本發(fā)明涉及一種快速鑒定煙粉虱Para鈉離子通道基因突變T929V的引物及其應(yīng)用，特別涉及煙粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)Para鈉離子通道基因突變T929V的鑒定引物及其在擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑抗性監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

煙粉虱B.tabaci是一種重要的大田及溫室害蟲(chóng)，能夠通過(guò)直接取食、分泌蜜露以及傳播植物病毒對(duì)600多種植物造成危害。由于具有快速的適應(yīng)能力，煙粉虱已對(duì)包括有機(jī)磷類(lèi)、氨基甲酸酯類(lèi)等各類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了高水平抗性，是唯一被科技界冠以“超級(jí)害蟲(chóng)”稱(chēng)號(hào)的害蟲(chóng)。

擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑是人類(lèi)利用化學(xué)手段模擬天然除蟲(chóng)菊素的化學(xué)結(jié)構(gòu)而仿生合成的一類(lèi)化合物。該類(lèi)殺蟲(chóng)劑作為一類(lèi)神經(jīng)毒劑，主要作用于昆蟲(chóng)的鈉離子通道,延長(zhǎng)鈉離子通道開(kāi)放時(shí)間，延遲鈉通道的失活過(guò)程，產(chǎn)生持久活化，導(dǎo)致重復(fù)后放和神經(jīng)傳導(dǎo)的阻斷，引起害蟲(chóng)興奮過(guò)度，最終使其肌肉癱瘓并導(dǎo)致死亡。

擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑作為一類(lèi)廣譜性殺蟲(chóng)劑，具有高效、低毒和低殘留的特性，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)和衛(wèi)生害蟲(chóng)防治中廣泛應(yīng)用。但該類(lèi)殺蟲(chóng)劑作為單劑使用時(shí)抗性風(fēng)險(xiǎn)極高，極易引發(fā)害蟲(chóng)的擊倒抗性(Knock-down resistance，kdr)。通過(guò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明鈉離子通道有選擇地改變殺蟲(chóng)劑的結(jié)合部位能夠降低鈉離子對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的親和力，引起害蟲(chóng)神經(jīng)敏感性的改變。目前已在14種昆蟲(chóng)的Para直向同源鈉離子通道中發(fā)現(xiàn)了20個(gè)突變位點(diǎn)，其中有5個(gè)突變位點(diǎn)為kdr突變位點(diǎn)，7個(gè)位點(diǎn)為超擊倒抗性(super-kdr)突變位點(diǎn)(其中包括T929V突變)。在煙粉虱中也已證實(shí)鈉離子通道蛋白在929位的蘇氨酸到纈氨酸(T929V)的突變與擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑抗性密切相關(guān)。

中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN105132568A(申請(qǐng)?zhí)?01510603063.0)公開(kāi)了一種快速鑒定煙粉虱鈉離子通道基因突變L925I的引物及其應(yīng)用?？焖勹b定鈉離子通道基因突變位點(diǎn)L925I為野生型煙粉虱的引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；快速鑒定鈉離子通道基因突變位點(diǎn)L925I為突變型煙粉虱的引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。雖然該技術(shù)方案向突變型正向引物3’端第三個(gè)堿基引入了錯(cuò)配堿基G，從而提高了引物的特異性，但該方法并不能完全適用于所有的煙粉虱鈉離子通道基因突變位點(diǎn)的特異引物的設(shè)計(jì)。

因而，設(shè)計(jì)特異性的檢測(cè)引物用于檢測(cè)鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V仍然是目前研究的熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速鑒定煙粉虱鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V的引物及其應(yīng)用。

一種快速鑒定鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V為野生型煙粉虱的引物，該引物為一對(duì)，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述引物在鑒定鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V為野生型煙粉虱中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用，步驟如下：

(1)提取待鑒定樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液；

(2)以步驟(1)制得的基因組DNA為模板，利用上述引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)對(duì)步驟(2)制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣品有93bp的一條條帶時(shí)，則被檢測(cè)樣品鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V為野生型的純合或雜合煙粉虱；當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示無(wú)93bp的條帶時(shí)，則被檢測(cè)樣品鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V為純合突變型的煙粉虱。

