本發(fā)明涉及的是一種生物醫(yī)藥領(lǐng)域的技術(shù)，具體是一種從蕁麻地上部分中同時制備兩個高純度新化合物—蕁麻內(nèi)酯A及蕁麻內(nèi)酯B的方法。

背景技術(shù)：

蕁麻(Urtica fissa E.Pritz.)為蕁麻科蕁麻屬的多年生草本植物，是一常用的民族藥、民間藥。廣布于我國貴州、四川、重慶、福建、廣西、湖南、湖北、江蘇、浙江、安徽、甘肅、陜西、河南等地，藥用資源豐富；藥用始載于宋·《圖經(jīng)本草》，歷史悠久。以全草(地上部分)入藥，性溫，味苦、辛，有祛風除濕、平肝定驚、活血止痛、解毒等功效。在我國民族醫(yī)學中，蕁麻被廣泛地用于治療風濕疼痛、皮膚濕疹、蕁麻疹、小兒驚風、等疾病。在現(xiàn)代醫(yī)學中，蕁麻主要用于風濕性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療，療效顯著，且無明顯的毒副作用。然而，蕁麻抗風濕活性成分尚不清楚。

然而，蕁麻化學成分十分復雜，含有蕁麻醇、橄欖脂素、異落葉松脂醇、蕁麻苷等一系列木脂素類成分；除此之外，還含有大量葉綠素、黃酮、核苷、生物堿、脂肪酸類成分。因此，蕁麻內(nèi)酯A、蕁麻內(nèi)酯B分離難度很大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種制備高純度木脂素類化合物的方法，能夠用于蕁麻藥材的準確、快速鑒定及質(zhì)量評價。該方法具有簡便、快速、所得產(chǎn)品純度高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明涉及一類木脂素類化合物，包括蕁麻內(nèi)酯A(Urticalactone A)和蕁麻內(nèi)酯B(Urticalactone B)，其化學結(jié)構(gòu)為：

本發(fā)明涉及上述木脂素類化合物的應(yīng)用，將其用于制備抗類風濕類藥物，對脂多糖誘導的RAW264.7細胞分泌TNF‐α、NO等炎癥因子均有顯著抑制作用。

本發(fā)明涉及上述木脂素類化合物的提取方法，通過從蕁麻(Urtica fissa E.Pritz.)中萃取得到的浸膏經(jīng)樹脂洗脫得到蕁麻內(nèi)酯A粗提物和蕁麻內(nèi)酯B粗提物后，再通過二次柱層析后重結(jié)晶得到蕁麻內(nèi)酯A和蕁麻內(nèi)酯B精制品。

所述的蕁麻全草為蕁麻(Urtica fissa E.Pritz.)的干燥地上部分。

所述的萃取，通過乙酸乙酯實現(xiàn)。

所述的樹脂洗脫，采用但不限于D101大孔樹脂柱，通過二氯甲烷‐甲醇溶液梯度洗脫。

所述的樹脂洗脫，通過洗脫后經(jīng)TLC A法或TLC B法檢測后合并主斑點相同的流份。

所述的二次柱層析是指：針對蕁麻內(nèi)酯A粗提物，采用硅膠柱進行第二次層析；針對蕁麻內(nèi)酯B粗提物，采用ODS柱進行層析；

所述的ODS柱進行層析，優(yōu)選采用C₁₈反相硅膠。

所述方法具體包括以下步驟：

1)先將蕁麻全草粉碎，加入乙醇回流提取，提取液過濾回收乙醇(可再次用于提取)得醇浸膏。醇浸膏懸浮于水，經(jīng)石油醚脫脂、脫色素后，用乙酸乙酯萃取，減壓回收乙酸乙酯(回收乙酸乙酯用于下次萃取)，得乙酸乙酯浸膏。

所述的回流提取中，乙醇和蕁麻干粉的料液比為1:10～1:16(g/mL)，所用的乙醇濃度為70％～95％(v/v)，提取次數(shù)為2～3次，提取時間為1～3h。

