本發(fā)明涉及蛋白純化填料領(lǐng)域，具體涉及到一種抗體結(jié)合蛋白，尤其涉及到一種用于蛋白純化的抗體結(jié)合蛋白及其制備方法。

背景技術(shù)：

抗體是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子，由多個氨基酸組成?？贵w藥物中使用的IgG(免疫球蛋白G)在細(xì)胞培養(yǎng)、分離純化過程中易發(fā)生不均一性的變化，這些不均一性使得抗體的藥效、安全性方面受到影響。在現(xiàn)有體系中，表達(dá)抗體片段并且待純化樣品往往雜質(zhì)較多，給純化工作帶來了挑戰(zhàn)。

高效純化蛋白的抗體結(jié)合蛋白Protein L是首次從厭氧性細(xì)菌大消化鏈球菌的細(xì)胞壁中分離出來，是一種能和廣泛的免疫球蛋白特異性相結(jié)合的蛋白質(zhì)，不僅可以結(jié)合所有的Ig類(IgG，IgM，IgA，IgE和IgD)，也可以結(jié)合單鏈抗體和Fab片段，Protein L可在不干擾抗原結(jié)合位點(diǎn)的情況下，與抗體的K鏈結(jié)合。Protein L能廣泛的結(jié)合各種來源及亞類的抗體，包括人、小鼠、大鼠來源的免疫球蛋白。目前，市場上銷售的Protein L有：金斯瑞的Protein L Resin，Biovision的Recombinant Protein L等，但是這些試劑的Protein L親和力不高、純化時間較長，且成本較高。

有鑒于上述的缺陷，本設(shè)計(jì)人，積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)設(shè)一種抗體結(jié)合蛋白Protein L及其制備方法，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種抗體結(jié)合蛋白Protein L及其制備方法，該蛋白具有更強(qiáng)的親和力和更廣的Ig、Ig 亞型結(jié)合范圍。

本發(fā)明的一種抗體結(jié)合蛋白Protein L，包括重復(fù)結(jié)構(gòu)域。

進(jìn)一步的，所述重復(fù)結(jié)構(gòu)域?yàn)锽2結(jié)構(gòu)域。

進(jìn)一步的，所述抗體結(jié)合蛋白Protein L中包括重復(fù)8次的B2結(jié)構(gòu)域，并具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，編碼SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述B2結(jié)構(gòu)域具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，編碼SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

本發(fā)明的一種抗體結(jié)合蛋白Protein L的制備方法，包括利用同尾酶技術(shù)重復(fù)拷貝結(jié)構(gòu)域的步驟。

進(jìn)一步的，利用同尾酶技術(shù)重復(fù)拷貝結(jié)構(gòu)域包括以下步驟：

(1)根據(jù)Protein L*8的基因序列，設(shè)計(jì)引物Pr-1和Pr-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并在引物兩端設(shè)有同尾酶的限制性酶切位點(diǎn)，純化PCR產(chǎn)物，然后利用DNA連接酶連接；引物序列如下：

Pr-1：5'-AAAAGCTTGAAGGAGATATACATATG-3'；

Pr-2：5'-TGCTCGAGACAGCAACAACTGCCGCCACCACC-3'；

(2)依據(jù)步驟(1)重復(fù)3次上述PCR擴(kuò)增，得到重復(fù)8次B2結(jié)構(gòu)域的基因片段，所述基因片段經(jīng)轉(zhuǎn)化、測序得到表達(dá)質(zhì)粒。

進(jìn)一步的，將步驟(2)中得到的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)載體中培養(yǎng)并獲得表達(dá)菌株。

