本發(fā)明涉及抗體的免疫檢測領(lǐng)域，特別是抗水痘帶狀皰疹病毒抗體、尤其是中和抗體的免疫檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

水痘是由水痘帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus， VZV)原發(fā)感染引起的疾病。水痘屬于高傳染性疾病，在世界范圍流行性傳播。水痘的易感人群主要是兒童，其特征為全身性皰疹并常伴有發(fā)熱癥狀。對于絕大多數(shù)具有正常免疫能力的兒童而言，水痘屬于一種良性的自限性疾病；但是對于因各種原因?qū)е旅庖吖δ艿拖碌娜巳海琕ZV感染可能引起嚴(yán)重的、甚至是致命的疾病。研究表明，自然感染或免疫接種水痘減毒活疫苗后，機(jī)體可以再次被水痘病毒感染或激活而不產(chǎn)生任何臨床癥狀，臨床上二次感染水痘較罕見。

VZV屬皰疹病毒科皰疹病毒亞科，為雙鏈DNA病毒。VZV呈現(xiàn)為典型的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)?；蚪M為線性雙鏈DNA分子，由大約124884個堿基對組成，分子量為(80±3)×106道爾頓。該病毒基因組由71個開放讀碼框(ORF)組成，編碼約69種蛋白質(zhì)?；虍a(chǎn)物按立即早期基因(IE)、早期基因(E)、晚期基因(L)順序進(jìn)行表達(dá)。L基因編碼一些結(jié)構(gòu)蛋白，如衣殼蛋白及糖蛋白。VZV病毒基因至少編碼9種糖蛋白：gE、gB、gH、gI、gC、gL、gK、gM、gN，他們主要存在于病毒囊膜和感染細(xì)胞的細(xì)胞膜中，與病毒的致病性和免疫原性有著密切關(guān)系。

國內(nèi)關(guān)于水痘方面的研究往往限于疫苗的研制和開發(fā)，而缺乏大范圍人群正式使用后的評估。只有從病人及人群進(jìn)行研究才能更好地對疫苗免疫效果進(jìn)行評估，并且經(jīng)臨床試驗(yàn)證明有效的疫苗應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行上市后大規(guī)模人群應(yīng)用后的研究，這樣能得到真實(shí)的保護(hù)效果狀況。隨著接種水痘疫苗人數(shù)的增加，現(xiàn)在迫切需要一種快速、簡便同時具有高靈敏度、高特異性優(yōu)點(diǎn)的檢測抗VZV抗體的方法，以此來判斷接種疫苗后個體對VZV的敏感度以及對疫苗的免疫應(yīng)答狀況。目前檢測VZV抗體的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、兔抗糖蛋白抗體ELISA(gpELISA)、膜抗原熒光抗體測定(fluorescent antibody to membrane antigen assay，F(xiàn)AMA)、間接熒光抗體試驗(yàn)(indirect fluorescent-antibody technique，IFAT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CF)、免疫吸附血凝試驗(yàn)((immune adherence hemagglutination assay，IAHA)、放射免疫法(radio immunoassay，RIA)、中和試驗(yàn)(ENT)、乳膠凝集試驗(yàn)(LA)等，其中最常用的是FAMA和ELISA法。

FAMA法是目前進(jìn)行血清中抗體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，是檢測人群VZV抗體水平最佳的方法，可以較準(zhǔn)確的確定免疫效果，已經(jīng)成為評價其他方法的標(biāo)準(zhǔn)。FAMA法在VZV與其它皰疹病毒一起時，并不會出現(xiàn)交叉性反應(yīng)，特異性良好，特別是在血清中抗VZV血清抗體水平比較低時靈敏度也較高，很適合用于疫苗免疫后血清學(xué)的評價。但FAMA法存在一些缺點(diǎn)，例如反應(yīng)時間長，操作繁瑣，不能實(shí)現(xiàn)自動化、標(biāo)準(zhǔn)化、不宜檢測大批量樣本，這使FAMA法不適合大批量的檢測血清，無法廣泛使用。