所述的石油醚萃取和乙酸乙酯萃取次數(shù)各為2～3次。

2)將乙酸乙酯浸膏進行第一次硅膠柱層析(二氯甲烷‐甲醇溶液梯度洗脫)，收集流份并回收溶劑(可再次用于洗脫)，用TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值為0.65‐0.80(相對β‐谷甾醇)的流份，得蕁麻內(nèi)酯A粗提物；用TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值為0.9‐1.1(相對胡蘿卜苷)的流份，得蕁麻內(nèi)酯B粗提物。

所述的第一次硅膠柱層析硅膠為200～300目，上樣量為1:30～1:50(w/w)；二氯甲烷‐甲醇溶液梯度洗脫中，二氯甲烷‐甲醇溶液其體積比為100：0、97.5：2.5、95：5、90：10，每個梯度洗脫3個柱體積。

所述的TLC A法檢測為：將樣品與β‐谷甾醇共薄層(硅膠G預制板)，以二氯甲烷‐甲醇95：5為展開劑，展于后電吹風吹干展開劑，以10％硫酸乙醇溶液為顯色劑，加熱顯色進行檢測，計算樣品主斑點與β‐谷甾醇的相對Rf值。

所述的TLC B法檢測為：將樣品與胡蘿卜苷共薄層(硅膠G預制板)，以二氯甲烷‐甲醇9：1為展開劑，展于后電吹風吹干展開劑，以10％硫酸乙醇溶液為顯色劑，加熱顯色進行檢測，計算樣品主斑點與β‐谷甾醇的相對Rf值。

3)將步驟2所得蕁麻內(nèi)酯A粗提物進行第二次硅膠柱層析(二氯甲烷‐甲醇梯度洗脫)收集流份并回收溶劑(可再次用于洗脫)，用TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值為0.65‐0.80(相對β‐谷甾醇)的流份，即得蕁麻內(nèi)酯A粗品，或?qū)⒉襟E2所得蕁麻內(nèi)酯B粗提物經(jīng)ODS柱層析用(甲醇‐水溶液梯度洗脫)，收集流份并回收溶劑(可再次用于洗脫)，用TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值為0.9‐1.1(相對胡蘿卜苷)的流份，得到蕁麻內(nèi)酯B粗品。

所述的第二次硅膠柱層析的上樣量為1:300～1:500；硅膠為200～300目。二氯甲烷‐甲醇溶液梯度洗脫中，二氯甲烷‐甲醇溶液其體積比為100：1、100：2、100：3，每個梯度洗脫5個柱體積。

所述的ODS柱層析采用C₁₈反相硅膠(ODS)，粒徑為45～75μm，樣量比為1:200～1:300(樣品比反相硅膠，w/w)。

所述的甲醇‐水溶液梯度洗脫中，甲醇‐水溶液其體積比為6：4、7：3、8：2、9：1，每個梯度洗脫3個柱體積。

4)將蕁麻內(nèi)酯A粗品、蕁麻內(nèi)酯B粗品分別利用甲醇重結(jié)晶1次，得到白色粉末狀蕁麻內(nèi)酯A精制品、蕁麻內(nèi)酯B精制品。

技術(shù)效果

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以同時制備兩種新化合物蕁麻內(nèi)酯A、B兩種精制品；所得產(chǎn)品純度高，均在95％以上。以蕁麻地上部分作為原料，豐富易得；同時，又有利于蕁麻的再生，保護生態(tài)及蕁麻資源。采用乙醇提取藥材，既提高了收率，同時又去除了蕁麻中水溶性大分子成分(如多糖、蛋白質(zhì))的干擾，簡化了制備工藝。采用石油醚萃取，去除了大部分葉綠素及脂肪酸的干擾；采用乙酸乙酯萃取，既富集了目標成分，又進一步排除了水溶性成分的干擾，且目標產(chǎn)物損失少，樣品收率高；同時，綜合運用正相、反相這兩種分離機制不同的層析介質(zhì)，大大提高了分離效果；使用TLC檢測，對豐富易得的β‐谷甾醇、胡蘿卜苷作為對照，避免了濕度、濕度等對Rf值的影響，有利于準確鎖定目標產(chǎn)物。整個制備過程使用的溶劑乙醇、石油醚、乙酸乙酯，以及分離中用到的填料均可反復使用，且無需HPLC等精密儀器進行純化，生產(chǎn)成本低。

