本發(fā)明涉及甲基硫赭曲霉素，具體是涉及甲基硫赭曲霉素的制備方法及其作為炎癥因子的抑制劑的應用。

背景技術(shù)：

炎癥是多種疾病的一個標志性特征，與炎癥發(fā)生發(fā)展最相關(guān)的炎癥因子主要是腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)。眾多的研究表明，臨床上許多疾病都與TNF-α介導的炎癥反應有密切關(guān)系，如心腦缺血再灌注損傷、類風濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、動脈粥樣硬化等等。TNF-α介導的炎癥反應主要是通過核因子-κB(NF-κB)信號通路來實現(xiàn)的。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，通常情況下NF-κB是以非活性狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中，當NF-κB被激活，會發(fā)生核轉(zhuǎn)位進入細胞核中，介導相關(guān)細胞因子、趨化因子及黏附因子如TNF-α、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)等的產(chǎn)生，而TNF-α又可再作用促炎癥因子介導炎癥信號的表達，周而復始形成放大的炎癥反應，加速病情的發(fā)展。因此阻斷TNF-α介導的炎癥反應對改善和治療相關(guān)疾病具有重要的臨床意義。

目前針對由TNF-α過量產(chǎn)生所導致的炎癥性疾病采取的主要是延緩和阻止疾病進程的保守治療，包括糖皮質(zhì)激素(如強的松)、非甾體抗炎藥和免疫抑制劑(如阿貝西普)三大類，但都是屬于“治標不治本”。針對TNF-α的蛋白質(zhì)性質(zhì)開發(fā)的大分子抗體藥物，目前已經(jīng)批準上市的有三種單抗，它們具有起效迅速、耐受性好等優(yōu)點，但價格昂貴，一年的治療費用約需1萬美元，而且只能采取注射的方式給藥。陸續(xù)有報道指出，使用TNF-α大分子生物拮抗劑增加了患者感染肺結(jié)核和淋巴瘤的機會。

小分子可口服的TNF-α抑制劑藥物，是抗炎癥性疾病的藥物發(fā)展的一個重要方向。但到目前為止這方面的研究并不多，還沒有一個藥物進入臨床前試驗階段，因此小分子的炎癥因子抑制劑的研究有很好的前景和經(jīng)濟價值。

甲基硫赭曲霉素(monomethylsulochrin，MMS)的分子式為C18H18O7，分子量為346.33，化學通式為methyl-5-hydroxy-2-(2-hydroxy-6-methoxy-4-methylbenzoyl)-3-methoxybenzoate,結(jié)構(gòu)式如下所示：

甲基硫赭曲霉素是1965年由Turner WB等人(Turner WB,The production of trypacidin and monomethylsulochrin by Aspergillus fumigatus.J Chem Soc Perkin 1,1965,6658-6659.)首次從煙曲霉的發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物中分離得到，之后該化合物陸續(xù)從其他屬真菌如青霉菌、鐮刀菌中分離得到，并有報道該化合物對人類肝細胞株HepG2的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)為63.5±0.6μM，對幽門螺旋桿菌的最小抑制濃度(MIC)為28.9±0.6μM(Ma YM,等，2004)，但未見有抑制炎癥因子活性的報道。

本申請人在中國專利201110458140.X中公開了曲霉菌CM9a Aspergillus sp.CM9a，該菌株已于2011年1月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國.武漢.武漢大學，郵編：430072，保藏中心保藏編號為：CCTCC NO：M2011006。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供甲基硫赭曲霉素的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供甲基硫赭曲霉素在制備抑制炎癥因子藥物中的應用。

所述甲基硫赭曲霉素的制備方法如下：

1)曲霉菌CM9a Aspergillus sp.CM9a的種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，得曲霉菌CM9a Aspergillus sp.CM9a的發(fā)酵培養(yǎng)物；

2)曲霉菌CM9a Aspergillus sp.CM9a的發(fā)酵培養(yǎng)物的處理，具體方法如下：

發(fā)酵平板于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，培養(yǎng)物切成小塊，用乙酸乙酯、甲醇和冰醋酸混合溶劑過夜浸提3～4次，過濾，濾液減壓濃縮至干得提取物浸膏，浸膏用乙酸乙酯和水溶解，靜置分層，收集乙酸乙酯相；反復以上操作至水相無色，乙酸乙酯相減壓濃縮至干，得到的乙酸乙酯相浸膏用甲醇和石油醚溶解萃取，反復萃取3～4次后，合并甲醇相，將甲醇相減壓濃縮至干得發(fā)酵提取物；