所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為：

基因組DNA溶液2μl，10M上游引物0.5μl，10M下游引物0.5μl，5U/μl rTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer(緩沖液)2.5μl，10mM dNTP 2μl，ddH₂0補(bǔ)至25μl；

所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下：

94℃預(yù)變性2分鐘；94℃變性15秒，54℃退火10秒，72℃延伸10秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2分鐘。

一種快速鑒定鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V為突變型煙粉虱的引物，該引物為一對(duì)，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述引物在鑒定鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V為突變型煙粉虱中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用，步驟如下：

(1)提取待鑒定樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液；

(2)以步驟(1)制得的基因組DNA為模板，利用上述引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)對(duì)步驟(2)制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣品有93bp的一條條帶時(shí)，則被檢測(cè)樣品鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V為突變型的純合或雜合煙粉虱；當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示無(wú)93bp的條帶時(shí)，則被檢測(cè)樣品鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V為純合野生型的煙粉虱。

所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為：

基因組DNA溶液2μl，10M上游引物0.5μl，10M下游引物0.5μl，5U/μl rTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer(緩沖液)2.5μl，10mM dNTP 2μl，ddH₂0補(bǔ)至25μl；

所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下：

94℃預(yù)變性2分鐘；94℃變性15秒，54℃退火10秒，72℃延伸10秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2分鐘。

上述步驟(1)中提取溫室白粉虱和煙粉虱基因組DNA和步驟(3)中瓊脂糖凝膠電泳分析均按本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)操作。上述實(shí)驗(yàn)步驟如無(wú)特別說(shuō)明均可參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(北京：科學(xué)出版社，2002)。

本發(fā)明所述T929V突變位點(diǎn)指煙粉虱Para鈉離子通道基因片段(GenBank登錄號(hào):AJ440727.1)自5’末端起第73和74位核苷酸為A和C，煙粉虱鈉離子通道基因片段(野生型)核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本發(fā)明所述煙粉虱Para鈉離子通道蛋白的T929V突變位點(diǎn)，為煙粉虱Para鈉離子通道蛋白(GenBank登錄號(hào)：CAD29437.1)自N端起第25位氨基酸為蘇氨酸，所述煙粉虱Para鈉離子通道蛋白(野生型)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

有益效果

本發(fā)明首次公開(kāi)了檢測(cè)煙粉虱對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗藥性的點(diǎn)突變的兩對(duì)檢測(cè)引物及檢測(cè)方法，采用兩對(duì)引物進(jìn)行檢測(cè)，不僅有助于提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率，并且有助于快速、靈敏地檢測(cè)田間煙粉虱對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗藥性發(fā)生發(fā)展動(dòng)態(tài)，為抗藥性的治理提供技術(shù)支持，便于及時(shí)調(diào)整煙粉虱防治策略，以延緩和控制抗藥性的進(jìn)一步發(fā)展。

附圖說(shuō)明

圖1為采用T929V突變位點(diǎn)專(zhuān)用野生型引物對(duì)和專(zhuān)用突變型引物對(duì)PCR擴(kuò)增929純合野生型和純合突變型模板的電泳圖；

圖中：WT，MT分別所示為純合野生型個(gè)體的DNA模板和純合突變型個(gè)體的DNA模板；

圖2為實(shí)施例2檢測(cè)結(jié)果電泳圖；

圖中：T929V專(zhuān)用野生型引物對(duì)WF(SEQ ID NO：1)+R(SEQ ID NO：2)用以檢測(cè)929位點(diǎn)野生型的煙粉虱；T929V專(zhuān)用突變型引物對(duì)MF(SEQ ID NO：3)+R(SEQ ID NO：2)用以檢測(cè)存在929位點(diǎn)突變的煙粉虱；