附圖說明

圖1為TLC A法代表性色譜圖；

圖中的展開劑：二氯甲烷‐甲醇95：5；顯色劑：10％硫酸乙醇；1.蕁麻內(nèi)酯A；2.β‐谷甾醇；

圖2為TLC B法代表性色譜圖；

圖中的展開劑：二氯甲烷‐甲醇9：1；顯色劑：10％硫酸乙醇；1.蕁麻內(nèi)酯B；2.胡蘿卜苷；

圖3為蕁麻內(nèi)酯A的13C‐NMR圖(DMSO‐d6,150MHz)；

圖4為蕁麻內(nèi)酯B的13C‐NMR圖(DMSO‐d6,150MHz)。

具體實施方式

實施例1

本實施例1是在以下實施條件和技術(shù)要求條件下實施的：

1.蕁麻全草200g，加入2L 70％乙醇回流2次，每次1h，提取液濾過，回收乙醇得醇浸膏(31.2g)。

2.醇浸膏懸浮于300mL水中，300mL石油醚萃取2次，回收石油醚，棄去提取物；繼用300mL乙酸乙酯萃取2次，減壓回收乙酸乙酯，得浸膏4.1g。

3.取上述浸膏4.0g進行第一次硅膠柱層析(120g硅膠)，用二氯甲烷‐甲醇梯度洗脫，收集洗脫液，每份100mL。TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值0.65‐0.80(相對β‐谷甾醇)的流份，得蕁麻內(nèi)酯A提取物(213mg)；TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份(相對胡蘿卜苷)，得蕁麻內(nèi)酯B提取物(627mg)。

4.取蕁麻內(nèi)酯A提取物(200mg)進行第二次硅膠柱層析(60g硅膠，CH₂Cl₂‐MeOH梯度)，TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值0.65‐0.80的流份，即得蕁麻內(nèi)酯A粗品(41mg)。取蕁麻內(nèi)酯B提取物(500mg)進行ODS柱層析(100g反相硅膠，MeOH‐H₂O梯度洗脫)，TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份，即得蕁麻內(nèi)酯B粗品(117mg)。

5.將蕁麻內(nèi)酯A、B粗品分別用甲醇重結(jié)晶1次，干燥后，得蕁麻內(nèi)酯A精品22mg(純度為95.2％，HPLC法)、蕁麻內(nèi)酯B精品75mg(純度為95.5％，HPLC法)。

實施例2

本實施例2是在以下實施條件和技術(shù)要求條件下實施的：

1.蕁麻全草100g，加入1.3L乙醇回流2次，每次2h，提取液濾過，回收乙醇至干得醇浸膏(24.7g)。

2.取醇浸膏20g懸浮于200mL水，200mL石油醚萃取3次，回收石油醚，棄去提取物；繼用200mL乙酸乙酯萃取2次，減壓回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯浸膏3.2g。

3.取乙酸乙酯浸膏3.0g進行第一次硅膠柱層析(120g硅膠)，用二氯甲烷‐甲醇梯度洗脫，收集洗脫液，每份50mL。TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值0.65‐0.80的流份，得蕁麻內(nèi)酯A提取物(141mg)；TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份，得蕁麻內(nèi)酯B提取物硅膠TLC檢測(展開劑顯色方法)，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份，得蕁麻內(nèi)酯B提取物(409mg)。