由于ELISA操作簡單、快速，并且可進(jìn)行大批量檢測，因此它是目前使用最為廣泛的方法。ELISA檢測特異性 IgG抗體水平應(yīng)用廣，ELISA間接法具有方法簡單、準(zhǔn)確度高、無需特殊儀器等特點(diǎn)，通過包被純化的表位抗原，以WHO VZV血清抗體參考品為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了定量檢測抗VZV中和抗體的 ELISA 方法。但目前市售的ELISA試劑盒采用的是全病毒抗原包被，因此敏感性較差。血清學(xué)方法檢測VZV抗體對于易感人群的確定和鑒別、水痘疫苗免疫策略的研究以及疫苗免疫效果的評價具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明經(jīng)過對VZV病毒基因組以及表達(dá)蛋白進(jìn)行分析找到了能夠特異性檢測抗VZV抗體的gE抗原，并且基于所發(fā)現(xiàn)的gE抗原可以實(shí)現(xiàn)特異性檢測人血中抗VZV抗體。

具體而言，在本發(fā)明的一個方面中，涉及一種檢測抗水痘帶狀皰疹病毒抗體、尤其是中和抗體的水痘帶狀皰疹病毒gE抗原，其中所述抗原選自如下氨基酸序列中的一種或一種以上：a. SEQ ID NO.1所示序列，或者通過氨基酸替換、缺失或者增加而與SEQ IDNO.1具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.1所示序列或者通過氨基酸替換、缺失或者增加而與SEQ IDNO.1具有80%以上相似性的序列的序列；b. SEQ ID NO.2所示序列，或者通過氨基酸替換、缺失或者增加而與SEQ IDNO.2具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.2所示序列或者通過氨基酸替換、缺失或者增加而與SEQ IDNO.2具有80%以上相似性的序列的序列。

在本發(fā)明的另一個方面中，涉及上述水痘帶狀皰疹病毒gE抗原在檢測抗水痘帶狀皰疹病毒抗體、尤其是中和抗體中的用途。在該方面的一些實(shí)施方案中使用上述水痘帶狀皰疹病毒gE抗原通過免疫檢測方法檢測所述抗水痘帶狀皰疹病毒抗體、尤其是中和抗體，免疫檢測方法例如酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、熒光免疫法、化學(xué)發(fā)光法、膠體金法、乳膠法以及其它方法，并且其中酶聯(lián)免疫法例如酶聯(lián)免疫吸附測定法，熒光免疫法例如時間分辨熒光免疫法。

在本發(fā)明的再一個方面中，涉及測定抗水痘帶狀皰疹病毒抗體、尤其是中和抗體的試劑盒，所述試劑盒包括檢測抗水痘帶狀皰疹病毒抗體、尤其是中和抗體的水痘帶狀皰疹病毒gE抗原，其中所述抗原選自如下氨基酸序列中的一種或一種以上：a. SEQ ID NO.1所示序列，或者通過氨基酸替換、缺失或者增加而與SEQ IDNO.1具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.1所示序列或者通過氨基酸替換、缺失或者增加而與SEQ IDNO.1具有80%以上相似性的序列的序列；b. SEQ ID NO.2所示序列，或者通過氨基酸替換、缺失或者增加而與SEQ IDNO.2具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.2所示序列或者通過氨基酸替換、缺失或者增加而與SEQ IDNO.2具有80%以上相似性的序列的序列。除此之外，試劑盒還包括免疫診斷方法例如酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、熒光免疫法、化學(xué)發(fā)光法、膠體金法或乳膠法等通常所使用的其它試劑。所述的這些試劑例如是檢測人IgG、IgM或者IgA的試劑，諸如羊或兔抗人IgG、IgM或IgA的抗體等。

附圖說明

圖1是描述水痘帶狀皰疹病毒gE序列抗原性分析的圖。

圖2顯示3種水痘帶狀皰疹病毒gE抗原純化后的SDS-PAGE圖。

具體實(shí)施方式

VZV的gE也稱作gpI，是由ORF68編碼的包含623個氨基酸的糖蛋白，分子量為60kDa-98kDa，具有典型的I型跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，包括一個544aa的親水性胞外區(qū)、17aa的疏水性跨膜區(qū)和62aa的富含電荷的胞內(nèi)區(qū)。VZVⅠ型糖蛋白是VZV所有糖蛋白中表達(dá)量最大的。gE蛋白主要分布在病毒顆粒的包膜以及感染VZV的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上?；诖耍景l(fā)明人認(rèn)為gE糖蛋白可能是潛在的VZV抗體檢測用抗原。