圖3為對(duì)比例的檢測(cè)結(jié)果電泳圖；

圖中：T929V專(zhuān)用突變型引物對(duì)MF(SEQ ID NO：3)+R(SEQ ID NO：2)用以檢測(cè)存在929位點(diǎn)突變的煙粉虱；T929V專(zhuān)用突變型引物對(duì)F1(SEQ ID NO：4)+R(SEQ ID NO：2)用以檢測(cè)存在929位點(diǎn)突變的煙粉虱；T929V專(zhuān)用突變型引物對(duì)F2(SEQ ID NO：5)+R(SEQ ID NO：2)用以檢測(cè)存在929位點(diǎn)突變的煙粉虱；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

對(duì)2014年采自山東省壽光、濟(jì)南、青島市三地的田間種群煙粉虱鈉離子通道929位的突變情況進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，純合野生型個(gè)體的DNA模板，標(biāo)記為WT；純合突變型個(gè)體的DNA模板，標(biāo)記為MT。

實(shí)施例中所述材料、試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1

煙粉虱鈉離子通道基因T929V野生型和突變型模板的測(cè)序驗(yàn)證

根據(jù)NCBI所公布的煙粉虱鈉離子通道基因(Genbank:DQ205209.1)設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)929位突變進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收專(zhuān)一目的片段后直接進(jìn)行PCR測(cè)序。

PCR擴(kuò)增的引物：

上游引物：GGCCAACTTTGAATCTGTT；

下游引物：AAACTTTCCGCACCTCTG。

PCR擴(kuò)增體系：基因組DNA溶液2μl，10M上游引物1μl，10M下游引物1μl，5U/μl rTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer(緩沖液)2.5μl，10mM dNTP 2μl，ddH₂0補(bǔ)至25μl；

PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘。

根據(jù)以上所述，從三個(gè)田間種群中分別隨機(jī)測(cè)序檢測(cè)15頭田間種群煙粉虱個(gè)體DNA序列。挑選出929位的野生型純合個(gè)體(WT)和突變型的純合個(gè)體(MT)。從純合野生型個(gè)體和純合突變型個(gè)體中分別隨機(jī)選取5個(gè)模板，進(jìn)行PCR法驗(yàn)證試驗(yàn)。

引物設(shè)計(jì)

引物核苷酸序列如表1所示，根據(jù)突變體煙粉虱鈉離子通道基因的序列設(shè)計(jì)allele specific-PCR引物，專(zhuān)用野生型引物對(duì)3’端最后兩個(gè)堿基與突變前的堿基一致(SEQ ID NO.1)，專(zhuān)用突變型引物對(duì)3’端最后兩個(gè)堿基與突變后的堿基一致(SEQ ID NO.3)。此外，為了增加allele specific-PCR方法的特異性，向突變型正向引物3’端第四個(gè)堿基引入了錯(cuò)配堿基G。PCR法檢測(cè)的下游引物使用共同的下游引物R(SEQ ID NO.2)。但為了不受到DNA內(nèi)含子多態(tài)性的影響，PCR法檢測(cè)的下游引物設(shè)計(jì)在了突變位點(diǎn)所在外顯子的3’末端。

表1.檢測(cè)煙粉虱鈉離子通道929位是否發(fā)生突變所使用的引物

PCR法驗(yàn)證T929V突變位點(diǎn)專(zhuān)用野生型引物對(duì)和專(zhuān)用突變型引物對(duì)

1、模板：純合野生型模板WT和純合突變型模板MT。

2、引物：如表1所示

3、PCR反應(yīng)體系：

基因組DNA溶液2μl，10M上游引物0.5μl，10M下游引物0.5μl，5U/μl rTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer(緩沖液)2.5μl，10mM dNTP 2μl，ddH₂0補(bǔ)至25μl；

所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下：

94℃預(yù)變性2分鐘；94℃變性15秒，54℃退火10秒，72℃延伸10秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2分鐘。

結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，在該反應(yīng)體系和循環(huán)條件下，T929V專(zhuān)用野生型引物只對(duì)野生型模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為93bp；T929V專(zhuān)用突變型引物只對(duì)突變型模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為93bp。

上述專(zhuān)用野生型引物和突變型引物能很好地區(qū)分等位基因，因此選用這些專(zhuān)用引物對(duì)用于T929V等位基因突變的檢測(cè)，即可以特異性地檢測(cè)煙粉虱是否對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了抗藥性。

