本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種制備破傷風(fēng)類毒素的方法。

背景技術(shù)：

破傷風(fēng)是破傷風(fēng)桿菌經(jīng)由皮膚或黏膜傷口侵入人體，在缺氧環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒素而引起陣發(fā)性肌痙攣的一種特異性感染。典型癥狀是在肌緊張性收縮(肌強(qiáng)直、發(fā)硬)的基礎(chǔ)上，陣發(fā)性強(qiáng)烈痙攣，通常最先受影響的肌群是咀嚼肌，隨后順序?yàn)槊娌勘砬榧?、頸、背、腹、四肢肌，最后為膈肌。

破傷風(fēng)毒素是破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)生的一種神經(jīng)蛋白質(zhì)毒素，通過抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，引起超反射反應(yīng)和橫紋肌痙攣。1926年，Roman等人首次將甲醛處理的破傷風(fēng)毒素成功用于人免疫預(yù)防破傷風(fēng)，自此開創(chuàng)了破傷風(fēng)類毒素免疫的新紀(jì)元，隨著其單苗或聯(lián)苗在世界范圍內(nèi)的接種，有效預(yù)防控制了破傷風(fēng)的爆發(fā)流行。WHO網(wǎng)站公布的數(shù)據(jù)顯示，2014年破傷風(fēng)類毒素單價(jià)疫苗或聯(lián)合疫苗在全球的免疫覆蓋率達(dá)到86％。破傷風(fēng)類毒素除作為單價(jià)疫苗或吸附百白破聯(lián)合疫苗用于嬰幼兒及適宜人群的預(yù)防接種外，還作為載體蛋白制備多糖結(jié)合疫苗如b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗、腦膜炎球菌結(jié)合疫苗和肺炎球菌結(jié)合疫苗。

破傷風(fēng)類毒素是百白破多聯(lián)疫苗的重要成分，單體含量高不易造成接種副反應(yīng)，更多的殘余氨基說明抗原完整性好，免疫保護(hù)性更好。單體含量高、殘留氨基高的破傷風(fēng)類毒素成分更有利于開發(fā)出更安全有效的多聯(lián)疫苗。

破傷風(fēng)類毒素生產(chǎn)工藝有兩類：一種為原制毒素先脫毒后精制工藝，另一種為原制毒素先精制后脫毒工藝。先脫毒后精制工藝制備的破傷風(fēng)類毒素穩(wěn)定性一般較好，但是原制毒素中含有的培養(yǎng)基殘留物，在脫毒過程中可能與甲醛及毒素分子交聯(lián)，在后續(xù)的精制提純中去除困難，增加出現(xiàn)過敏反應(yīng)的幾率，且脫毒體積大，成本偏高。先精制后脫毒工藝則有效去除了培養(yǎng)基中的致敏物質(zhì)，且脫毒體積小、便于操作，工藝批間差異易控制。

并且，通常生產(chǎn)的破傷風(fēng)類毒素單體含量和殘余氨基的含量均較低，單體含量平均約為70％，殘余氨基平均僅20mol-NH/molTT。

因此生產(chǎn)工藝進(jìn)行持續(xù)改進(jìn)可獲得更高質(zhì)量的制品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種破傷風(fēng)類毒素的制備方法以及該方法制備得到的破傷風(fēng)類毒素。

本發(fā)明破傷風(fēng)類毒素的制備方法，它包括如下步驟：

(1)取破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌培養(yǎng)液，殺菌，離心，澄清過濾，得上清；

(2)取上清液，超濾，分次加入硫酸銨至硫酸銨的終濃度為22～26(w/v)，離心，收集沉淀，將沉淀溶解后超濾，即為精制毒素；

(3)將精制毒素用注射用水稀釋后，加入甲醛溶液，脫毒，即可。

步驟(1)中，所述破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌培養(yǎng)方式為靜止培養(yǎng)，不通氣、不攪拌，培養(yǎng)液的破傷風(fēng)毒素絮狀單位不低于80Lf/ml時(shí)收獲毒素。

優(yōu)選地，本發(fā)明破傷風(fēng)類毒素的制備方法為大工業(yè)生產(chǎn)中的制備方法。

步驟(1)中，采用連續(xù)流離心去除菌體，離心的轉(zhuǎn)速為13000～15000轉(zhuǎn)/分鐘，優(yōu)選離心的轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘。

步驟(1)中，離心采用連續(xù)流離心機(jī)離心；和/或，澄清過濾采用復(fù)合濾芯進(jìn)行澄清過濾。

步驟(2)中，超濾至原體積的1/15～1/10；超濾的進(jìn)液壓力為0.15～0.4MPa，回流壓力為0.05～0.2MPa；和/或，超濾采用膜孔徑為30～50kD超濾膜。

