本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種鱟血漿蛋白的水解方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是人體必不可少的營(yíng)養(yǎng)素之一，但不同蛋白質(zhì)由于其氨基酸組成和空間結(jié)構(gòu)不同，在人體內(nèi)的消化吸收率也大不相同，將蛋白質(zhì)水解為多肽，可以大大提高其吸收率。水解蛋白質(zhì)的主要方法有酸水解法、堿水解法、酶水解法、微生物降解法等等?；瘜W(xué)法水解方法簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜，水解效率高，但是對(duì)肽鏈斷裂沒(méi)有特異性，水解程度不易控制，反應(yīng)條件劇烈。微生物降解法不容易控制降解過(guò)程中的降解產(chǎn)物和產(chǎn)物種類，并且微生物發(fā)酵產(chǎn)物復(fù)雜，除所需要的產(chǎn)物外，還有由微生物產(chǎn)生的各類物質(zhì)，后續(xù)的提取和后處理工序繁雜。
鱟血資源珍貴，鱟血蛋白含量高，含有人體所必須的八種必須氨基酸以及多種微量元素，存在著多種具有抗菌抗內(nèi)毒素的小分子活性多肽，是制作保健食品和藥品的理想原料。我國(guó)對(duì)鱟血的利用研究，主要是提取鱟血中的變形細(xì)胞，然后從變形細(xì)胞中分離具有抗菌抗內(nèi)毒素活性的小分子活性肽并生產(chǎn)鱟試劑，國(guó)內(nèi)外正著手以鱟血內(nèi)源性多肽為先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)新的抗菌、抗病毒、抗腫瘤藥物，但是鱟血分離變形細(xì)胞后剩余的鱟血漿由于銅含量超出人類食用標(biāo)準(zhǔn)，鱟血漿一般作為廢物被丟棄，這就造成了極大的浪費(fèi)。截止目前，對(duì)鱟血漿蛋白水解肽的直接研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
利用現(xiàn)代生物化學(xué)技術(shù)制備鱟血蛋白多肽，致力于開(kāi)發(fā)用于食品和制藥工業(yè)的新產(chǎn)品，提高蛋白質(zhì)資源的利用率，對(duì)走工業(yè)化開(kāi)發(fā)道路和保護(hù)生態(tài)環(huán)境有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鱟血漿蛋白水解方法，本發(fā)明提供的方法具有較高的水解率，水解率可以達(dá)到78.29%，同時(shí)酶解后水解肽中銅離子含量最終可降為44.10ug/mL。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種鱟血漿蛋白水解方法，所述方法包括如下步驟：
S1：將鱟血漿恒溫水浴2～4小時(shí)，然后將鱟血漿抽濾并用水洗滌多次備用；
S2：使用蛋白酶水解步驟S1所得鱟血，然后將鱟血漿水解液離心分離得上清液，冷凍干燥得鱟血漿蛋白水解肽粉；
其中，步驟S1中的水浴溫度為70～100℃，步驟S2中，水解體系的pH為7～9。
鱟血漿蛋白是銅藍(lán)蛋白，其中銅含量高達(dá)144.21ug/mL，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.13中規(guī)定水產(chǎn)類食品含銅量要小于等于50mg/kg，所以鱟血漿是不能直接食用的，只有經(jīng)過(guò)降銅后鱟血漿才能被人食用。另外，鱟血漿蛋白經(jīng)過(guò)熱處理后會(huì)變性，易于被蛋白酶水解成肽；本發(fā)明選用酶解法水解鱟血漿蛋白，該方法反應(yīng)條件比較溫和，可控制水解度。本發(fā)明步驟S1中通過(guò)將鱟血漿恒溫水浴2～4小時(shí)，顯著降低了鱟血漿蛋白水解肽中銅離子的含量，將鱟血漿中的銅離子含量從144.21ug/mL降低到44.10ug/mL，銅離子含量能夠達(dá)到食用標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明提供的方法能夠保存氨基酸的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，要求實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單，操作安全，無(wú)溶劑污染，投資少，具有較大的推廣使用價(jià)值。