3)甲基硫赭曲霉素的分離純化，具體方法如下：

將步驟2)得到的發(fā)酵提取物用甲醇溶解后，經(jīng)中壓液相反相硅膠柱層析后用甲醇-水系統(tǒng)洗脫，收集，含有甲基硫赭曲霉素的組分位于50％甲醇-水系統(tǒng)中，將含有甲基硫赭曲霉素的組分洗脫液減壓濃縮至干后，再采用氯仿-甲醇系統(tǒng)進行硅膠柱層析，從洗脫劑組成為10︰1的組分中獲得甲基硫赭曲霉素的單體。

在步驟1)中，所述曲霉菌CM9a Aspergillus sp.CM9a的種子培養(yǎng)采用葡萄糖-土豆-瓊脂培養(yǎng)基，配方為：葡萄糖20g，瓊脂15g，土豆200g，土豆切碎，煮沸30min，4層紗布過濾，保留濾液，自來水定容至1L，121℃高壓滅菌15min；培養(yǎng)基冷卻前倒平板，每個平板約20mL培養(yǎng)基，先制作種子平板，以劃線的方式接種，28℃培養(yǎng)5天；所述發(fā)酵培養(yǎng)是將種子平板用無菌小刀劃成3mm×3mm的小塊，每個直徑10mm的發(fā)酵平板上放置3小塊，置于28℃的培養(yǎng)箱中發(fā)酵。

在步驟2)中，所述培養(yǎng)可培養(yǎng)14天；所述小塊的邊長可為0.5cm；所述乙酸乙酯、甲醇和冰醋酸混合溶劑的體積比可為乙酸乙酯︰甲醇︰冰醋酸＝80︰15︰5；所述濾液減壓濃縮可采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀42℃減壓濃縮；所述浸膏用乙酸乙酯和水溶解的乙酸乙酯和水的體積比可為1︰1；所述乙酸乙酯相減壓濃縮至干可將乙酸乙酯相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀42℃減壓濃縮至干；所述乙酸乙酯相浸膏用甲醇和石油醚溶解萃取的甲醇和石油醚的體積比可為1︰1。

在步驟3)中，所述中壓液相反相硅膠柱可采用瑞士Buchi公司的反相硅膠(RP-18)柱；所述用甲醇-水系統(tǒng)洗脫可分別用30％、50％、70％、100％甲醇-水系統(tǒng)洗脫；所述收集可等體積分部收集；所述氯仿-甲醇系統(tǒng)可采用氯仿與甲醇體積比分別為100︰1，80︰1，50︰1，20︰1，10︰1，5︰1，1︰1的氯仿-甲醇系統(tǒng)；所述硅膠柱層析可采用80～120目的硅膠柱層析；從洗脫劑組成為10︰1的組分中獲得甲基硫赭曲霉素的單體，產(chǎn)量約為100mg/10L發(fā)酵培養(yǎng)基。

本發(fā)明所述甲基硫赭曲霉素的理化參數(shù)如下：

甲基硫赭曲霉素單體為白色粉末狀固體，微溶于甲醇、丙酮等有機溶劑，易溶于氯仿。以氯仿︰甲醇(10︰1，V:V)展開系統(tǒng)進行硅膠G₂₅₄(青島海洋化工廠)薄層層析檢測時的相對保留值(Rf值)約為0.8，在碘缸和波長為365nm及254nm紫外燈下均能顯色，硫酸-乙醇顯色劑作用后再加熱顯紫紅色。

