動物的原發(fā)性致病菌，該菌是弧菌科氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性短桿菌，極端單鞭毛，沒有芽胞和莢膜，剛從病灶上分離的病原菌常兩個相連。在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)形成的菌落圓形、邊緣光滑、中央凸起、肉色、灰白色或略帶淡桃紅色有光澤，發(fā)育良好。嗜水氣單胞菌在水溫14.0-40.5℃范圍內(nèi)都可繁殖，以28.0-30.0℃為最適溫度。PH 值在6-11 范圍內(nèi)均可生長；最適PH 值為7.27；嗜水氣單胞菌可在含鹽量0‰-4‰的水生存，最適鹽度為0.5‰。從溺亡者臟器中提取嗜水氣單胞菌核酸并用PCR技術(shù)進行擴增，然后進行檢測并與水樣中的嗜水氣單胞菌核酸進行比對，通過檢出率和核酸測序結(jié)果的比對，即可判斷溺亡者是否真正死于溺亡，同時有助于找出真正的溺亡區(qū)域。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

本發(fā)明中提供一種嗜水氣單胞菌在判斷溺亡者是否真正死于溺亡的應(yīng)用。

本發(fā)明提供一對檢測嗜水氣單胞菌的引物對，所述引物對包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ IDNo.1所示，下游引物的序列如SEQ IDNo.2所示。

本發(fā)明還提供一種嗜水氣單胞菌核酸分析方法，利用上述引物對待分析核酸進行擴增，利用擴增產(chǎn)物制備待測樣本，對待測樣本進行核酸分析。進一步地，上游引物5’端均以FAM熒光標記。

本發(fā)明提供一種嗜水氣單胞菌核酸分析方法，分析方法為：PCR反應(yīng)體系為20μL，內(nèi)含10μL Taq酶，上下游引物各0.75μL，7.5μL去離子水，1μL待分析核酸；PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性10min；94℃變性40s，分別于55℃退火40s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)，最后在72℃繼續(xù)延伸10min，將溫度降至4℃保存待使用，即得核酸PCR擴增產(chǎn)物樣本。

待測樣本的制備方法為將樣本核酸PCR擴增產(chǎn)物、甲酰胺、ILSCC500混合，其中樣本核酸PCR產(chǎn)物、甲酰胺、ILSCC500的體積分別為1μL、9μL、1μL。

本發(fā)明還提供一種上述嗜水氣單胞菌核酸分析方法在法醫(yī)檢測過程中的應(yīng)用，具體是應(yīng)用于判斷溺亡者是否真正死于溺亡。

進一步地，所述的應(yīng)用方法為：取溺水者臟器組織，提取該臟器組織中的核酸，使用如權(quán)利要求2所述的引物對進行PCR擴增，對其進行檢測分析，確認PCR擴增產(chǎn)物是否來源于嗜水氣單胞菌，根據(jù)嗜水氣單胞菌的檢出率判斷溺亡者是否真正為溺亡。

本發(fā)明還提供一種判斷溺亡者是否真正死于溺亡和/或找出真正溺亡區(qū)域的方法，具體為：取溺水者臟器組織，檢測臟器組織中是否含有嗜水氣單胞菌，根據(jù)檢測結(jié)果判斷溺亡者是否真正死于溺亡，以及找出真正的溺亡區(qū)域。該判斷方法中，檢測臟器中是否含有嗜水氣單胞菌的方法可使用本發(fā)明中使用的嗜水氣單胞菌核酸分析方法。

本發(fā)明具有如下有益效果：

1、本發(fā)明提出了嗜水氣單胞菌在判斷溺亡者是否真正死于溺亡的應(yīng)用。

2、本發(fā)明中提供了一種對嗜水氣單胞菌核酸分析方法，提供了分析該核酸序列的上游引物及下游引物，并同時提供了相適配的擴增方法及具體的擴增參數(shù)，并將該方法引用到利用嗜水氣單胞菌判斷溺亡者真正死因的應(yīng)用中。

3、本發(fā)明還提供了將上述嗜水氣單胞菌核酸分析方法應(yīng)用于法醫(yī)檢測中的應(yīng)用，在溺亡者臟器中提取嗜水氣單胞菌核酸并用PCR技術(shù)進行擴增，然后進行檢測并與水樣中的嗜水氣單胞菌核酸進行比對，通過檢出率和核酸測序結(jié)果的比對，即可判斷溺亡者是否真正死于溺亡，同時有助于找出真正的溺亡區(qū)域。

附圖說明

附圖1為本發(fā)明中嗜水氣單胞菌；

附圖2為毛細管電泳儀檢測分析臟器中嗜水氣單胞菌核酸結(jié)果（正向引物熒光標記）；

附圖3 為本發(fā)明實施例中嗜水氣單胞菌核酸擴增產(chǎn)物測序結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的說明。

實施例1 引物設(shè)計及引物特異性證明

根據(jù)嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila ）的haemolysin基因設(shè)計出一對上下游引物：

