本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物領(lǐng)域，涉及到一種天然新化合物及其提取方法，具體就是一種新的雙對苯醌類化合物，2,7-dihydroxy-3,6,9-trimethyl-9H-xanthene-1,4,5,8-tetraone及其提取方法。

背景技術(shù)：

竹黃Shiraia bambusicola Henn.是我國一種傳統(tǒng)的寄生性藥用真菌，又名竹花、竹參、竹赤斑菌、竹三七和竹赤團(tuán)子等，屬子囊菌亞門Ascomycotina，核菌綱Pyrenomycetes，球殼目Sphaeriales，肉座菌科Hypocreaceae，竹黃屬Shiraia真菌，通常生長在衰敗或即將衰敗的竹林中，其寄主植物主要為短穗竹屬Brachystachyum，主要分布在我國浙江、江蘇等南方各省以及日本。是僅在亞洲地區(qū)發(fā)現(xiàn)的以我國為主的特有物種。竹黃的藥用價值主要體現(xiàn)在抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤及抗病毒作用等方面，具有清熱化痰、清心定驚、舒筋活絡(luò)、祛痛散淤等功效，民間多用竹黃浸酒，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛、虛寒胃痛和急性肝炎等。

竹黃分離真菌是指生存于竹黃子實體中，但與竹黃的關(guān)系尚未明確的菌株。基于竹黃分離真菌特定的生存環(huán)境及與竹黃尚未明確的互作關(guān)系，有可能成為發(fā)現(xiàn)活性天然產(chǎn)物的一個新資源。

作為天然產(chǎn)物的重要來源，真菌是物種數(shù)量最大的微生物類群，保守估計其物種數(shù)高達(dá)150萬種，但已知種類僅占估計種類的6.5％，進(jìn)行過化學(xué)研究的物種數(shù)則更少。最近20年來，世界各國對真菌來源活性物質(zhì)的研究越來越重視，據(jù)統(tǒng)計，從真菌中發(fā)現(xiàn)的活性天然產(chǎn)物在所有微生物來源的活性物質(zhì)中所占的比例呈逐年上升的趨勢，到2001年已經(jīng)超過了50％，因此真菌在物種及代謝能力等方面具有巨大的潛力。與此同時，我國擁有豐富的真菌資源，并且具有復(fù)雜多樣的環(huán)境條件，在真菌來源的天然產(chǎn)物的開發(fā)與利用方面具有得天獨厚的優(yōu)勢。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種新的雙對苯醌類化合物及其提取方法。

本發(fā)明利用硅膠柱層析、反相高效液相色譜分析和重結(jié)晶等技術(shù)對竹黃分離的多株真菌中的一株產(chǎn)紅色素的真菌菌株固體發(fā)酵物的乙酸乙酯提取組分進(jìn)行分離純化得到一個純度較高的化合物，并通過紅外光譜、高分辨率電子噴霧質(zhì)譜、核磁共振譜波譜數(shù)據(jù)解析其結(jié)構(gòu)，確定為一種新的雙對苯醌類化合物，2,7-dihydroxy-3,6,9-trimethyl-9H-xanthene-1,4,5,8-tetraone。該化合物在甲醇，丙酮、氯仿、乙酸乙酯等常見的有機(jī)溶劑中溶解度較小，在吡啶中溶解度較大。另外，該化合物在酸性條件下溶于有機(jī)相，顯黃色；堿性條件下溶于水相，顯紫色。

本專利所述的一種新的雙對苯醌類化合物及其提取方法為藥物先導(dǎo)化合物提供了樣品，對于發(fā)掘真菌天然活性產(chǎn)物具有較重要的理論價值和創(chuàng)新性。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種雙對苯醌類化合物，其結(jié)構(gòu)式如式I所示：