優(yōu)選地，所述蛋白酶為胰蛋白酶、胰酶或木瓜蛋白酶中的一種或幾種；更為優(yōu)選地，所述蛋白酶為胰蛋白酶。
優(yōu)選地，步驟S1中的水浴溫度為90℃；步驟S2中，水解體系的pH為8.0。
優(yōu)選地，步驟S2中，所述蛋白酶的濃度為2～4%，底物濃度為3～5%；更為優(yōu)選地，所述蛋白酶的濃度為3%，底物濃度為4%。
優(yōu)選地，步驟S2中，水解時(shí)間為2～4h，水解溫度為40～60℃；更為優(yōu)選地，所述水解時(shí)間為3h，水解溫度為50℃。
本發(fā)明提供的水解方法的最佳水解條件為：選擇胰蛋白酶水解鱟血漿蛋白，酶濃度3%、底物濃度4%、pH為8.0、水解時(shí)間為3h、水解溫度為50℃，此時(shí)鱟血漿蛋白的水解率是78.29%。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
本發(fā)明提供了一種酶法水解鱟血漿蛋白的方法，該方法利用蛋白酶在最適溫度和pH條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)比較溫和，可控制水解度，并且保存氨基酸的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，要求實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單，操作安全，無(wú)溶劑污染，投資少。
本實(shí)驗(yàn)采用酶水解蛋白法，選用胰蛋白酶水解鱟血漿蛋白，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定出最佳酶解條件為酶濃度3%，底物濃度4%，pH值為8.0，水解時(shí)間3h，水解溫度50℃，在此條件下，鱟血漿蛋白的水解率可以達(dá)到78.29%，同時(shí)酶解后水解肽中銅離子含量最終可以從144.21ug/mL降低到44.10ug/mL，銅離子含量達(dá)到食用標(biāo)準(zhǔn)，此酶水解鱟血漿蛋白法具有高鱟血蛋白的水解肽得率。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說(shuō)明，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明作任何限定。除非特別說(shuō)明，所有本發(fā)明提供的實(shí)施例中，提供的原材料均可從市面采購(gòu)獲得。
實(shí)施例1
一種鱟血漿蛋白水解方法，所述方法包括如下步驟：
S1：將鱟血恒溫90℃水浴3小時(shí)，然后將鱟血抽濾并用蒸餾水洗滌多次備用；
S2：使用胰蛋白酶水解步驟S1所得鱟血，然后將鱟血水解液離心分離得上清液，冷凍干燥得鱟血漿蛋白水解肽粉。
本實(shí)施例的最佳酶解條件：酶濃度3%、底物濃度4%、pH 8.0、水解時(shí)間3h以及水解溫度50℃，此時(shí)的水解率是78.29%，水解肽中銅離子含量為44.10ug/mL。
實(shí)施例2
一種鱟血漿蛋白水解方法，所述方法包括如下步驟：
S1：將鱟血恒溫70℃水浴4小時(shí)，然后將鱟血抽濾并用蒸餾水洗滌多次備用；
S2：使用胰蛋白酶水解步驟S1所得鱟血，然后將鱟血水解液離心分離得上清液，冷凍干燥得鱟血漿蛋白水解肽粉。
本實(shí)施例的酶解條件：酶濃度3%、底物濃度5%、pH 8.0、水解時(shí)間2h以及水解溫度50℃，此時(shí)的水解率是66.09%，水解肽中銅離子含量為47.60ug/mL。
實(shí)施例3
一種鱟血漿蛋白水解方法，所述方法包括如下步驟：
S1：將鱟血恒溫90℃水浴3小時(shí)，然后將鱟血抽濾并用蒸餾水洗滌多次備用；
S2：使用胰酶水解步驟S1所得鱟血，然后將鱟血水解液離心分離得上清液，冷凍干燥得鱟血漿蛋白水解肽粉。
本實(shí)施例的最佳酶解條件：酶濃度3%、底物濃度5%、pH為8.0、水解時(shí)間2h以及水解溫度50℃，此時(shí)的水解率是57.10%，水解肽中銅離子含量為44.10ug/mL。
對(duì)照例1
一種鱟血漿蛋白水解方法，所述方法包括如下步驟：