上游引物（如SEQ ID NO.1所示）：

5’- GCCGAGCGCCCAGAAGGTGAGTT-3’，

下游引物（如SEQ ID NO.2所示）：

5’- GAGCGGCTGGATGCGGTTGT -3’。

實施例2 引物對的異性驗證

利用上述引物對對不同樣本的DNA進行PCR擴增，上游引物5’端均以FAM熒光標記，選取多種水中微藻、常見微生物以及不同樣本的DNA進行特異性驗證。

附圖中標號對應(yīng)的DNA樣本來源對應(yīng)如下：

1、Marker 2、衣藻 3、土壤藻 4、四列藻 5、假魚腥藻 6、骨條藻 7、脆桿藻 8、滿江紅魚腥藻 9、扁藻 10、女人 11、男人 12、舟行藻 13、小環(huán)藻 14、菱形藻 15、針桿藻 16、直鏈藻 17、小球藻 18、藍藻 19、硅鞭金藻 20、白色念珠菌 21、嗜水氣單胞菌 22、陰性對照 23、Marker

擴增后，通過銀染顯帶，得到如附圖1所示結(jié)果。由附圖1結(jié)果可見，只有21號樣本顯陽性，即可證明上述引物可以特異擴增嗜水氣單胞菌

實施例3 小鼠組對照實驗

人為溺死小鼠組（n=15）、小鼠機械處死后入水組（n=15）和非溺死小鼠的空白對照組（n=5）肝、腎（體循環(huán)臟器）的檢材中提取的藻類DNA在相同條件下經(jīng)本文引物PCR擴增，銀染顯帶，顯示陽性結(jié)果的判定為檢出，檢出率結(jié)果見表1。經(jīng)χ2檢驗，生前入水組與死后入水組各種臟器間陽性率具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05，表1）。

表1 嗜水氣單胞菌在各組實驗小鼠體循環(huán)臟器檢出例數(shù)及陽性率

由上述實驗結(jié)果可看出，利用本發(fā)明中的方法，對小鼠臟器中的DNA進行擴增，利用檢出陽性結(jié)果來確認小鼠死因的方法檢出率可達93%，考慮到溺亡過程中吸入水的不同及個體差異，可認定本發(fā)明中的方法可有效判斷小鼠是否真正為溺死，同時可協(xié)助判斷溺亡水域。

進一步地，由實施例中數(shù)據(jù)可看出，肝臟中的檢出率比腎臟要高。

實施例4 嗜水氣單胞菌核酸分析方法及在法醫(yī)檢測中的應(yīng)用

利用實施例設(shè)計的引物對可以設(shè)計一種嗜水氣單胞菌核酸分析方法，本實施例中將本發(fā)明中的嗜水氣單胞菌核酸分析方法應(yīng)用于法醫(yī)檢測中，具體應(yīng)用于確認溺水者是否為溺亡以及尋找溺對應(yīng)的溺亡區(qū)域。本實施例中采用的溺水者確認為真實溺水死亡人員。

法醫(yī)檢測步驟為如下：

步驟一：

剪取溺水者臟器組織；

步驟二：

提取該臟器組織中的核酸，使用實施例1中的引物進行PCR擴增；

步驟2中，利用核酸提取儀提取臟器組織中的核酸，擴增過程中使用的上游引物為5’- GCCGAGCGCCCAGAAGGTGAGTT-3’，下游引物為5’- GAGCGGCTGGATGCGGTTGT -3’。

正向引物5’端均以FAM熒光標記，能實現(xiàn)在毛細管電泳儀中的熒光檢測。

PCR反應(yīng)體系為20μL，內(nèi)含10μL Taq酶，上下游引物各0.75μL，7.5μL去離子水，1μL待分析核酸；PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性10min；94℃變性40s，分別于55℃退火40s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)，最后在72℃繼續(xù)延伸10min，將溫度降至4℃保存待使用，即得核酸PCR產(chǎn)物樣本。其中上下游引物濃度為10pmol/μL。

待測樣本的制備方法為將樣本核酸PCR擴增產(chǎn)物、甲酰胺、ILSCC500混合，其中樣本核酸PCR產(chǎn)物、甲酰胺、ILSCC500的體積為1μL、9μL、1μL。

步驟三：

對上述樣本核酸的PCR擴增產(chǎn)物（待測樣本）進行檢測分析。

本實施例中，核酸分析使用的儀器為ABI3130XL遺傳分析儀，也可采用其他有效分析儀器。

利用毛細管電泳儀檢測分析臟器中嗜水氣單胞菌核酸結(jié)果（正向引物熒光標記）如附圖2所示，結(jié)果表明，陽性樣本的PCR產(chǎn)物結(jié)果為127bp大小的條帶，即可判斷該樣本中含有嗜水氣單胞菌，該樣本可判定為溺水身亡，與已知死因相符。

PCR擴增產(chǎn)物測序圖如附圖3所示。

PCR擴增產(chǎn)物測序為：TGGCTGGATGCGGTTGTGATCCACGTCGTAGCCCATGCCCCAGACGGTGGCCGTCTTGGAGGAGAGCAGGGACTCCGCGGTCGCGTATTGATCGCGCACCCAGCTGAAACTCACCTTCTGGGCG。

最后需要說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案而非對其進行限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明實施例進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解依然可以對本發(fā)明實施例的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而這些修改或者等同替換亦不能使修改后的技術(shù)方案脫離本發(fā)明實施例技術(shù)方案的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所

<120> 一種嗜水氣單胞菌核酸分析方法及在法醫(yī)檢測中的應(yīng)用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物β-actinF1

<400> 1

GCCGAGCGCCCAGAAGGTGAGTT 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物β-actinR1

<400> 2

GAGCGGCTGGATGCGGTTGT 20