步驟(2)中，分次加入硫酸銨至超濾濃縮液的方式是：第一次加入15～19％，第二次加入5～9％。

步驟(2)中，離心的轉(zhuǎn)速為4000～6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時(shí)間為40～60分鐘。

步驟(2)中，超濾至殘余硫酸銨濃度小于千分之一；和/或，超濾采用膜孔徑為30～50kD超濾膜。

步驟(3)中，加入甲醛溶液至甲醛的終濃度為0.15～0.25％(v/v)，脫毒的溫度為36～38℃，脫毒的時(shí)間為15～30天。

本發(fā)明還提供了前述方法制備得到的破傷風(fēng)類毒素。

綜上，本發(fā)明方法在大工業(yè)生產(chǎn)下制備的破傷風(fēng)類毒素質(zhì)量?jī)?yōu)良，純度高，單體含量高于85％，殘余氨基含量高于35mol-NH/molTT，效力好、毒性低，且制備過程可控度相對(duì)更高，操作方便，脫毒體積小，甲醛、硫酸銨用量少，利于環(huán)保，應(yīng)用前景良好。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1 3批破傷風(fēng)類毒素280nm下HPLC分析峰型結(jié)果，三批峰圖高度重合進(jìn)一步證明產(chǎn)品的批間一致性。

具體實(shí)施方式

菌株：破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌L58株(保藏號(hào)為：CMCC64008)

儀器和試劑：DHP-9902電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；破傷風(fēng)1000L發(fā)酵罐購(gòu)自成都英德生物工程公司；GQLY-125N連續(xù)流離心機(jī)購(gòu)自遼寧陽光制藥機(jī)械有限公司；超濾膜、復(fù)合濾芯均購(gòu)自頗爾過濾器(北京)有限公司；FILTRON超濾器購(gòu)自日本；RC12BP索華低速大容量離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)科峻公司；SASO11G23J彈筒濾器購(gòu)自頗爾過濾器(北京)有限公司；恒溫孵室為公司自建。

甲醛溶液購(gòu)自廣東光華科技股份有限公司；碳酸氫鈉購(gòu)自自貢鴻鶴制藥有限責(zé)任公司；硫酸銨購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠。

實(shí)施例1本發(fā)明制備破傷風(fēng)類毒素的方法

一、制備方法

1.破傷風(fēng)類毒素培養(yǎng)

檢定合格的破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌啟開后進(jìn)行傳代，后進(jìn)行厭氧靜止培養(yǎng)，至得到破傷風(fēng)毒素絮狀單位達(dá)到80Lf/ml的培養(yǎng)液，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行殺菌(甲醛殺菌)。

2.收集培養(yǎng)液上清

對(duì)殺菌后的培養(yǎng)液進(jìn)行離心，具體是經(jīng)連續(xù)流離心機(jī)13000轉(zhuǎn)/分鐘離心收集上清，再經(jīng)復(fù)合濾芯進(jìn)行澄清過濾。

3.上清液超濾濃縮

上清液經(jīng)30kD超濾膜包超濾至原體積的1/10，進(jìn)液壓力為0.15～0.4MPa，回流壓力為0.05～0.2MPa。

4.分段鹽析

分次向超濾濃縮液中加入固體硫酸銨，第一次加入17％，第二次加入5％，共計(jì)加入22％(g/ml)進(jìn)行鹽析。4000轉(zhuǎn)/分鐘離心60分鐘收集沉淀、溶解后用30KD濾膜等體積超濾至殘余硫酸銨濃度小于千分之一，即為精制毒素。

5.脫毒

精制毒素用注射用水稀釋2.1倍后，加入甲醛溶液至終濃度為0.25％(ml/ml)，置36～38℃脫毒15天，脫毒檢查合格即為類毒素。

二、收率

本發(fā)明制備方法在培養(yǎng)體積為800L的情況下，制備破傷風(fēng)類毒素的收率為62.7％。

實(shí)施例2本發(fā)明制備破傷風(fēng)類毒素的方法

一、制備方法

1.破傷風(fēng)類毒素培養(yǎng)

檢定合格的破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌啟開后進(jìn)行傳代，后進(jìn)行厭氧靜止培養(yǎng)，至得到破傷風(fēng)毒素絮狀單位達(dá)到100Lf/ml的培養(yǎng)液，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行殺菌(甲醛殺菌)。

