本發(fā)明涉及高效降解有機磷農(nóng)藥的多功能木霉菌及其菌劑，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是利用微生物的方法降解化學農(nóng)藥殘留，適用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中綠色無公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)與加工。
背景技術(shù)：
農(nóng)藥污染已成為現(xiàn)在廣泛關(guān)注的重大農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境問題之一，對現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和社會經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展、農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境安全和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全構(gòu)成了嚴重威脅。有機磷農(nóng)藥作為國內(nèi)外農(nóng)業(yè)中主要的殺蟲劑，殺蟲迅速、高效，使用成本低，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，尤其設(shè)施蔬菜栽培上大量使用，為蔬菜農(nóng)藥殘留超標的主體。農(nóng)藥殘留是一種面源污染，濃度低、范圍廣，采用傳統(tǒng)的物理化學處理方法難度大、成本高，并且還有二次污染。利用微生物治理農(nóng)藥殘留是消除和解毒高濃度的農(nóng)藥殘留的最安全、有效且廉價的方法。
國內(nèi)外專家學者致力于研究有機磷農(nóng)藥的生物降解技術(shù)。降解菌主要從農(nóng)藥污染土壤或農(nóng)藥廠污泥等受污染的介質(zhì)中針對某一特定有機磷農(nóng)藥富集、馴化、篩選，種類主要集中在細菌，包括假單胞菌、芽孢桿菌、黃桿菌、節(jié)桿菌屬、不動桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌、蒼白桿菌、布魯氏菌、腸桿菌、紅球菌等；對有機磷農(nóng)藥的降解機理和降解酶基因方面的研究都有系統(tǒng)的研究。國內(nèi)在這方面也做了大量的研究，取得一系列研究成果，芽孢桿菌、惡臭假單胞菌、蒼白桿菌、鞘氨醇單胞菌等多個種類申請了國家發(fā)明專利。例如南京農(nóng)業(yè)大學針對部分有機磷農(nóng)藥、有機氮、有機氯類殺蟲劑、殺菌劑和除草劑等，分離篩選獲得500多株高效降解化學農(nóng)藥的微生物菌株（主要是細菌），建立了目前我國農(nóng)藥微生物降解最大的菌株種質(zhì)資源庫，62個降解菌株及其發(fā)酵工藝獲得國家發(fā)明專利。國內(nèi)外分離篩選的這些降解細菌對一種或幾種有機磷農(nóng)藥表現(xiàn)較強的降解修復潛力，但研究成果一般處于實驗室階段或小區(qū)試驗條件，實際用于產(chǎn)品登記推廣的較少，加上功能單一，不利推廣和示范，目前尚不能滿足土壤中實際污染控制的要求。
木霉菌因其生防能力、促進植物生長、提高土壤肥力等方面的應(yīng)用潛力，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域具有特殊的地位，是一類研究應(yīng)用廣泛的微生物種類，國內(nèi)外均有不少菌株獲得微生物產(chǎn)品（農(nóng)藥、肥料或腐熟菌劑）登記及推廣應(yīng)用。國內(nèi)外近些年的研究表明，木霉對殺蟲劑（如敵敵畏、毒死蜱、ddt、地特靈、硫丹等）、多環(huán)芳香烴、多氯芳烴、氰化物、重金屬（如鎘、鎳、銅、鋁等）及塑料等污染物都有較強的降解或修復能力，同樣表現(xiàn)出優(yōu)越的應(yīng)用開發(fā)潛力。
