本發(fā)明涉及基因工程和酶工程的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種提高α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1熱穩(wěn)定性的方法。

背景技術(shù)：

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase(EC 3.2.1.40))屬于轉(zhuǎn)化糖苷水解酶類，能夠?qū)Ｒ?、高效地水解許多糖苷類物質(zhì)如柚皮苷(naringin)、蘆丁(rutin)、橘皮苷(hesperidin)等末端的α-L-鼠李糖基。CAZy(http://www.cazy.org/)數(shù)據(jù)庫中糖苷水解酶的分類依據(jù)是其氨基酸序列的相似性，α-L-鼠李糖苷酶包含在四個糖苷水解酶家族(glycoside hydrolase family,GH)，分別是GH13、GH28、GH78和GH106。

α-L-鼠李糖苷酶的來源非常廣泛，已有動物組織、植物組織和微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶的報道。目前關(guān)于動物組織和植物組織來源的α-L-鼠李糖苷酶的報道相對較少，主要是通過芽孢桿菌、擬桿菌、乳桿菌、鏈霉菌、單胞菌等細(xì)菌和黑曲霉、白曲霉、棘孢曲霉、土曲霉、青霉、木霉、酵母、犁頭霉等真菌發(fā)酵來獲取α-L-鼠李糖苷酶。由于黑曲霉是重要的酶制劑生產(chǎn)菌種，其具有重要的糖苷水解酶合成能力，并且是美國食品藥品監(jiān)督管理局允許使用的食品用酶生產(chǎn)菌，本實驗采用基因工程技術(shù)手段對從原始菌株黑曲霉JMU-TS528中克隆得到的α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1進(jìn)行定向進(jìn)化。

作為一種重要的工業(yè)酶類，α-L-鼠李糖苷酶在飲料加工行業(yè)和藥物制備行業(yè)具有重要的應(yīng)用價值。例如：在飲料加工行業(yè)，該酶可用于對柑橘類果汁進(jìn)行脫苦處理和澄清處理，消除橙汁中的橘皮苷晶體，增加葡萄酒的香氣，提高蘆筍汁的抗氧化活性；在藥物制備行業(yè)，α-L-鼠李糖苷酶可以用來制備具有抗炎和抗病毒的作用的普魯寧。

在工業(yè)生產(chǎn)中，蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性越高，其應(yīng)用價值和潛在優(yōu)勢越大。由于大部分天然α-L-鼠李糖苷酶的熱穩(wěn)定性都存在一定的缺陷，建立一個高效的分子改造的方法提高其熱穩(wěn)定性是極其必要的，為將來開發(fā)更多功能，更優(yōu)質(zhì)的酶打下堅實的理論及實驗基礎(chǔ)。

有鑒于此，本發(fā)明人研究和設(shè)計了一種提高α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1熱穩(wěn)定性的方法，本案由此產(chǎn)生。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種熱穩(wěn)定性提高的α-L-鼠李糖苷酶，該α-L-鼠李糖苷酶可用于飲料加工行業(yè)和藥物制備行業(yè)。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是：

一種編碼α-L-鼠李糖苷酶V529A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。基因大小為1 968bp。

一種α-L-鼠李糖苷酶V529A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。該蛋白編碼655個氨基酸殘基。

一種α-L-鼠李糖苷酶表達(dá)載體，含有所述的α-L-鼠李糖苷酶V529A基因的表達(dá)載體pPIC9k-V529A。

一種重組α-L-鼠李糖苷酶V529A的制備方法，包括采用所述的α-L-鼠李糖苷酶V529A表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組α-L-鼠李糖苷酶V529A。

作為實施例的優(yōu)選方式，所述的寄主細(xì)胞為畢赤酵母。

作為實施例的優(yōu)選方式，包括采用所述的α-L-鼠李糖苷酶V529A表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至寄主細(xì)胞畢赤酵母GS115，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，得到可溶性表達(dá)的重組α-L-鼠李糖苷酶V529A。

作為實施例的優(yōu)選方式，所述的甲醇終濃度為0.5％，誘導(dǎo)溫度為30℃。

作為實施例的優(yōu)選方式，α-L-鼠李糖苷酶V529A催化水解的溫度范圍為30℃～80℃，最適溫度為60℃；所述的水解pH范圍為3.0～10.0，最適pH為5.0。最適溫度及最適pH與WT一致。