目前，水痘帶狀皰疹病毒中和抗體的檢測多以血凝試驗(yàn)檢測為主，通過檢測待測血清能否抑制由水痘帶狀皰疹病毒引發(fā)的紅細(xì)胞的凝集作用，確定水痘帶狀皰疹病毒中和抗體的存在。但該檢測過程中使用具有強(qiáng)傳染能力的水痘帶狀皰疹病毒，具有極大的危險性。因此本領(lǐng)域急需一種不使用水痘帶狀皰疹病毒的檢測抗VZV抗體、尤其是中和抗體的安全有效的方法。

為了實(shí)現(xiàn)對接種水痘疫苗后人群中是否產(chǎn)生抗VZV抗體、尤其是中和抗體進(jìn)行安全有效的檢測，本發(fā)明人基于上述gE的特點(diǎn)確定嘗試使用gE糖蛋白抗原對VZV抗體、尤其是中和抗體進(jìn)行檢測。首先本發(fā)明人對gE的抗原表位進(jìn)行了生物信息學(xué)研究，找到了3段可能的高抗原性的抗原片段，即SEQ ID NO.1、2或3所示序列，并對該3段gE抗原進(jìn)行了克隆表達(dá)，并且基于間接酶聯(lián)免疫技術(shù)使用水痘疫苗接種者血清對3種純化后的抗原片段的抗原特異性和靈敏度進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此3段抗原中片段1（20-100aa），2（101-190aa）能特異性地檢測感染水痘帶狀皰疹病毒或者接種水痘疫苗后人體內(nèi)的抗VZV抗體，尤其是中和抗體。

本領(lǐng)域眾所周知，與某一個抗原片段具有一定相似性的另一個氨基酸序列片段會具有相同或相似的免疫反應(yīng)，因此通常認(rèn)為，通過替換、添加或者缺失某些氨基酸而與本發(fā)明的2個gE抗原片段SEQ ID NO.1或2中的一個片段具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%相似性的序列具有與SEQ ID NO.1或2相同或者相似的免疫反應(yīng)，因而這些序列片段可以用于實(shí)施本發(fā)明的方案中，因此這些序列處于權(quán)利要求書要求保護(hù)的范圍內(nèi)。

并且本領(lǐng)域亦眾所周知，包含SEQ ID NO.1或2所示序列的序列、或者包含通過氨基酸替換、添加或者缺失而與SEQ ID NO.1或2中的一個片段具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%相似性的序列的序列同樣具有與SEQ ID NO.1或2相同或者相似的免疫反應(yīng)，因而這些序列片段也可以用于實(shí)施本發(fā)明的方案中，因此這些序列也處于權(quán)利要求書要求保護(hù)的范圍內(nèi)。

由于本發(fā)明采用了間接免疫酶聯(lián)檢測技術(shù)檢測抗水痘帶狀皰疹病毒中和抗體，有效地避免了在檢測過程中使用具有強(qiáng)傳染能力的水痘帶狀皰疹病毒，降低了整個實(shí)驗(yàn)的危險性。并且本發(fā)明的技術(shù)方案還具有簡單、易操作、重復(fù)性好等特點(diǎn)，容易得到推廣和應(yīng)用。

本領(lǐng)域眾所周知，本發(fā)明的3個gE抗原片段SEQ ID NO.1或2可以適用于任何免疫檢測方法以檢測感染水痘帶狀皰疹病毒或者接種水痘疫苗后人體內(nèi)的抗VZV抗體、尤其是中和抗體。這些檢測方法包括但不限于例如酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、熒光免疫法、化學(xué)發(fā)光法、膠體金法或乳膠法。其中實(shí)施例中使用的間接免疫酶聯(lián)檢測技術(shù)屬于酶聯(lián)免疫法中的酶聯(lián)免疫吸附測定法。再例如，熒光免疫法可以是例如時間分辨熒光免疫法。這些方法均可以用來實(shí)施本發(fā)明，因此處于權(quán)利要求書中要求保護(hù)的范圍內(nèi)。

抗體或者中和抗體可以是IgG、IgM或者IgA亞類，因此在使用本發(fā)明的gE抗原實(shí)現(xiàn)抗VZV抗體、尤其是中和抗體檢測的過程中有時會使用到檢測人IgG、IgM或者IgA的試劑，這是本領(lǐng)域眾所周知的。而所述的這些檢測試劑也是本領(lǐng)域眾所周知的，例如但不限于諸如羊或兔抗人IgG、IgM或IgA的抗體等。因此在本發(fā)明要求保護(hù)的試劑盒中，除了本發(fā)明的gE抗原片段外還包含這些檢測IgG、IgM或者IgA的試劑，以及任選的其他試劑，例如緩沖液等。