設(shè)施蔬菜自上世紀80年代中期以來，得到迅速發(fā)展。由于常年種植或連作，養(yǎng)分失調(diào)，病蟲害發(fā)生嚴重，化肥和農(nóng)藥頻繁且超量使用，土壤環(huán)境日益惡化（如土壤次生鹽漬化、酸化、養(yǎng)分失調(diào)），多種農(nóng)藥長期殘留，微生物生態(tài)失衡。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就是針對國內(nèi)設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤中存在的有機磷農(nóng)藥殘留，發(fā)病日益嚴重的土傳植物病害等實際問題和需求而提供一種高效降解有機磷農(nóng)藥的多功能木霉菌及其菌劑。本發(fā)明的木霉菌株，對設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤環(huán)境有更好的適應(yīng)性，同時對多種常見土傳病害有預防和控制效果，研發(fā)的木霉降解菌劑產(chǎn)品更利于應(yīng)用和推廣。
本發(fā)明的高效降解有機磷農(nóng)藥的多功能木霉菌及其菌劑技術(shù)方案為，本發(fā)明采用的降解多種有機磷農(nóng)藥的木霉菌株為西蒙斯木霉(trichodermasimmonsii)t21-3，是實驗室從設(shè)施番茄土壤中分離篩選出來的，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，100101，保藏日期為2016年6月24日，保藏編號為：cgmccn0.12630。將該菌株tef-1α序列提交ncbiblast進行相似性比較，鑒定該木霉為西蒙斯木霉(trichodermasimmonsii)，tef-1α基因序列已經(jīng)提交到了genbank數(shù)據(jù)庫，登錄號kx426072。
所述的高效降解有機磷農(nóng)藥的多功能木霉菌在降解土壤中的有機磷農(nóng)藥殘留方面的應(yīng)用。
所述的有機磷農(nóng)藥為甲胺磷、毒死蜱、氧化樂果、對硫磷、水胺硫磷、辛硫磷中的任意一種。
所述的高效降解有機磷農(nóng)藥的多功能木霉菌在防治蔬菜土傳病害方面的應(yīng)用。
所述的土傳病害為以下菌中的至少一種引起的：立枯絲核菌(rhizoctoniasolani)、尖孢鐮孢(fusariumoxysporum)、瓜果腐霉(pythiumaphanidermatum)、腐皮鐮孢菌(fusariumsolani)、大麗輪枝菌(verticilliumdahliae)及灰葡萄孢菌（botrytiscinerea）。
將西蒙斯木霉(trichodermasimmonsii)t21-3制備成木霉菌劑，該木霉菌劑有效成分為活體木霉分生孢子≥3×108cfu/g。
所述木霉菌劑為可濕性粉劑，由按重量比的以下成分組成：西蒙斯木霉t21-3分生孢子粉2～3%，羧甲基纖維素鈉1～2%，黃原膠1～2%，黃腐酸鈉1-2%，葡萄糖5～10%，硅藻土75～85%，含水量控制在5%以下。
該木霉菌劑的制備包括以下步驟：
a.制備西蒙斯木霉(trichodermasimmonsii)t21-3種子液；
b.制備固體發(fā)酵培養(yǎng)基；
c.將所述步驟a所得種子液按1%比例與步驟b固體發(fā)酵培養(yǎng)基混合，發(fā)酵，得到固體西蒙斯木霉發(fā)酵物；
d.將所述步驟c所獲固體西蒙斯木霉菌發(fā)酵物粉碎，過60或80目篩；
e.將硅藻土、黃原膠、羧甲基纖維素鈉、黃腐酸鈉、葡萄糖與步驟d所獲原料混合，攪拌均勻充分混合后得到淺綠色粉狀物，即為木霉菌劑。
該木霉菌劑的制備具體包括以下步驟：
