相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)涉及在2012年5月15日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)朥S61/647,200，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合于此。
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體上涉及治療化合物的領(lǐng)域。更特別地本發(fā)明涉及5-[[4-[[嗎啉-2-基]甲基氨基]-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氨基]吡嗪-2-腈化合物(在此稱為“TMF化合物”)，其，除其他外(interalia)，抑制細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶(CheckpointKinase)1(CHK1)激酶功能。本發(fā)明還涉及包含這樣的化合物的藥物組合物，和這樣的化合物和組合物在體外和體內(nèi)以抑制CHK1激酶功能的應(yīng)用，以及在由CHK1介導(dǎo)的、由CHK1激酶功能的抑制改善的等的疾病和病況(包括增殖性(proliferative，增生性)病況如癌癥等)的治療中的應(yīng)用，可選擇地與其他藥劑組合，例如，(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)電離輻射；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；或(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。
背景技術(shù)：
：：在此引用了許多出版物以更全面地描述和公開本發(fā)明以及本發(fā)明涉及的現(xiàn)有技術(shù)的狀況。這些參考文獻(xiàn)的每一個(gè)都以其全部內(nèi)容包括在本公開中在此引用以供參考，如同各個(gè)參考文獻(xiàn)以相同程度明確地且單獨(dú)地指明通過引用被并入。貫穿本說明書，包括隨附的權(quán)利要求，除非上下文另外要求，單詞“包含”、和變體如“包含了”和“包含有”，將理解為表明包括所述的整數(shù)或步驟或者整數(shù)或步驟的組但不排除任何其他整數(shù)或步驟或者整數(shù)或步驟的組。必須注意的是，如在該說明書和附屬的權(quán)利要求中使用的，除非上下文另外明確地陳述，否則單數(shù)形式“一種”、“一個(gè)”以及“該”包括復(fù)數(shù)形式。因此，例如，參考“藥物載體”包括兩種或更多種這樣的載體等的混合物。在此經(jīng)常以從“約”一個(gè)特定的值，和/或至“約”另一個(gè)特定值來表達(dá)范圍。當(dāng)表達(dá)這樣的范圍時(shí)，另一個(gè)實(shí)施方式包括從一個(gè)特定數(shù)值和/或至其他特定值。類似地，當(dāng)以近似值表達(dá)數(shù)值時(shí)，通過使用先行詞“約”，應(yīng)理解，該特定值形成另一個(gè)實(shí)施方式。本公開包括對(duì)理解本發(fā)明可為有用的信息。并不是承認(rèn)在此提供的任何信息為現(xiàn)有技術(shù)或與當(dāng)前要求的發(fā)明相關(guān)，或者明確地或暗示地引用的任何出版物為現(xiàn)有技術(shù)。細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1(CHK1)通過細(xì)胞分裂周期的進(jìn)程(progression)是嚴(yán)格調(diào)節(jié)的過程，且在稱為細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的數(shù)個(gè)位點(diǎn)處進(jìn)行監(jiān)控(參見，例如，Weinert和Hartwell，1989；Bartek和Lukas，2003)。在細(xì)胞周期的四個(gè)階段(G1、S(DNA復(fù)制)、G2和M(有絲分裂))中發(fā)現(xiàn)了這些檢測(cè)點(diǎn)并且它們確保控制DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂的保真度的關(guān)鍵事件正確地完成。通過許多刺激激活細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)，許多刺激包括DNA損傷和由缺陷復(fù)制造成的DNA錯(cuò)誤。當(dāng)此發(fā)生時(shí)，細(xì)胞周期將停滯(arrest)，允許用于發(fā)生DNA修復(fù)的時(shí)間，或者如果損傷太嚴(yán)重，允許用于激活導(dǎo)致受控的細(xì)胞死亡的細(xì)胞過程的時(shí)間。根據(jù)限定，所有的癌癥具有異常的細(xì)胞分裂周期的一些形式。經(jīng)常地，癌癥細(xì)胞具有一個(gè)或更多有缺陷的細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)，或在特定DNA修復(fù)通路內(nèi)的港口缺陷(harbourdefect)。與非癌的細(xì)胞(其中所有的檢測(cè)點(diǎn)和DNA修復(fù)通路為完整無缺的)相比，這些細(xì)胞因此常更依賴于其余的細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)和修復(fù)通路。癌細(xì)胞對(duì)DNA損傷的響應(yīng)常常為它們是否繼續(xù)增殖或激活細(xì)胞死亡過程并死亡的關(guān)鍵決定因素。例如，包含腫瘤抑制子p53的一種或多種突變形式的腫瘤細(xì)胞在G1DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)中是有缺陷的。因此G2或S-階段(S-phase)檢測(cè)點(diǎn)的抑制劑有望進(jìn)一步削弱腫瘤細(xì)胞修復(fù)受損的DNA的能力。許多已知癌癥治療通過物理修飾細(xì)胞的DNA或者擾亂可以影響DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂的保真度的至關(guān)重要的細(xì)胞過程(如DNA代謝、DNA合成、DNA轉(zhuǎn)錄和微管紡錘體形成)引起DNA損傷。