進(jìn)一步的，將得到的表達(dá)菌株經(jīng)過培養(yǎng)、純化，得到所述抗體結(jié)合蛋白Protein L。

進(jìn)一步的，步驟(1)中，所述DNA連接酶為T4DNA連接酶。

進(jìn)一步的，步驟(1)中，所述同尾酶為BamHⅠ和BgⅢ、XbaⅠ和SpeⅠ、SphⅠ和NspⅠ中的一種。

進(jìn)一步的，所述表達(dá)載體為pET系列和pGEX系列中的一種。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明公開了一種用于高效純化蛋白的抗體結(jié)合蛋白Protein L，研究發(fā)現(xiàn)Protein L含有B1-B5五個高度同源性重復(fù)結(jié)構(gòu)域，重復(fù)結(jié)構(gòu)域在免疫球結(jié)合蛋白中普遍存在，抗體結(jié)合蛋白Protein L的結(jié)合活性與B重復(fù)結(jié)構(gòu)域有著密切的關(guān)系；研究表明含有超過一個B重復(fù)結(jié)構(gòu)域的抗體結(jié)合蛋白，擁有更高的親和力，其中B1-B4結(jié)構(gòu)域的親和力可與完整抗體結(jié)合蛋白Protein L相媲美，B5結(jié)構(gòu)域不增加Protein L對Kappa輕鏈的親和力；本發(fā)明的抗體結(jié)合蛋白Protein L選取蛋白結(jié)構(gòu)中的B2結(jié)構(gòu)域，利用同尾酶技術(shù)經(jīng)過8次重復(fù)拷貝，獲得了一種對抗體親和力更強(qiáng)的抗體結(jié)合蛋白；它可有效應(yīng)用于檢測、純化和量化抗體和抗體/抗原復(fù)合物，對人、小鼠、大鼠、豬來源的免疫球蛋白有更強(qiáng)的親和力，具有更廣的Ig和Ig亞型結(jié)合范圍。

本發(fā)明提供了該抗體結(jié)合蛋白的制備方法，利用同尾酶技術(shù)對抗體結(jié)合蛋白Protein L的B2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行8次重復(fù)拷貝，獲得的抗體結(jié)合蛋白Protein L可高效特異的捕獲大范圍的抗體和抗體片段，減少非特異性結(jié)合，且提高了抗體片段的純度；利用抗體結(jié)合蛋白Protein L的高動態(tài)結(jié)合能力縮短了純化時間，并降低了成本；本發(fā)明的抗體結(jié)合蛋白Protein LpH耐受范圍廣，應(yīng)用簡便，質(zhì)量穩(wěn)定可靠；本發(fā)明的抗體結(jié)合蛋白Protein L，具有高親和力，能夠特異性結(jié)合抗體和抗體片段。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的實(shí)施例1中表達(dá)菌株SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖；

圖2是是本發(fā)明的實(shí)施例1中得到的抗體結(jié)合蛋白Protein L的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖；

圖3是本發(fā)明的實(shí)施例2中表達(dá)菌株SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖；

圖4是是本發(fā)明的實(shí)施例2中得到的抗體結(jié)合蛋白Protein L的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

(1)抗體結(jié)合蛋白Protein L表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

(1.1)根據(jù)已知的目的基因序列，利用設(shè)計(jì)合成的引物Pr-1和Pr-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并在引物的兩端設(shè)有同尾酶BamHⅠ和BgⅢ限制性酶切位點(diǎn)，純化PCR產(chǎn)物，PCR反應(yīng)條件為：步驟一，94℃，5分鐘；步驟二，94℃，20秒，55℃，20秒，72℃，30秒，30個循環(huán)；步驟三，72℃，5分鐘；回收PCR產(chǎn)物，利用同尾酶BamHⅠ和BgⅢ酶切結(jié)構(gòu)域，利用T4連接酶連接到載體上；引物序列如下：

Pr-1：5'-AAAAGCTTGAAGGAGATATACATATG-3'；

Pr-2：5'-TGCTCGAGACAGCAACAACTGCCGCCACCACC-3'；

(1.2)依據(jù)上述步驟重復(fù)3次上述PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，得到表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有8次B2結(jié)構(gòu)域的基因片段，將8次B2結(jié)構(gòu)域的基因片段轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，提取質(zhì)粒，測序獲得正確的含有8次B2結(jié)構(gòu)域拷貝的陽性表達(dá)質(zhì)粒；

(2)抗體結(jié)合蛋白Protein L的表達(dá)

(2.1)表達(dá)菌株的篩選：將步驟(1)中獲得的陽性表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)克??；在6支裝有5ml LB培養(yǎng)基的容器中接種轉(zhuǎn)化后的單克隆菌體，在37℃的搖床中培養(yǎng) 4小時，然后加入0.5mM IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時后收集菌體；取少量的菌體，加入100μl電泳上樣緩沖液煮沸5分鐘，冷卻后12000rpm離心5min，取上清液進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，如圖1所示，從圖1中可以看出：目的蛋白表達(dá)良好，條帶清晰。