分子式：C₁₆H₁₂O₇。

分子量：316。

化學(xué)名稱：2,7-dihydroxy-3,6,9-trimmethyl-9H-xanthene-1,4,5,8-tetraone。

屬于苯醌類衍生物，在乙酸乙酯中可形成橙紅色針狀結(jié)晶。

本發(fā)明中上述化合物的獲得方法如下：從竹子上采集竹黃子實體分離真菌菌株，篩選在培養(yǎng)基上產(chǎn)紅色素的菌株，常規(guī)方法固體發(fā)酵，發(fā)酵物經(jīng)乙酸乙酯浸提獲得不溶于石油醚部分，經(jīng)減壓硅膠柱層析，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝30:1,25:1…5:1,1:1，乙酸乙酯洗脫液減壓濃縮得到橙紅色粉末；用乙酸乙酯溶解該粉末過0.22μm有機(jī)濾膜后靜置，10～14d左右有橙紅色針狀晶體析出。

具體地，產(chǎn)紅色素的菌株經(jīng)常規(guī)方法固體發(fā)酵獲得發(fā)酵物，干燥粉碎，加入乙酸乙酯在室溫下浸提，浸提3～4次，抽慮后減壓濃縮回收溶劑得到粗提物；粗提物溶于色譜甲醇，有機(jī)濾膜過濾，采用HPLC在254nm波長下檢測樣品的出峰；流動相為甲醇和水(含有0.1％甲酸)，采用梯度洗脫，40％～100％甲醇洗脫60min，100％甲醇洗脫15min；在保留時間為36.5～38.5min的內(nèi)出峰證明含有目標(biāo)化合物。有目標(biāo)化合物的粗提物用石油醚溶解，獲得不溶于石油醚部分經(jīng)減壓硅膠柱層析分離純化，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝30:1,25:1…5:1,1:1。通過聚酰胺薄膜點板合并相似組分，回收薄膜板上顯紫色的洗脫組分，減壓濃縮后得到橙紅色粉末；用乙酸乙酯溶解該粉末過0.22μm有機(jī)濾膜后靜置，10～14d左右有橙紅色針狀晶體析出。取少量晶體，溶解在甲醇中，在254nm波長下檢測其純度。

本發(fā)明所述的新的雙對苯醌類化合物其提取原料為絲狀真菌的固體發(fā)酵物，產(chǎn)該化合物的絲狀真菌菌種，可以用微生物的常規(guī)方法長期保存，可以擴(kuò)繁和大規(guī)模發(fā)酵獲得發(fā)酵物是該化合物的提取原料，不需要從自然界中直接獲取，易于工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明還公開了所述雙對苯醌類化合物在清除DPPH自由基中的應(yīng)用。本發(fā)明的雙對苯醌類化合物濃度1mg/mL、0.8mgm/L、0.6mg/mL、0.4mg/mL和0.2mg/mL對自由基的清除率分別是：99.47％、97.10％、88.67％、80.58％和61.53％。該化合物對DPPH自由基的清除作用不僅存在量效關(guān)系，而且具有飽和型特征。在濃度達(dá)到0.8mg/mL時清除自由基的能力超過了維生素C。

附圖說明

圖1是本發(fā)明化合物在254nm下HPLC檢測結(jié)果。

圖2為本發(fā)明化合物高分辨質(zhì)譜(HRESI-MS)。

圖3為本發(fā)明化合物核磁共振氫譜(¹H NMR)。

圖4為本發(fā)明化合物核磁共振碳譜(¹³C NMR)。

圖5為本發(fā)明化合物HMBC相關(guān)譜。

圖6為本發(fā)明化合物HSQC相關(guān)譜。

圖7為本發(fā)明化合物紅外光譜(IR)。

具體實施方式

以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)說明，但是不會以任何方式對本發(fā)明的其它形式產(chǎn)生限制。

實施例1：竹黃子實體中產(chǎn)紅色素真菌菌株的分離

采集天然新鮮的竹黃子實體，立即到實驗室內(nèi)用1％的次氯酸鈉浸泡2min，用無菌水沖洗5次，用滅菌的解剖刀切成1cm小塊，擺放在PDA固體培養(yǎng)基上。28℃培養(yǎng)7d，把小塊中長出的菌絲接種到PDA斜面上，把分離到的菌株編號保藏。