以pNPR為底物，分別將WT及V529A分別放置在60℃，65℃，70℃下進(jìn)行熱處理，其中，60℃下每2h取樣測定殘余酶活，65℃下每15min取樣測定殘余酶活，70℃下每2min取樣測定殘余酶活，上述酶反應(yīng)在其他反應(yīng)條件固定的情況下測定。初始酶活為沒有經(jīng)過熱處理的酶液測定的酶活。結(jié)果顯示，60℃下V529A的熱穩(wěn)定性比WT提高了1.92h；65℃下V529A的熱穩(wěn)定性比WT提高了25min；70℃下V529A的熱穩(wěn)定性比WT提高了2min。

V529A對試驗使用的金屬離子及效應(yīng)物都具有與WT同樣的耐受性。

本發(fā)明通過易錯PCR隨機突變的方法得到一株α-L-鼠李糖苷酶熱穩(wěn)定性提高的突變體V529A，發(fā)現(xiàn)了該突變體具有優(yōu)良的酶學(xué)特性，可應(yīng)用于飲料加工行業(yè)和藥物制備行業(yè)。同時，本次發(fā)明也克隆得到了可以大量表達(dá)的工程菌，可實現(xiàn)該熱穩(wěn)定性提高的α-L-鼠李糖苷酶的規(guī)?；a(chǎn)，為后續(xù)的工業(yè)化應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的SDS-PAGE圖。其中，M：分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1：純化后的WT；2：純化后的V529A；

圖2為α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A在60℃時的熱穩(wěn)定性曲線圖；

圖3為α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A在65℃時的熱穩(wěn)定性曲線圖；

圖4為α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A在70℃時的熱穩(wěn)定性曲線圖；

圖5為α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的最適反應(yīng)溫度曲線圖；

圖6為α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的最適反應(yīng)pH曲線圖；

圖7為α-L-鼠李糖苷酶WT的pH穩(wěn)定性曲線圖；

圖8為α-L-鼠李糖苷酶V529A的pH穩(wěn)定性曲線圖。

具體實施方式

實施例1：α-L-鼠李糖苷酶基因的獲取

接種含有WT(pPIC9K-rha)質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α于含有1mg/mL氨芐抗性的30mL LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16h。

使用質(zhì)粒小提取試劑盒(Takara公司)按說明提取WT(pPIC9K-rha)質(zhì)粒。采用EcoR I及Bln I雙酶切驗證。驗證結(jié)果正確后作為易錯PCR的模板。

實施例2：α-L-鼠李糖苷酶突變庫的構(gòu)建及篩選

將WT基因進(jìn)行易錯PCR，建立突變庫，96微孔板對該酶進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過篩選，獲得了熱穩(wěn)性顯著提高的突變體。

采用WT(KC750908.1)基因，設(shè)計一對特異性引物：

上游引物Q9KF(SEQ ID NO.3)：5′-CCGGAATTCGTACCCTACGAGGAGTACATTCTAG-3′，

下游引物Q9KR(SEQ ID NO.4)：5′-CGCCCTAGGTTACACATTCAACCGCCATTTC-3′；

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸2.5min，35循環(huán)后，72℃延伸7min。使用Takara公司PCR產(chǎn)物柱式回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

采用酶切克隆的方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，即用EcoRI和BlnI雙酶切易錯PCR產(chǎn)物，割膠回收酶切后的片段與同樣經(jīng)EcoRI和BlnI雙酶切的質(zhì)粒pPIC9K進(jìn)行連接，采用CaCl₂轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中。從氨芐抗性篩選平板挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定含α-L-鼠李糖苷酶的重組質(zhì)粒，提取PCR陽性菌落的質(zhì)粒進(jìn)行測序，驗證陽性克隆率及庫容量。

將PCR驗證正確的pPIC9K-rha^ep的陽性克隆子提取質(zhì)粒并使用SalI將所提質(zhì)粒線性化，采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，涂于MD平板中30℃培養(yǎng)直至長出單菌落，將所有單菌落分別進(jìn)行保種并用96孔板進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及篩選。將其誘導(dǎo)表達(dá)后的酶液在65℃下進(jìn)行熱處理，篩選得到1株熱穩(wěn)定性提高的突變體，提取該突變體的基因組進(jìn)行PCR實驗驗證，并進(jìn)行測序確定該突變體的突變位點。經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)，該突變體是529位Val突變?yōu)锳la。