所述甲基硫赭曲霉素可在制備抑制炎癥因子藥物中應用。

附圖說明

圖1為甲基硫赭曲霉素抑制TNF-α對L929細胞的作用。在圖1中，橫坐標為樣品濃度，單位：μg/mL。

圖2為甲基硫赭曲霉素抑制巨噬細胞產(chǎn)生致炎因子TNF-α。

圖3為甲基硫赭曲霉素抑制巨噬細胞產(chǎn)生致炎因子IL-6。

圖4為甲基硫赭曲霉素抑制巨噬細胞致炎因子TNF-αmRNA的表達。

圖5為甲基硫赭曲霉素抑制巨噬細胞致炎因子IL-6mRNA的表達。

圖6為甲基硫赭曲霉素劑量依賴性的提高炎癥小鼠的存活率。

具體實施方式

以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。

本發(fā)明所述甲基硫赭曲霉素的制備方法實施例，包括以下步驟：

1)曲霉菌CM9a Aspergillus sp.CM9a的種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，得曲霉菌CM9a Aspergillus sp.CM9a的發(fā)酵培養(yǎng)物；所述曲霉菌CM9a Aspergillus sp.CM9a的種子培養(yǎng)采用葡萄糖-土豆-瓊脂培養(yǎng)基，配方為：葡萄糖20g，瓊脂15g，土豆200g，土豆切碎，煮沸30min，4層紗布過濾，保留濾液，自來水定容至1L，121℃高壓滅菌15min；培養(yǎng)基冷卻前倒平板，每個平板約20mL培養(yǎng)基，先制作種子平板，以劃線的方式接種，28℃培養(yǎng)5天；所述發(fā)酵培養(yǎng)是將種子平板用無菌小刀劃成3mm×3mm的小塊，每個直徑10mm的發(fā)酵平板上放置3小塊，置于28℃的培養(yǎng)箱中發(fā)酵。

2)曲霉菌CM9a Aspergillus sp.CM9a的發(fā)酵培養(yǎng)物的處理，具體方法如下：發(fā)酵平板于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)14天后，培養(yǎng)物切成邊長為0.5cm的小塊，用乙酸乙酯、甲醇和冰醋酸混合溶劑過夜浸提3～4次，過濾，濾液減壓濃縮至干得提取物浸膏，浸膏用乙酸乙酯和水溶解，靜置分層，收集乙酸乙酯相；反復以上操作至水相無色，乙酸乙酯相減壓濃縮至干，得到的乙酸乙酯相浸膏用甲醇和石油醚溶解萃取，反復萃取3～4次后，合并甲醇相，將甲醇相減壓濃縮至干得發(fā)酵提取物；所述乙酸乙酯、甲醇和冰醋酸混合溶劑的體積比可為乙酸乙酯︰甲醇︰冰醋酸＝80︰15︰5；所述濾液減壓濃縮可采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀42℃減壓濃縮；所述浸膏用乙酸乙酯和水溶解的乙酸乙酯和水的體積比可為1︰1；所述乙酸乙酯相減壓濃縮至干可將乙酸乙酯相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀42℃減壓濃縮至干；所述乙酸乙酯相浸膏用甲醇和石油醚溶解萃取的甲醇和石油醚的體積比可為1︰1。

3)甲基硫赭曲霉素的分離純化，具體方法如下：將步驟2)得到的發(fā)酵提取物用甲醇溶解后，經(jīng)中壓液相反相硅膠柱層析后用甲醇-水系統(tǒng)洗脫，收集，含有甲基硫赭曲霉素的組分位于50％甲醇-水系統(tǒng)中，將含有甲基硫赭曲霉素的組分洗脫液減壓濃縮至干后，再采用氯仿-甲醇系統(tǒng)進行硅膠柱層析，從洗脫劑組成為10︰1的組分中獲得甲基硫赭曲霉素的單體。所述中壓液相反相硅膠柱可采用瑞士Buchi公司的反相硅膠(RP-18)柱；所述用甲醇-水系統(tǒng)洗脫可分別用30％、50％、70％、100％甲醇-水系統(tǒng)洗脫；所述收集可等體積分部收集；所述氯仿-甲醇系統(tǒng)可采用氯仿與甲醇體積比分別為100︰1，80︰1，50︰1，20︰1，10︰1，5︰1，1︰1的氯仿-甲醇系統(tǒng)；所述硅膠柱層析可采用80～120目的硅膠柱層析；從洗脫劑組成為10︰1的組分中獲得甲基硫赭曲霉素的單體，產(chǎn)量約為100mg/10L發(fā)酵培養(yǎng)基。

本發(fā)明所述甲基硫赭曲霉素的核磁共振(NMR)圖譜數(shù)據(jù)(以氘代氯仿為溶劑)如下：

核磁共振氫譜(¹H-NMR,單位：ppm)：6.91(d,2.16,1H),6.55(d,2.16,1H),3.58(s,3H),3.67(s,3H),6.37(s,1H),6.00(s,1H),2.06(s,3H),3.38(s,3H)(s:單峰，d:雙峰)；核磁共振碳譜(¹³C-NMR,單位：ppm)：128.1s,129.8s,158.5s,104.1s,159.7s,108.7d,168.1s,52.6q,56.5q,111.8s,165.3s,111.4d,149.6s,104.1d,162.6s,22.4q,201.6s,56.3q(s：季碳，d：叔碳，t：仲碳，q：伯碳)。