a.將西蒙斯木霉(trichodermasimmonsii)t21-3菌種接入pda培養(yǎng)基中活化后，轉(zhuǎn)接于pda固體培養(yǎng)基或麥粒培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7d，待其產(chǎn)生大量的分生孢子，用無菌水洗脫，即得到西蒙斯木霉種子液，所述pda培養(yǎng)基是去皮馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂粉15克，加水至1000ml混合而成；所述麥粒培養(yǎng)基是將小麥粒用水浸泡，過夜，121℃條件下濕熱滅菌；
b.制備固體發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米秸稈40%、麥麩5%，余量為水的混合物在121℃下滅菌60分鐘，得到固體發(fā)酵培養(yǎng)基；
c.將所述步驟a所得種子液按1%比例與步驟b固體發(fā)酵培養(yǎng)基混合，攪拌均勻后用紗布或封口膜覆蓋，置于溫度為25-28℃恒溫靜止培養(yǎng)7-10d,木霉分生孢子達到60～100×108個/g，發(fā)酵完畢后，將其自然晾干或干燥，得到固體西蒙斯木霉發(fā)酵物；
d.將所述步驟c所獲固體西蒙斯木霉發(fā)酵物粉碎，過60或80目篩；
e.將硅藻土、黃原膠、羧甲基纖維素鈉、黃腐酸鈉、葡萄糖與步驟d所獲原料混合，攪拌均勻充分混合后得到淺綠色粉狀物，即為木霉菌劑。
所述的木霉菌劑在降解土壤中的有機磷農(nóng)藥殘留方面以及防治蔬菜土傳病害方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明從多年栽培施藥的設(shè)施蔬菜菜地分離出一株高效降解多種有機磷農(nóng)藥的木霉菌株西蒙斯木霉t21-3，該木霉菌株發(fā)酵容易，生產(chǎn)成本低，對設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤環(huán)境有較強的適應(yīng)性，對環(huán)境友好，不僅能高效降解土壤中的甲胺磷、毒死蜱、氧化樂果、對硫磷、水胺硫磷、辛硫磷等多種有機磷農(nóng)藥殘留，減少農(nóng)藥在土壤或蔬菜中的殘留危害；同時對由立枯絲核菌(rhizoctoniasolani)、尖孢鐮孢(fusariumoxysporum)、瓜果腐霉(pythiumaphanidermatum)、腐皮鐮孢菌(fusariumsolani)、大麗輪枝菌(verticilliumdahliae)及灰葡萄孢菌（botrytiscinerea）引起的多種常見土傳病害有預防和控制效果，減少或替代殺菌劑使用，有效調(diào)控土壤微生物區(qū)系。同時本發(fā)明的木霉降解菌劑產(chǎn)品更利于應(yīng)用和推廣，在現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)有機(綠色)蔬菜栽培過程中，具有很高的應(yīng)用推廣價值。
具體實施方式：
為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實例來詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明并不局限于此。
實施例1
降解有機磷農(nóng)藥的木霉菌劑的制備
本發(fā)明采用的降解多種有機磷農(nóng)藥的木霉菌株為西蒙斯木霉(trichodermasimmonsii)t21-3，是實驗室從設(shè)施番茄土壤中分離篩選出來的，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，100101，保藏日期為2016年6月24日，保藏編號為：cgmccn0.12630。將該菌株tef-1α序列提交ncbiblast進行相似性比較，鑒定該木霉為西蒙斯木霉(trichodermasimmonsii)，tef-1α基因序列已經(jīng)提交到了genbank數(shù)據(jù)庫，登錄號kx426072。