2.收集培養(yǎng)液上清

對(duì)殺菌后的培養(yǎng)液進(jìn)行離心，具體是經(jīng)連續(xù)流離心機(jī)14000轉(zhuǎn)/分鐘離心收集上清，再經(jīng)復(fù)合濾芯進(jìn)行澄清過濾。

3.上清液超濾濃縮

上清液經(jīng)50kD超濾膜包超濾至原體積的1/13，進(jìn)液壓力為0.15～0.4MPa，回流壓力為0.05～0.2MPa。

4.分段鹽析

分次向超濾濃縮液中加入固體硫酸銨，第一次加入19％，第二次加入7％，共計(jì)加入26％(g/ml)進(jìn)行鹽析。5000轉(zhuǎn)/分鐘離心50分鐘收集沉淀、溶解后用50KD濾膜等體積超濾至殘余硫酸銨濃度小于千分之一，即為精制毒素。

5.脫毒

精制毒素用注射用水稀釋1.9倍后，加入甲醛溶液至終濃度0.20％(ml/ml)，置36～38℃脫毒20天，脫毒檢查合格即為類毒素。

二、收率

本發(fā)明制備方法在培養(yǎng)液體積為800L的情況下，制備破傷風(fēng)類毒素的收率為58.75％。

實(shí)施例3本發(fā)明制備破傷風(fēng)類毒素的方法

一、制備方法

1.破傷風(fēng)類毒素培養(yǎng)

檢定合格的破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌啟開后進(jìn)行傳代，后進(jìn)行厭氧靜止培養(yǎng)，至得到破傷風(fēng)毒素絮狀單位達(dá)到120Lf/ml的培養(yǎng)液，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行殺菌(甲醛殺菌)。

2.收集培養(yǎng)液上清

對(duì)殺菌后的培養(yǎng)液進(jìn)行離心，具體是經(jīng)連續(xù)流離心機(jī)15000轉(zhuǎn)/分鐘離心收集上清，再經(jīng)復(fù)合濾芯進(jìn)行澄清過濾。

3.上清液超濾濃縮

上清液經(jīng)50kD超濾膜包超濾至原體積的1/15，進(jìn)液壓力為0.15～0.4MPa，回流壓力為0.05～0.2MPa。

4.分段鹽析

分次向超濾濃縮液中加入固體硫酸銨，第一次加入15％，第二次加入9％，共計(jì)加入24％(g/ml)進(jìn)行鹽析。6000轉(zhuǎn)/分鐘離心40分鐘收集沉淀、溶解后用50KD濾膜等體積超濾至殘余硫酸銨濃度小于千分之一，即為精制毒素。

5.脫毒

精制毒素用注射用水稀釋2.4倍后，加入甲醛溶液至終濃度0.15％(ml/ml)，置36～38℃脫毒30天，脫毒檢查合格即為類毒素。

二、收率

本發(fā)明制備方法在培養(yǎng)體積為800L的情況下，制備破傷風(fēng)類毒素的收率為68.02％。

質(zhì)量檢測(cè)：

1.按現(xiàn)行藥典方法對(duì)3批(破傷風(fēng)類毒素原液分別按照實(shí)施例1、2、3制備的破傷風(fēng)毒素原液)進(jìn)行檢定。

2.TNBS檢測(cè)破傷風(fēng)類毒素殘余氨基數(shù)量

3.HPLC檢測(cè)破傷風(fēng)類毒素單體含量

檢測(cè)結(jié)果

如表1和圖1所示：

表1 3批破傷風(fēng)類毒素原液質(zhì)量結(jié)果統(tǒng)計(jì)

從表1和圖1可知，三批破傷風(fēng)類毒素原液的純度、單體含量、殘留氨基值高，批間一致性良好，各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)符合藥典規(guī)定。該方法精制后脫毒，克服了原制毒素脫毒存在的脫毒體積大、操作不便、制備困難的缺點(diǎn)。還避免了培養(yǎng)基小分子物質(zhì)通過活性基團(tuán)連接至TT分子，最終可能促使產(chǎn)生不同分子大小的TT、引入致敏物質(zhì)等風(fēng)險(xiǎn)。采用該方法還節(jié)約了硫酸銨、甲醛用量，降低了成本，利于環(huán)保且提高了生產(chǎn)效率。

綜上，本發(fā)明方法制備的破傷風(fēng)類毒素質(zhì)量?jī)?yōu)良，純度高達(dá)2948～3086Lf/mgPN，且單體含量高于85％，殘余氨基含量高于35mol–NH/mol TT，制備工藝穩(wěn)定，批間質(zhì)量控制良好，操作方便，硫酸銨、甲醛用量少，利于環(huán)保，應(yīng)用前景良好。