S1：將鱟血恒溫110℃水浴3小時(shí)，然后將鱟血抽濾并用蒸餾水洗滌多次備用；
S2：使用胰蛋白酶水解步驟S1所得鱟血，然后將鱟血水解液離心分離得上清液，冷凍干燥得鱟血漿蛋白水解肽粉。
本實(shí)施例的酶解條件：酶濃度9%、底物濃度3%、pH 7.5、水解時(shí)間3h以及水解溫度50℃，此時(shí)的水解率是53.36%，水解肽中銅離子含量為59.36ug/mL。
對(duì)照例2
一種鱟血漿蛋白水解方法，所述方法包括如下步驟：
S1：將鱟血恒溫60℃水浴2小時(shí)，然后將鱟血抽濾并用蒸餾水洗滌多次備用；
S2：使用胰酶和木瓜蛋白酶按照1:1的比例水解步驟S1所得鱟血，然后將鱟血水解液離心分離得上清液，冷凍干燥得鱟血漿蛋白水解肽粉。
本實(shí)施例的酶解條件：酶濃度1%、底物濃度5%、pH 8.0、水解時(shí)間2h以及水解溫度50℃，此時(shí)的水解率是28.31%，水解肽中銅離子含量為69.11ug/mL。
試驗(yàn)例1 鱟血漿蛋白的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)
將實(shí)施例1的水解方法水解得到的鱟血漿蛋白水解肽粉溶解，然后過(guò)SephadexG-50葡聚糖凝膠柱，收集在波長(zhǎng)230nm處吸光度最大的組分即得鱟血漿蛋白水解肽，冷凍干燥得具有抗氧化活性的水解肽產(chǎn)品。
對(duì)上述水解肽產(chǎn)品進(jìn)行DPPH自由基清除能力測(cè)試和總抗氧化能力測(cè)試，測(cè)試方法如下：
（1）DPPH自由基清除能力的測(cè)定
DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，其乙醇溶液呈紫色，在波長(zhǎng)517nm處有強(qiáng)烈吸收；在有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的孤對(duì)電子被配對(duì)，從而使其褪色，褪色程度與其接受電子呈定量關(guān)系，因而可用比色法進(jìn)行定量分析抗氧化劑對(duì)DPPH自由基清除作用大小。清除50% DPPH自由基時(shí)樣品濃度稱為抗氧化劑的IC50值，IC50值越小抗氧化性越好。DPPH自由基清除能力的測(cè)定的步驟具體如下：
分別準(zhǔn)確量取2.0 mL水解肽溶液，加入10 mL比色管中，各加入濃度為0.2μmol/L DPPH溶液2.0 mL，室溫下暗處反應(yīng)30min后，在517nm處測(cè)定其吸光度，根據(jù)公式[(A對(duì)照-A樣品)/A對(duì)照]×100%計(jì)算清除率，其中A對(duì)照為未加樣品的DPPH自由基吸光度，即DPPH自由基溶液＋溶劑；A樣品為加入樣品反應(yīng)平衡后的吸光度，即DPPH自由基溶液+樣品溶液。
（2）總抗氧化能力測(cè)定
FRAP法測(cè)定總抗氧化能力的原理是酸性條件下抗氧化物可以還原Fe3+-TPTZ產(chǎn)生藍(lán)紫色的Fe2+-TPTZ，隨后在593nm測(cè)定吸光度，即可作為樣品中的總抗氧化能力的指標(biāo)?？偪寡趸芰τ肍RAP值即Fe2+當(dāng)量數(shù)表示，F(xiàn)RAP值越大,抗氧化活性越強(qiáng)。
采用FRAP法，用移液槍取5個(gè)梯度的水解肽溶液0.1 mL于24孔板中，梯度濃度分別為1mg/ mL、0.5mg/ mL、0.25mg/ mL、0.125mg/ mL、0.0625mg/ mL，加入0.9 mL預(yù)熱至37℃的三價(jià)鐵還原抗氧化能力工作液（FRAP工作液），充分混勻后防放置10min，在波長(zhǎng)593nm處測(cè)量吸光度。以無(wú)水乙醇代替樣品加入FRAP工作液作為空白對(duì)照。根據(jù)反應(yīng)后測(cè)定的吸光度計(jì)算相應(yīng)的FeSO4濃度（μmol/L），定義為FRAP值。
經(jīng)測(cè)試，本發(fā)明實(shí)施例1提供的水解方法得到的水解肽最后制備得到的產(chǎn)品具有較好的抗氧化能力，其DPPH自由基清除IC50值為6.2ug/mL，總抗氧化能力（FRAP值）為81.5 umol/L；本發(fā)明提供的方法實(shí)現(xiàn)了鱟血漿的充分利用，避免了浪費(fèi)，水解得到的鱟血漿水解肽可作為自由基清除劑而得到廣泛的應(yīng)用。