本發(fā)明所述甲基硫赭曲霉素在細胞水平上抑制炎癥因子TNF-α對細胞的致死作用如下：

用CCK-8法檢測抑制致死的作用。操作方法為：對數(shù)生長期的小鼠層纖維L929細胞長滿培養(yǎng)皿底部約95％時用胰酶消化。用含10％胎牛血清(FBS)的新鮮DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)分散成10⁶個/mL的密度，每孔100μL細胞懸液加到平底的96孔板，37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第二天吸掉培養(yǎng)基，全部更換為新鮮無血清DMEM培養(yǎng)基：空白對照組不含細胞，只有100μL DMEM培養(yǎng)基，陰性對照組加入98μL DMEM和2μL DMSO，TNF-α組加入98μL DMEM和2μL TNF-α(TNF-α的終濃度為2ng/mL)，樣品組加入96μL DMEM、2μL TNF-α和2μL已經(jīng)梯度稀釋的甲基硫赭曲霉素溶液(溶于DMSO中)，每個濃度均設(shè)三個重復，在37℃含5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。之后吸掉全部培養(yǎng)基，再次更換為90μL新鮮的無血清DMEM培養(yǎng)基。每孔加10μL CCK-8溶液(日本同仁化學公司)，37℃避光反應2h，酶標儀450nm比色測定吸收值(OD值)，取平均值后按公式“存活率(survival,％)＝(OD_樣品-OD_空白)/(OD_陰性-OD_空白)×100％”計算細胞的存活率。

圖1給出甲基硫赭曲霉素抑制TNF-α對L929細胞的作用。

本發(fā)明所述甲基硫赭曲霉素抑制巨噬細胞致炎因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生：

采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法檢測甲基硫赭曲霉素抑制脂多糖(LPS)刺激下的巨噬細胞Raw 264.7中致炎因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生。具體操作按照ELISA試劑盒的操作說明：將待檢測因子的一抗包被在酶標板上，加入經(jīng)1ng/mL LPS和不同濃度MMS處理2h后的巨噬細胞Raw 264.7培養(yǎng)液作為一抗(陰性對照組為不經(jīng)LPS和MMS處理的巨噬細胞的上清液，空白對照組加相應體積的PBS)，搖床輕微振搖2h，吸去上清液，加入二抗，搖床再輕微振搖2h，吸去二抗，加入辣根過氧化物酶(HRP)并輔以生色底物，在450nm處測定吸光值OD。抑制率＝(OD_陰性-OD_空白/OD_樣品-OD_空白)×100％。結(jié)果如圖2和3所示，甲基硫赭曲霉素可抑制LPS刺激下的致炎因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)分別是100μg/mL和50μg/mL。

本發(fā)明所述甲基硫赭曲霉素抑制巨噬細胞中致炎因子TNF-α和IL-6在mRNA水平的表達如下：

采用實時定量PCR的方法，具體操作按照質(zhì)粒抽提試劑盒(Takara kit):采用TRIzol法提取總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以TNF-α-sence(意義鏈)5'-GACCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3'、TNF-α-antisence(反意義鏈)5'-CCTCCACTTGGTGGTTTGCT-3'，IL-6-sence 5'-CTTCTTGGGACTGATGCTGGTG-3'、IL-6-antisence 5'-CGCTGGCTTTGTCTTTCTTGTTA-3'作為引物進行實時定量PCR檢測。結(jié)果如圖4和5所示，甲基硫赭曲霉素可以顯著抑制巨噬細胞Raw264.7在LPS誘導下的TNF-α和IL-6基因mRNA水平的表達。

本發(fā)明所述甲基硫赭曲霉素提高LPS刺激的炎癥小鼠的存活率：

SPF級BALB/c小鼠，體重20g±1g，隨機等分為5組，分別是溶劑PBS對照組、LPS組和3個樣品組，即LPS+MMS(17mg/kg)組、LPS+MMS(10mg/kg)組、LPS+MMS(33mg/kg)組。樣品組的處理方式為尾靜脈注射0.2mL相應劑量的MMS，半h后注射0.2mL 1.0mg/mL LPS，溶劑組和LPS組不注射MMS，僅尾靜脈分別注射0.2mL PBS和0.2mL 1.0mg/mL LPS。之后每12h觀察記錄一次小鼠存活情況，連續(xù)觀察72h，結(jié)果如圖6所示。甲基硫赭曲霉素能劑量依賴地提高小鼠的存活率，對抗LPS對小鼠的致死作用(LPS作用于哺乳動物體內(nèi)的巨噬細胞，使之產(chǎn)生IL-1、IL-6和TNF-α等細胞因子)。