下面通過如下實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)描述，但是以下實(shí)施例僅僅是作為例證，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。

實(shí)施例1 候選抗原中和表位的選擇

本發(fā)明人通過生物信息學(xué)軟件對水痘帶狀皰疹病毒gE序列進(jìn)行抗原性預(yù)測，結(jié)果如圖1所示，含有3個主要的抗原區(qū)段，其序列分別示于SEQ ID NO.1、2或3中。

實(shí)施例2 兩種水痘帶狀皰疹病毒gE抗原的克隆、表達(dá)與活性鑒定

1. gE抗原基因的設(shè)計與合成

為了有利于水痘帶狀皰疹病毒gE基因在E.coli中獲得高效的表達(dá)，基于實(shí)施例1中確定的3種水痘帶狀皰疹病毒gE抗原的氨基酸序列，選擇大腸桿菌的偏性密碼子設(shè)計gE基因，并委托上海英濰捷基生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成上述序列的基因。

2. gE抗原表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

為了便于將基因克隆到表達(dá)載體中，在連接臂的兩端引入Xho I和Xba I兩個酶切位點(diǎn)，以適合表達(dá)載體pBVIL1( 參見中國專利ZL00100695.9：表達(dá)載體pBVIL1及其構(gòu)建方法和用途)。雙酶切后插入載體pBVIL1中，構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒。

2.1 酶切：取以上合成基因產(chǎn)物及pBVIL1表達(dá)載體各82μl分別放于Eeppendorf 離心管中，各加入10×buffer(H)10μl、Xba I (10u/μl)和Xho I (12u/μl) 各3μl，BSA 2μl，置37℃ 水浴酶切過夜。

2.2酶切產(chǎn)物的純化和回收：基因產(chǎn)物及載體pBVIL1經(jīng)雙酶切后，按照《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)中所述的方法進(jìn)行用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，并用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的小量膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。即在紫外燈下分別切下含質(zhì)粒和目的基因的瓊脂糖凝膠，放于Eeppendorf 離心管中，各加入溶膠/結(jié)合液，置65℃水浴5分鐘使膠溶解，然后分別移入吸附柱后， 按試劑盒說明書進(jìn)行純化。

2.3 連接：于滅菌Eeppendorf 離心管中加入上述酶切并純化后的載體 1μl、目的基因3μl，T4 DNA Ligase 4μl，置16℃連接5h以上。

2.4 轉(zhuǎn)化：在超凈工作臺中，用無菌吸頭取100μl HB101感受態(tài)細(xì)胞(感受態(tài)細(xì)胞按照《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)的方法制備)懸液于Eppendorf中， 加入上述連接物8μl，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30分鐘。立即轉(zhuǎn)移到42℃水浴中放置2分鐘，每管加入1ml LB培養(yǎng)基(不加抗生素)，30℃水浴搖床培養(yǎng)60分鐘后，各取 0.2ml分別涂于LB瓊脂培養(yǎng)基平皿上(含抗生素)，室溫晾干后， 置37℃恒溫箱倒置培養(yǎng)過夜。

2.5 鑒定：挑選菌落分別接種于LB中(5 ml/管)，培養(yǎng)過夜，次日各取0.1ml轉(zhuǎn)移到LB中(2 ml /管)，32℃培養(yǎng)3小時，42℃水浴搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，收菌，用SDS-PAGE鑒定，選擇目的基因獲得高表達(dá)菌株，并經(jīng)測序鑒定載體中所插入的基因片段完全正確。

3．gE抗原的表達(dá)與純化

3.1表達(dá)菌株的培養(yǎng)：取-70℃保存的表達(dá)菌株20μl接種于LB培養(yǎng)基中(100 ml LB/500 ml三角瓶)，37℃空氣搖床培養(yǎng)過夜，次日按5%的比例轉(zhuǎn)種于LB培養(yǎng)基(同上)，30℃空氣搖床培養(yǎng)約3小時，當(dāng)OD600值達(dá)到0.7時，立即將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)到42℃水浴搖床中，誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時。將菌液合并，6000 rpm離心20分鐘，棄上清，收集沉淀部分。