4.取蕁麻內(nèi)酯A提取物(100mg)進行第二次硅膠柱層析(40g硅膠，CH₂Cl₂‐MeOH梯度)，TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值0.65‐0.80的流份，即得蕁麻內(nèi)酯A粗品(30mg)。取蕁麻內(nèi)酯B提取物(400mg)進行ODS柱層析(100g反相硅膠，MeOH‐H₂O梯度洗脫)，TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份，即得蕁麻內(nèi)酯B粗品(82mg)。

5.將蕁麻內(nèi)酯A、B用甲醇重結(jié)晶1次，干燥后，得蕁麻內(nèi)酯A精品14mg(純度為96.2％)、蕁麻內(nèi)酯B精品52mg(純度為96.0％)。

實施例3

本實施例3是在以下實施條件和技術(shù)要求條件下實施的：

1.蕁麻全草200g，加入3.2L 95％乙醇回流3次，每次3h，濾過，提取液濾過，回收乙醇至干得醇浸膏(46.4g)。

2.取醇浸膏40g懸浮于400mL水中，400mL石油醚萃取3次，回收石油醚，棄去提取物；繼用400mL乙酸乙酯萃取3次，減壓回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯浸膏6.7g。

3.取乙酸乙酯浸膏6g進行第一次硅膠柱層析(300g硅膠)，用二氯甲烷‐甲醇梯度洗脫，收集洗脫液，每份150mL。TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值0.65‐0.80的流份，得蕁麻內(nèi)酯A提取物(274mg)；TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份，得蕁麻內(nèi)酯B提取物硅膠TLC檢測，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份，得蕁麻內(nèi)酯B提取物(909mg)。

4.取蕁麻內(nèi)酯A提取物(240mg)進行第二次硅膠柱層析(120g硅膠，CH₂Cl₂‐MeOH梯度)，TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值0.65‐0.80的流份，即得蕁麻內(nèi)酯A粗品(60mg)。取蕁麻內(nèi)酯B提取物(800mg)進行ODS柱層析(240g反相硅膠，MeOH‐H₂O梯度洗脫)，TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份，即得蕁麻內(nèi)酯B粗品(154mg)。

5.將蕁麻內(nèi)酯A、B用甲醇重結(jié)晶1次，干燥后，得蕁麻內(nèi)酯A精品43mg(純度為96.6％)、蕁麻內(nèi)酯B精品84mg(純度為95.3％)。

通過上述實施例制備得到的藥物均具有以下顯著的抗類風濕作用：

1)抗炎作用：觀察樣品對脂多糖誘導的RAW264.7細胞炎癥因子分泌的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同濃度(0.1、0.5、2.5、12.5、62.25)的蕁麻內(nèi)酯A、蕁麻內(nèi)酯B對于1μg/mL LPS刺激RAW264.7細胞分泌TNF‐α、NO炎癥因子的分泌有抑制作用，其半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)如表1所示：

表1蕁麻內(nèi)酯對LPS誘導RAW264.7細胞24h分泌TNF‐α、NO的抑制作用

(n＝3，)

2)免疫調(diào)節(jié)作用：脾臟是機體最大的免疫器官，而淋巴細胞和巨噬細胞是脾臟里面主要細胞，是機體免疫和體液免疫的中心。研究發(fā)現(xiàn)類風濕模型大鼠的脾臟變大，而且脾臟中淋巴細胞的百分含量增加。本實驗采用類風濕大鼠模型的脾淋巴細胞，觀察在ConA的刺激下，樣品對脾淋巴細胞增殖的影響。結(jié)果顯示：蕁麻內(nèi)酯A、蕁麻內(nèi)酯B在0.5μg/mL濃度即有明顯抑制淋巴細胞增殖作用(結(jié)果見表2)。

表2蕁麻內(nèi)酯對類風濕模型大鼠脾淋巴細胞增殖的抑制作用

上述具體實施可由本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明原理和宗旨的前提下以不同的方式對其進行局部調(diào)整，本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求書為準且不由上述具體實施所限，在其范圍內(nèi)的各個實現(xiàn)方案均受本發(fā)明之約束。