實施例3：利用重組表達(dá)菌株表達(dá)和純化α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A

將菌種以1％接種量接種于50mLYPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種活化，30℃振蕩培養(yǎng)16h；再以1％的接種量將活化菌種接種至100mL的BMGY培養(yǎng)基，30℃，200r/min，培養(yǎng)16h后，測量確定其OD₆₀₀達(dá)到3.0-5.0范圍內(nèi)；利離心10min收集所有菌體，棄上清，將菌體加全部轉(zhuǎn)接至100mLBMMY培養(yǎng)基，30℃，培養(yǎng)7d，培養(yǎng)期間每隔24h則向培養(yǎng)基中加入0.5％無菌甲醇溶液；培養(yǎng)結(jié)束，離心收集上清即為酶液。

收集α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A粗酶液，經(jīng)30kDa的膜進(jìn)行超濾濃縮，備用。在流速0.5mL/min的條件，用20mmol/L的C₆H₈O₇-Na₂HPO₄緩沖液和0.15mol/L氯化鈉溶液對Sephacryl^TMS-200HR進(jìn)行平衡，將濃縮后的重組酶液進(jìn)行上樣，用1倍柱體積的pH 6.0的平衡緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，進(jìn)行α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A酶活的測定。將有α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A酶活的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。經(jīng)SDS-PAGE檢測，純化后的α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A蛋白的分子量為90kDa，結(jié)果如圖1所示。

實施例4：α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的活性檢測

采用對硝基苯酚-α-L-鼠李糖苷(pNPR)法測定α-L-鼠李糖苷酶的活力。具體操作：以pNPR為底物，取10μL酶液與490μL緩沖液混合，取20μL混合液加入至60μL的0.1％的pNPR溶液和120μL緩沖液在60℃條件下反應(yīng)10min后，加入200μL的1M的Na₂CO₃終止反應(yīng)，測定其在410nm處的吸光值，并計算相對酶活。空白對照組為在100℃下處理15min后滅活的WT及V529A。

實施例5：α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的熱穩(wěn)定性研究

α-L-鼠李糖苷酶原始型(WT)及突變體(V529A)在60℃，65℃，70℃的熱穩(wěn)定性研究，測定熱穩(wěn)定性時，以滅活菌液作為空白對照，沒有經(jīng)過熱處理條件下的酶作為最高酶活計算器相對酶活力。具體操作：

60℃時熱穩(wěn)定性的測定：取WT及V529A的酶液10μL與其對應(yīng)的最適pH的490μL緩沖液混合，將混合液放在60℃預(yù)處理16h，每隔2h取10μL混合液加入體系中并在最適溫度下反應(yīng)并測定其酶活力。測定結(jié)果表明：60℃下V529A的熱穩(wěn)定性比WT提高了1.92h，結(jié)果如圖2所示。

65℃時熱穩(wěn)定性的測定：取WT及V529A的酶液10μL與其對應(yīng)的最適pH的490μL緩沖液混合，混合液在65℃下預(yù)處理90min，每隔10min取10μL酶液加入中并在最適溫度下反應(yīng)并測定其酶活力。測定結(jié)果表明：65℃下V529A的熱穩(wěn)定性比WT提高了25min，結(jié)果如圖3所示。

70℃熱穩(wěn)定性的測定：取WT及V529A的酶液10μL與其對應(yīng)的最適pH的490μL緩沖液混合，混合液在70℃下預(yù)處理16h，每隔2h取10μL酶液加入體系中并在最適溫度下反應(yīng)并測定其酶活力。測定結(jié)果表明：70℃下V529A的熱穩(wěn)定性比WT提高了2min，結(jié)果如圖4所示。

實施例6：α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的酶學(xué)性質(zhì)分析

α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的最適溫度在30℃～80℃范圍內(nèi)進(jìn)行測定。具體操作：以pNPR為底物，取10μL酶液與490μL緩沖液混合，取20μL混合液加入至60uL的0.1％的pNPR溶液和120_μL緩沖液分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃條件下反應(yīng)10min后，加入200μL的1M的Na₂CO₃終止反應(yīng)，測定其在410nm處的吸光值，并計算相對酶活?？瞻讓φ战M為在100℃下處理15min后滅活的WT及V529A。測定結(jié)果表明：WT及V529A最適溫度均為60℃，結(jié)果如圖5所示。