該木霉菌劑的制備包括以下步驟：
a.保存的西蒙斯木霉(trichodermasimmonsii)t21-3菌種接入pda平板培養(yǎng)基中活化后，轉(zhuǎn)接于500ml三角瓶中的pda固體培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，待其產(chǎn)生大量的分生孢子，用無菌水洗脫，即得到西蒙斯木霉種子液，所述pda培養(yǎng)基是去皮馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂粉15克，加水至1000ml混合而成；
b.制備固體發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米秸稈40%、麥麩5%，余量為水的混合物，在121℃下滅菌60分鐘，得到固體發(fā)酵培養(yǎng)基；
c.將所述步驟a所得種子液按1%比例與步驟b固體發(fā)酵培養(yǎng)基混合，攪拌均勻后用紗布或封口膜覆蓋，置于溫度為28℃的恒溫培養(yǎng)箱箱內(nèi)靜止培養(yǎng)8d,木霉分生孢子達到90×108個/g。發(fā)酵完畢后，將其自然晾干或干燥，得到固體西蒙斯木霉發(fā)酵物，木霉分生孢子達到150×108個/g；
d.將所述步驟c所獲固體西蒙斯木霉發(fā)酵物粉碎，過60或80目篩；
e.將硅藻土80%、黃原膠2%、羧甲基纖維素鈉1%、黃腐酸鈉1%、葡萄糖5%與步驟d所獲原料2%混合，攪拌均勻充分混合后得到淺綠色粉狀物，含水量控制在5%以下,即為本發(fā)明的木霉菌劑。
實施例2
降解有機磷農(nóng)藥的木霉菌劑的制備
該菌劑的制備包括以下步驟：
本實施案例同實施案例1，所不同之處在于：步驟a中，木霉菌株活化后轉(zhuǎn)接至麥粒固體培養(yǎng)基上，置于室溫條件下培養(yǎng)7d；步驟c中，接種后同樣置于室溫條件下(23-28℃)靜止培養(yǎng)10d,木霉分生孢子達到80×108個/g；步驟e中，硅藻土75%，葡萄糖8%，與步驟d所獲原料3%混合。
實施例3
本發(fā)明木霉菌在液體搖瓶條件對有機磷農(nóng)藥的降解試驗
步驟一：將保存的西蒙斯木霉(trichodermasimmonsii)t21-3菌種接入pda平板培養(yǎng)基中活化后，轉(zhuǎn)接于500ml三角瓶中的pda固體培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，待其產(chǎn)生大量的分生孢子，用無菌水洗脫，稀釋，即得到西蒙斯木霉種子液（1.0×108cfu/ml）；
步驟二：按100mg/l的濃度含量分別將甲胺磷、毒死蜱、氧化樂果、對硫磷、水胺硫磷、辛硫磷六種農(nóng)藥原藥加入到滅菌后的裝有50ml無機鹽液體培養(yǎng)基（msm）的250ml三角瓶中，分別接種各菌株木霉孢子種子液（1.0×108cfu/ml）1ml，所述msm無機鹽液體培養(yǎng)基是k2hpo41.50g，kh2po40.50g，mgso4·7h2o0.50g，(nh4)2so40.50g，feso4·7h2o0.002g，cacl20.04g，nacl0.5g，h2o1000ml，ph7.0；
步驟三：以不接木霉孢子懸液的處理為對照。每處理重復3次，置于30℃140rpm培養(yǎng)5d，取樣，并利用gc-ecd法檢測有機磷農(nóng)藥殘留量，結(jié)果如表1所示。
表1多功能木霉菌在液體搖瓶條件下對有機磷農(nóng)藥的降解作用
實施例4
本發(fā)明木霉菌對幾種常見蔬菜土傳病原物的抑菌試驗