實(shí)施例2

一種快速鑒定鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V為野生型煙粉虱的引物，該引物為一對(duì)，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一種快速鑒定鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V為突變型煙粉虱的引物，該引物為一對(duì)，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

利用上述引物鑒定煙粉虱鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V基因型的方法，步驟如下：

(1)提取待鑒定樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液；

(2)以步驟(1)制得的基因組DNA為模板，分別利用引物核苷酸序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物、核苷酸序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.2的引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為：

基因組DNA溶液2μl，10M上游引物0.5μl，10M下游引物0.5μl，5U/μl rTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer(緩沖液)2.5μl，10mM dNTP 2μl，ddH₂0補(bǔ)至25μl；

所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下：

94℃預(yù)變性2分鐘；94℃變性15秒，54℃退火10秒，72℃延伸10秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2分鐘；

(3)對(duì)步驟(2)制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

經(jīng)野生型煙粉虱的引物擴(kuò)增后，當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣品有93bp的一條條帶時(shí)，則被檢測(cè)樣品鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V為野生型的純合或雜合煙粉虱；當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示無(wú)93bp的條帶時(shí)，則被檢測(cè)樣品鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V為突變型的純合煙粉虱；

經(jīng)突變型煙粉虱的引物擴(kuò)增后，當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣品有93bp的一條條帶時(shí)，則被檢測(cè)樣品鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V為突變型的純合或雜合煙粉虱；當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示無(wú)93bp的條帶時(shí)，則被檢測(cè)樣品鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V為野生型的純合煙粉虱；

當(dāng)既有經(jīng)野生型煙粉虱的引物擴(kuò)增后的93bp的條帶又有經(jīng)突變型煙粉虱的引物擴(kuò)增后的93bp的條帶時(shí)，則被檢測(cè)樣品鈉離子通道基因突變位點(diǎn)T929V為突變型的雜合煙粉虱。

檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。該結(jié)果與測(cè)序檢測(cè)結(jié)果一致。

對(duì)比例1

引物設(shè)計(jì)

引物核苷酸序列如表2所示，根據(jù)突變體煙粉虱鈉離子通道基因的序列設(shè)計(jì)allele specific-PCR引物，專(zhuān)用突變型引物對(duì)3’端最后兩個(gè)堿基與突變后的堿基一致(SEQ ID NO.3)。此外，為了增加allele specific-PCR方法的特異性，向突變型正向引物3’端第四個(gè)堿基引入了錯(cuò)配堿基G。同樣為驗(yàn)證該引物的特異性，另外設(shè)計(jì)兩條上游引物F1(3’端第三個(gè)堿基引入了錯(cuò)配堿基C)和F2(僅3’端最后兩個(gè)堿基與突變后的堿基一致)。PCR法檢測(cè)的下游引物使用共同的下游引物R(SEQ ID NO.2)。

表2.檢測(cè)煙粉虱鈉離子通道929位是否發(fā)生突變所使用的引物

PCR法對(duì)比不同突變型引物檢測(cè)T929V突變位點(diǎn)的靈敏性

1、模板：純合野生型模板WT和純合突變型模板MT。

2、引物：如表1所示

3、PCR反應(yīng)體系：

基因組DNA溶液2μl，10M上游引物0.5μl，10M下游引物0.5μl，5U/μl rTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer(緩沖液)2.5μl，10mM dNTP 2μl，ddH₂0補(bǔ)至25μl；

所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下：

94℃預(yù)變性2分鐘；94℃變性15秒，54℃退火10秒，72℃延伸10秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2分鐘。

結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，在該反應(yīng)體系和循環(huán)條件下，F(xiàn)1+R引物對(duì)不能有效檢測(cè)突變型模板。F2+R引物對(duì)雖然能夠?qū)ν蛔冃湍０暹M(jìn)行擴(kuò)增，但同樣能夠?qū)σ吧湍０暹M(jìn)行擴(kuò)增。僅有MF+R引物對(duì)只對(duì)突變型模板進(jìn)行擴(kuò)增。