α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A最適pH在3.0～12.0范圍內(nèi)進(jìn)行測定。具體操作為：以pNPR為底物，取10μL酶液與490μL緩沖液混合，取20μL混合液加入至60μL的0.1％pNPR溶液和120μL緩沖液在60℃下反應(yīng)10min后，加入200μL1M的Na₂CO₃終止反應(yīng)。分別將WT及V529A在pH 3.0～8.0，pH 8.0～10.0及pH 10.0～12.0中測定酶活，在其它條件一致下進(jìn)行酶反應(yīng)，空白對照組為在100℃下處理15min后滅活的WT及V529A。反應(yīng)終止后，吸取200μL到酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活。測定結(jié)果表明：WT及V529A最適pH均為5.0，結(jié)果如圖6所示。

α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的pH穩(wěn)定性在3.0～12.0范圍內(nèi)進(jìn)行測定。具體操作為：將10μLWT及V529A酶液分別在490μLpH 3.0～8.0，pH 8.0～10.0，pH 10.0～12.0的緩沖液中30℃下處理1h后，取出20uL處理液加入至60μL的0.1％pNPR溶液和120μL對應(yīng)緩沖液在60℃下反應(yīng)10min后，加入200μL 1M的Na₂CO₃終止反應(yīng)，測定其在410nm處的吸光值，并計算相對殘余酶活作圖?？瞻讓φ諡闆]有經(jīng)過各pH，30℃下處理的酶液。測定結(jié)果表明：WT及V529A在pH 3.0～8.0內(nèi)都能夠維持80％以上的酶活性，該酶具有很寬泛的pH耐受性，且比較嗜酸性。在pH 8.0～10.0范圍內(nèi)，WT及V529A仍舊可以維持60％以上的活性，證明該酶對堿性也有一定的耐受性。但在pH 10.0以上，該酶完全失活，證明在強堿性的條件下，該酶會受到很大的影響，結(jié)果如圖7及圖8所示。

金屬離子對α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的影響的測定具體操作為：取10μL WT及V529A酶液與含有不同濃度的金屬離子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺)的緩沖液混合至500μL，將混合液放置在30℃下處理1h后，取10μL酶液加入其對應(yīng)的最適反應(yīng)體系中反應(yīng)15min后，測定其酶活力。其空白對照組為沒有經(jīng)過金屬離子處理的酶液。測定結(jié)果，如表1所示：1mM及10mM的K⁺，Na⁺，Ca²⁺，Zn²⁺對WT及V529A都有一定的激活作用，Zn²⁺及Ca²+可以顯著提高酶活性。1mM的Fe²⁺對酶活性沒有影響，但是10mM的Fe²⁺抑制酶的活性，1mM及10mM的Fe³⁺對酶活性影響很大。由此結(jié)果可知，V529A突變位點并不會造成金屬離子對WT的影響，能夠與WT保持對金屬離子同樣的耐受性。

表1金屬離子對WT及V529A的影響

效應(yīng)物對α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A活性的影響的測定具體操作為：取10μL WT及V529A酶液與含有不同濃度的效應(yīng)物(SDS、β-ME、EDTA、DTT)的緩沖液混合至500μL，將混合液放置在30℃下處理1h后，取10μL酶液加入其對應(yīng)的最適反應(yīng)體系中反應(yīng)10min后，加入200μL 1M的Na₂CO₃溶液終止反應(yīng)，測定其酶活力。其空白對照組為沒有經(jīng)過效應(yīng)物處理的酶液。測定結(jié)果如表2所示：10mM的SDS對WT及V529A酶活影響較大，而對其它濃度的效應(yīng)物耐受性則較強，幾乎對酶活沒有產(chǎn)生影響。

表2不同效應(yīng)物對WT及V529A的影響

綜上所述，本發(fā)明篩選得到了黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶熱穩(wěn)定性提高的突變體，發(fā)現(xiàn)了該突變體具有優(yōu)良的酶學(xué)特性，可應(yīng)用于飲料加工行業(yè)和藥物制備行業(yè)。同時，本次發(fā)明也克隆得到了可以大量表達(dá)的工程菌，可實現(xiàn)該酯酶的規(guī)?；a(chǎn)，為后續(xù)的工業(yè)化應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。