把培養(yǎng)7d以上的斜面菌種中加入無菌水洗下孢子，經(jīng)稀釋涂布到PDA平板上，28℃培養(yǎng)，每天觀察，選取產(chǎn)紅色素的菌落，進(jìn)一步檢測。

實施例2：產(chǎn)紅色素菌株的固體發(fā)酵和產(chǎn)物的檢測

將實例1獲得的每個菌株接種在PDA平板上，6d后取平板上1cm²的菌塊連同培養(yǎng)基接種到含有100mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，于28℃130rpm/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)4～5d，作為種子培養(yǎng)液。

室溫條件下將大米在水中浸泡24h，加入30％的黃豆粉，用1mol/L的NaOH將pH調(diào)至6.8，在121℃下滅菌。將種子培養(yǎng)液接種到冷卻至室溫的大米培養(yǎng)基中，在28℃條件下培養(yǎng)，14d后收獲發(fā)酵物，于50℃烘箱中烘干并粉碎。

將粉碎后的發(fā)酵物中加入乙酸乙酯浸泡，24h后進(jìn)行抽慮，然后在55℃下減壓濃縮回收溶劑得到粗提物。粗提物溶于色譜甲醇，有機(jī)濾膜過濾，采用HPLC在254nm波長下檢測樣品的出峰；流動相為甲醇和水(含有0.1％甲酸)，采用梯度洗脫，40％～100％甲醇洗脫60min，100％甲醇洗脫15min；在保留時間為36.5～38.5min的內(nèi)出峰證明含有目標(biāo)化合物。

實施例3：新的雙對苯醌類化合物的分離

采取以下步驟：

把檢測含有目標(biāo)化合物的菌株按照實施例2的方法固體發(fā)酵，將固體發(fā)酵物200克置50℃烘箱中烘干并粉碎，加入乙酸乙酯進(jìn)行浸提3次，每次浸提24h；抽濾后在55℃下減壓濃縮回收溶劑得到粗提物28g。將獲得的粗體物用石油醚溶解，將其初步分為溶于石油醚的部分(18g)和不溶于石油醚的部分(10g)。將不溶于石油醚的部分10g用減壓硅膠柱層析進(jìn)一步分離，采用干法上樣，所用硅膠為200～300目，以石油醚和乙酸乙酯為洗脫劑，從石油醚:乙酸乙酯＝100:1開始，依次為30:1、25:1…1:1，將洗脫液回收，根據(jù)聚酰胺薄膜點板結(jié)果合并相似組分，展開劑為水：甲醇：乙酸＝40:1:1。目標(biāo)化合物在聚酰胺薄膜上展開后，自然揮干，105℃條件下加熱2～3s，可顯示紫色斑點。合并相似組分，減壓條件下除去有機(jī)溶劑即得到該化合物的粗品8mg；溶于乙酸乙酯中，經(jīng)有機(jī)濾膜過濾后，放在室溫條件下靜置結(jié)晶，10～14d左右有橙紅色針狀晶體析出，約5mg。

實施例4：新的雙對苯醌類化合物的純度檢測

將實施例3獲得的化合物晶體，溶于甲醇，過有機(jī)濾膜后，通過HPLC在254nm波長下檢測其純度，流動相為甲醇和水(0.1％甲酸)，采用洗脫梯度，60％～100％甲醇洗脫40min，100％甲醇洗脫15min，目標(biāo)產(chǎn)物的保留時間為19min，大約在80％左右甲醇時下洗脫下來，對應(yīng)的峰面積均為97％左右(圖1)。

實施例5：新的雙對苯醌類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

如圖2，該化合物的HRESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 339.04862[M+Na]⁺，結(jié)合¹H NMR、¹³C NMR確定該化合物分子式為C₁₆H₁₂O₇，不飽和度為11，分子中存在對稱結(jié)構(gòu)。