(2.2)融合蛋白的大規(guī)模表達(dá)：選取步驟(2.1)中篩選得到表達(dá)量最高的表達(dá)菌種作為大規(guī)模表達(dá)用菌種，將其接種到100ml的LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床中過夜培養(yǎng)，然后用過夜的100ml菌種接種到10L的LB培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)至OD為0.5-0.6，加入0.5mM的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時，此時菌液OD為2.2，離心收集菌體10g；

(3)抗體結(jié)合蛋白Protein L的純化

(3.1)取收集的10g表達(dá)目的蛋白的大腸桿菌，用100ml平衡Buff充分溶解，攪拌均勻后用超聲破碎儀充分裂解，然后將裂解上清12000rpm，離心20min取上清；用0.22um濾器過濾除菌、除雜質(zhì)，使樣品充分澄清；

(3.2)層析純化

(3.2.1)捕獲：Ni Sepharose 6 Fast Flow(FF)column連接AKTA Purification，；使用5CV的0.2M NaOH沖洗層析系統(tǒng)并浸泡3h，然后用至少10CV去熱源水沖洗層析系統(tǒng)至中性；使用5CV的控?zé)嵩?.2M NiSO4沖洗層析系統(tǒng)，然后用5CV去熱源水沖洗層析系統(tǒng)；使用5CV平衡Buff 1(20mM Tris,250mM NaCl,10mM Imidazole,pH8.0)沖洗層析系統(tǒng)，將預(yù)處理后的樣品以5ml/min的流速進(jìn)行上樣，再用5CV平衡Buff 1沖洗層析系統(tǒng)；使用3CV平衡Buff 1和洗脫Buff 1(20mM Tris,250mM NaCl,500mM Imidazole,pH8.0)，采用步級洗脫方式(分三步：E50、E100、E250、E500)純化目標(biāo)蛋白，取50mM、100mM和250mM純化的蛋白，合并后脫鹽后進(jìn)行SP High Performance中度純化；

(3.2.2)中度純化：SP High Performance column連接上AKTA Purification，使用5CV的0.2M NaOH沖洗層析系統(tǒng)并浸泡3h，然后用至少10CV去熱源水沖洗層析系統(tǒng)至中性；使用5CV的控?zé)嵩?.2M NiSO4沖洗層析系統(tǒng)，用5CV去熱源水沖洗層析系統(tǒng)；使用5CV平衡Buff 2(20mM PB,PH7.0)沖洗層析系統(tǒng)，然后將預(yù)處理后的樣品以5ml/min的流速進(jìn)行上樣，再用5CV平衡Buff 2沖洗層析系統(tǒng)；使用3CV平衡Buff 2和洗脫Buff 2(20mM PB,1M NaCl,pH7.0)，采用一步洗脫方式純化目標(biāo)蛋白；

(3.2.3)精細(xì)純化：Superdex 200連接上AKTA Purification，使用3CV的控?zé)嵩此浞譀_洗層析系統(tǒng)，；使用3CV平衡緩沖液沖洗層析系統(tǒng)，然后將捕獲回收的樣品以2ml/min的流速進(jìn)行上樣，再用3CV平衡緩沖液洗脫；根據(jù)純化圖譜接收樣品餾分。

(3.3)后處理

合并餾分，100倍透析至保存體系；取透析后樣品，-80℃做凍融測試，選取凍融合格的樣品，做成品質(zhì)檢、入庫，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖如圖2所示，從圖2中可以看出：目的蛋白表達(dá)清晰，且條帶大小符合。

實(shí)施例2

本實(shí)施例與實(shí)施例1步驟相同，其區(qū)別在于：步驟(2.2)中，在37℃下培養(yǎng)至OD為0.5-0.6，加入0.1mM的IPTG在16℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時，此時菌液OD為2.1，離心收集菌體10g；表達(dá)菌株的篩選時的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖如圖3所示，從圖3中可以看出：目的蛋白表達(dá)良好，條帶清晰。；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖如圖所示，從圖4中可以看出：目的蛋白表達(dá)清晰，且條帶大小符合。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視 為本發(fā)明的保護(hù)范圍。