3.2提取包涵體：將沉淀稱濕重，用10倍體積的20 mmol/L pH8.5 TE緩沖液將沉淀懸起，加入溶菌酶(1 mg/ml懸液)，在室溫下磁力攪拌10分鐘。在冰浴中超聲波破碎菌，每次超聲3秒鐘，間隔7秒鐘，共超聲20分鐘。4℃，12000 rpm，離心10分鐘，棄上清，沉淀用1 mol/L NaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用6M脲(用pH8.5 TE配制)溶解，加1%β-巰基乙醇。再過濾去沉淀取上清。

3.3純化：將上述溶解的包涵體溶液過Q-SepgEroseFF陰離子交換柱，用平衡液(pH8.5，25 mmol/L TE，含6mol/L脲，0.1％β-巰基乙醇)清洗后，用不同濃度的NaCl(用平衡液配制)洗脫，收集各洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，收集0.05 mol/L NaCl洗脫峰。再過SepgErdexG-50凝膠過濾柱，收集第一洗脫峰。各種純化重組表位抗原均用SDS-PAGE鑒定。通過上述的離子交換柱和凝膠過濾純化，獲得了兩種電泳純的水痘帶狀皰疹病毒gE抗原純品。

4. gE抗原的活性鑒定

將純化的候選抗原用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋為2.5μg/ml，三個抗原分別包被ELISA測定板，經(jīng)封閉后，對本室保存的內(nèi)質(zhì)控血清(含國內(nèi)10份水痘疫苗接種者血清和10份未接種疫苗健康獻(xiàn)血者血清)進(jìn)行了測定。原始測定結(jié)果如表1所示。經(jīng)分析的不同gE抗原的活性分析結(jié)果如表2所示，其中抗原1和抗原2具有很高的特異性和靈敏度。

表1水痘帶狀皰疹病毒gE抗原活性檢測數(shù)據(jù)

表2 水痘帶狀皰疹病毒gE抗原活性分析結(jié)果

實(shí)施例3 VZV抗體檢測

采用gE抗原1(SEQ ID NO.1)和抗原2(SEQ ID NO.2)包被酶聯(lián)板，利用間接ELISA法使用羊抗人IgG的抗體對血清中疫苗引起的水痘帶狀皰疹病毒中和抗體進(jìn)行檢測，測定結(jié)果以及分析結(jié)果如表3所示：抗原1(SEQ ID NO.1)50例水痘帶狀皰疹疫苗接種前標(biāo)本組中有1例gE-IgG檢測結(jié)果為陽性，49例陰性，陽性率為 2%。100例疫苗組中90例gE-IgG檢測為陽性，10例陰性，陽性率為90%。抗原2(SEQ ID NO.2)50例水痘帶狀皰疹疫苗接種前標(biāo)本組中有8例gE-IgG檢測結(jié)果為陽性，42例陰性，陽性率為 16%。100例疫苗組中89例gE-IgG檢測為陽性，11例陰性，陽性率為89%。疫苗組陽性率顯著高于疾病流行前組(P<0.01)。因此抗原1或抗原2包被作為抗體檢測試劑具有較高的特異性和靈敏度，在水痘疫苗的療效評價中具有實(shí)用價值。

表3 水痘帶狀皰疹病毒抗體檢測分析結(jié)果

序列表

<110> 北京市華信行生物科技有限公司

<120> 水痘帶狀皰疹病毒gE抗原及其在檢測抗水痘帶狀皰疹病毒抗體中的用途

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 81

<212> PRT

<213> 水痘帶狀皰疹病毒(Varicella zoster)

<400> 1

Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val Leu Arg Tyr

1 5 10 15

Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn Ser Val Tyr

20 25 30

Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg

35 40 45

Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro Tyr Ile Trp

50 55 60

Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His Glu His His

65 70 75 80

Gly

<210> 2

<211> 90

<212> PRT

<213> 水痘帶狀皰疹病毒

<400> 2

Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu Arg Leu Met Gln

1 5 10 15

Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp Asp Thr Gly Ile

20 25 30

His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His Lys Ile Val Asn

35 40 45

Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly Asp Leu Asn Pro

50 55 60

Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val Glu Glu Asn His

65 70 75 80

Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg

85 90

<210> 3

<211> 110

<212> PRT

<213> 水痘帶狀皰疹病毒

<400> 3

Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys

1 5 10 15

Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp

20 25 30

Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val

35 40 45

Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg

50 55 60

Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys

65 70 75 80

Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro

85 90 95

Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val

100 105 110