如圖3，¹H NMR(500MHz，C₅D₅N)：δ_H 2.90(3H，d，J＝10.00Hz)為1個甲基氫的信號峰；δ_H 3.65(6H，s)為2個甲基氫的信號峰；δ_H 5.62(1H，q，J＝10.00Hz)為1個次甲基氫的信號峰；δ_H 11.11(2H，s)為2個活潑氫的信號峰。

如圖4，¹³C NMR(500MHz，C₅D₅N)：給出了9個碳信號，其中δ_C 8.10，21.75，22.69為飽和碳區(qū)，δ_C 115.85，119.15，148.95，156.10為烯碳，δ_C 180.07，183.00為羰基碳。結(jié)合HRESI-MS、¹H NMR和¹³C NMR可知該化合物含有3個甲基，1個次甲基，2個羥基，8個雙鍵碳和4個羰基碳。

圖5是本發(fā)明化合物HMBC相關(guān)譜，HMBC圖譜給出的信息是具遠(yuǎn)程耦合關(guān)系的碳?xì)潢P(guān)系，δ_H 2.90與δ_C 22.69，119.15有遠(yuǎn)程耦合關(guān)系；δ_H 3.65與δ_C 115.85，156.10，183.00有遠(yuǎn)程耦合關(guān)系；δ_H 5.62與δ_C 148.95，180.07有遠(yuǎn)程耦合關(guān)系；

圖6是本發(fā)明化合物HSQC相關(guān)譜，HSQC圖譜給出的信息是δ_H 2.90與δ_C 21.75直接相連；δ_H 3.65與δ_C 8.10直接相連；；δ_H 5.62與δ_C 22.69直接相連。

圖7是本發(fā)明化合物紅外光譜，IR(KBr，cm^-1)()：3386.443(羥基)，1643.081(雙鍵)，1319.093，1191.812(C-C環(huán))。

綜合以上信息，推斷化合物的結(jié)構(gòu)如式I所示。將此化合物結(jié)構(gòu)在SCI Finder數(shù)據(jù)庫檢索，沒用發(fā)現(xiàn)該化合物的報道，確定為一個新化合物，系統(tǒng)命名為2,7-dihydroxy-3,6,9-trimmethyl-9H-xanthene-1,4,5,8-tetraone。

實施例6:新的雙對苯醌類化合物對DPPH自由基的清除作用的測定。

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，它的結(jié)構(gòu)中含有3個苯環(huán)，1個氮原子上有一對孤對電子，其醇溶液呈紫色，在517nm波長處有較大吸收，當(dāng)有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對使其吸收逐漸消失，其褪色程度和其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因此可以用分光光度計進(jìn)行快速的定量分析，從而來評價物質(zhì)的抗氧化活性。

用無水乙醇將DPPH配制成濃度為0.2mmol/L的溶液避光備用；將新的雙對苯醌類化合物用含有4％DMSO乙酸乙酯溶液配制成1mg/mL，并分別稀釋成0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL和0.2mg/mL；取5個10mL的具塞試管，分別加入2mL以上不同濃度的樣品溶液，再分別向其中加入2mLDPPH溶液，混合均勻，室溫下在暗處反應(yīng)30min；利用分光光度計在517nm波長處測定吸光度；同時以維生素C作為陽性對照。清除率％＝[1-(A_樣品-A_對照)/A_空白]×100(A_樣品為2mLDPPH溶液+2mL樣品溶液的吸光度值；A_對照為2mL+2mL無水乙醇溶液的吸光度值；A_空白為2mLDPPH溶液+2mL樣品溶劑的吸光度值)。

表1的結(jié)果顯示這種化合物隨著濃度的增加，清除率逐步增大，說明該化合物對DPPH自由基的清除作用不僅存在量效關(guān)系，而且具有飽和型特征。在濃度達(dá)到0.8mgm/L時清除自由基的能力超過了維生素C。

表1不同濃度新的雙對苯醌類化合物對DPPH自由基的清除率

表2不同濃度的維生素C對DPPH自由基的清除率