步驟一：分別將保存的木霉t21-3和幾種土傳病原真菌，如立枯絲核菌(rhizoctoniasolani)、尖孢鐮孢(fusariumoxysporum)、瓜果腐霉(pythiumaphanidermatum)、腐皮鐮孢菌(fusariumsolani)、大麗輪枝菌(verticilliumdahliae)及灰葡萄孢菌（botrytiscinerea），接種在pda培養(yǎng)基上活化2d；
步驟二：用滅菌的直徑5mm的打孔器在木霉和各病原真菌菌落邊緣打取菌苔，分別移置于直徑9cm的pda平板上（間距6cm）,25℃條件下對峙培養(yǎng)，沒處理重復3次，以只接病原菌的為對照；
步驟三：待對照病原菌菌落快長到木霉接菌點或木霉菌落快長到病原菌接菌點時，測量各自菌落的半徑，并計算抑制率。結(jié)果如表2所示。
表2多功能木霉菌對幾種土傳植物病原真菌的對峙試驗
實施例5
本發(fā)明木霉菌劑對土壤中有機磷農(nóng)藥的降解試驗
步驟一：土壤（來自壽光設(shè)施番茄菜地）過20目篩，處理設(shè)兩組，a組121℃濕熱滅菌120分鐘，b組不滅菌；按100mg/kg的量分別添加甲胺磷、毒死蜱、氧化樂果、對硫磷、水胺硫磷、辛硫磷等有機磷農(nóng)藥，混拌均勻并吸附24h；
步驟二：將用農(nóng)藥處理過的土壤，裝18cm×15cm×15cm塑料試驗盆，每盆裝土壤1kg；
步驟三：將步驟二中的處理，按5%的接種量加入實施例1中制得的木霉菌劑，以不加木霉菌的處理作為對照；每處理設(shè)3盆重復；
步驟四：將處理組和對照組隨機擺放至恒溫氣候室（溫度28±2℃）內(nèi)，按常規(guī)盆栽條件管理，連續(xù)培養(yǎng)2周，采用gc-ecd的方法，取土樣測定有機磷農(nóng)藥的殘留量。結(jié)果如表3所示。
表3多功能木霉菌對土壤中有機磷農(nóng)藥的降解作用
實施例6
本發(fā)明木霉菌劑對番茄常見土傳病害的防治試驗
步驟一：土壤處理。設(shè)施菜地（壽光市紀臺鎮(zhèn)吳西劉村），按常規(guī)操作施有機肥，深翻，起垅（采取大小行小高垅方式，即大行70-80公分，小行40公分，垅高10-15公分）。自西向東均分成8等區(qū)間，將2、4、6區(qū)間作為處理，3、5、7作為對照；處理區(qū)間用實施例1中制得的的本發(fā)明木霉菌劑（5kg/畝）加25kg濕潤細土或有機肥拌勻,并均勻撒施，耙勻；對照區(qū)間不施本發(fā)明木霉菌劑。
步驟二：移栽。每垅定植兩行，移栽入番茄幼苗，同時處理垅以5kg/畝用量灌根。
步驟三：病害調(diào)查及數(shù)據(jù)分析。棚內(nèi)各區(qū)間5點取樣，每點調(diào)查10株，統(tǒng)計番茄常見土傳病害發(fā)病率，計算防效；計算數(shù)據(jù)用spss軟件進行統(tǒng)計分析，檢驗各處理平均值之間的差異顯著性；結(jié)果如表4所示。
表4本發(fā)明木霉菌劑對番茄常見土傳病害的防治作用
實施例7
本發(fā)明木霉菌劑對黃瓜常見土傳病害的防治試驗
步驟一：土壤處理。設(shè)施菜地（壽光市紀臺鎮(zhèn)任家洼村），按常規(guī)操作施有機肥，深翻，起垅（采取大小行方式，即大行80厘米，小行40厘米）。自西向東均分成8等區(qū)間，將2、4、6區(qū)間作為處理，3、5、7作為對照；處理區(qū)間用實施例1中制得的的本發(fā)明木霉菌劑（5kg/畝）加25kg濕潤細土或有機肥拌勻,并均勻撒施，耙勻；對照區(qū)間不施本發(fā)明木霉菌劑。
步驟二：移栽。每垅定植兩行（株距25-30厘米），移栽入黃瓜幼苗，同時處理垅以5kg/畝用量灌根。
步驟三：病害調(diào)查及數(shù)據(jù)分析。棚內(nèi)各區(qū)間5點取樣，每點調(diào)查10株，統(tǒng)計黃瓜常見土傳病害發(fā)病率，計算防效；計算數(shù)據(jù)用spss軟件進行統(tǒng)計分析，檢驗各處理平均值之間的差異顯著性；結(jié)果如表5所示。
表5本發(fā)明木霉菌劑對黃瓜常見土傳病害的防治作用