這樣的治療包括例如，引起DNA鏈斷裂的放射治療，和各種化學(xué)治療劑包括拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、抗代謝物、DNA烷化劑和含鉑的細(xì)胞毒性藥物。對(duì)這些基因毒性治療的重要的限制為藥物抗性。導(dǎo)致該抗性的最重要的機(jī)制之一歸因于激活細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)，其給予腫瘤細(xì)胞修復(fù)受損的DNA發(fā)時(shí)間。通過去除特定的細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)，或抑制DNA修復(fù)的特定形式，其有可能因此繞過腫瘤細(xì)胞對(duì)基因毒性藥劑的抗性并增大DNA損傷引起的腫瘤細(xì)胞死亡，從而增強(qiáng)這些癌癥治療的治療指數(shù)。CHK1為參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)信號(hào)的絲氨酸/蘇氨酸激酶，細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)信號(hào)響應(yīng)于DNA損傷和由缺陷的復(fù)制造成的DNA中的錯(cuò)誤而被激活(參見，例如，Bartek和Lukas，2003)。CHK1通過底物的磷酸化轉(zhuǎn)導(dǎo)這些信號(hào)，底物參與許多細(xì)胞活動(dòng)，其包括細(xì)胞周期停滯和DNA修復(fù)。CHK1的兩個(gè)關(guān)鍵底物為Cdc25A和Cdc25C磷酸酶，其去磷酸化CDK1導(dǎo)致其激活，這是離開G2進(jìn)入有絲分裂(M期)的要求(參見，例如，Sanchez等人，1997)。通過CHK1磷酸化Cdc25C和相關(guān)的Cdc25A阻斷了它們激活CDK1的能力，從而阻止了細(xì)胞離開G2進(jìn)入M期。已在其中CHK1功能已被敲出(knockout)的許多研究中證明了CHK1在DNA損傷誘導(dǎo)的G2細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)中的作用(參見，例如，Liu等人，2000；Zhao等人，2002；Zachos等人，2003)。DNA損傷誘導(dǎo)的G2檢測(cè)點(diǎn)對(duì)CHK1的依賴提供了對(duì)癌癥治療的治療策略的一個(gè)實(shí)例，包括CHK1的靶向抑制。經(jīng)DNA損傷后，p53腫瘤抑制蛋白被穩(wěn)定且激活以產(chǎn)生p53-依賴的G1停滯，引起細(xì)胞凋亡或DNA修復(fù)(Balaint和Vousden，2001)。超過一半的所有癌癥是p53功能性缺陷的，其可使得它們對(duì)基因毒性癌癥治療有抵抗力，這些治療如電離輻射(IR)和某些形式的化療(參見，例如，Greenblatt等人，1994；Carson和Lois，1995)。這些p53缺陷性細(xì)胞不能在G1檢測(cè)點(diǎn)停滯或經(jīng)歷細(xì)胞凋亡或DNA修復(fù)，并且因此對(duì)于生存力和復(fù)制保真度可能更依賴于G2檢測(cè)點(diǎn)。因此通過抑制CHK1激酶功能去除(abrogation)G2檢測(cè)點(diǎn)可以選擇性地使p53缺陷性癌細(xì)胞對(duì)基因毒性癌癥治療敏感，并且這已被證明(參見，例如，Wang等人，1996；Dixon和Norbury，2002)。另外，還表明，通過同源重組，CHK1參與到S期細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)和DNA修復(fù)中。因此，在那些DNA損傷后依賴于這些過程的癌癥中，CHK1激酶的抑制可以提供采用CHK1抑制劑的用于治療癌癥的另外的治療策略(參見，例如，Sorensen等人，2005)。此外，由于高水平的內(nèi)源性DNA損傷(參見，例如，Cavalier等人，2009；Brooks等人，2012)或通過原癌基因驅(qū)動(dòng)的升高的復(fù)制，例如擴(kuò)增或過表達(dá)的MYC基因(參見，例如，DiMicco等人，2006；Cole等人，2011；Murga等人，2011)，某些癌癥可以呈現(xiàn)出復(fù)制應(yīng)激(replicativestress)。通過CHK1激酶，這樣的癌癥可以呈現(xiàn)出升高的信號(hào)(參見，例如，等人，2011)。在那些依賴于這些過程的癌癥中抑制CHK1激酶，可以提供采用CHK1抑制劑的用于治療癌癥的另外的治療策略(參見，例如，Cole等人，2011；Davies等人，2011；Ferrao等人，2011)。采用CHK1選擇性siRNA的最近的數(shù)據(jù)支持CHK1選擇性的抑制作為相關(guān)的治療方法，并建議與某些其他檢測(cè)點(diǎn)激酶的組合抑制提供不了任何另外的益處并且可能是非生產(chǎn)性的(參見，例如，Xiao等人，2006；Guzi等人，2011)。來自各種化學(xué)類別的CHK1激酶功能的小分子選擇性的抑制劑已被描述(參見，例如，Tao等人，2006)。已知化合物Collins等人，2009a(WO2009/044162A1)描述了具有下列式的某些化合物，其抑制細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1(CHK1)激酶功能，并且其在例如癌癥的治療中是有用的：在Collins等人，2009a的實(shí)例中為下列的化合物：在Collins等人，2009a限定的屬中，X可以為-CRA5-(參見，例如，其中第8頁，第27行)以及-RA5-可以為-QA5(參見，例如，其中第9頁，第1行)。基團(tuán)-QA5被廣泛地限定(參見，例如，其中第31頁，第27行至第38頁，第13行)，并且可以為，例如，-CF3(參見，例如，第31頁，第1行和第33頁，第21行)。然而，在Collins等人，2009a的實(shí)例中沒有一個(gè)實(shí)例的X為-CRA5-其中-RA5為-CF3。Collins等人，2009b，描述了具有下列式的某些化合物，其抑制細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1(CHK1)激酶功能，并且其在例如癌癥的治療中是有用的：Walton等人，2010，描述了稱為SAR-020106的CHK1抑制劑的臨床前研究。Almeida等人，2008，描述了某些吡唑基-氨基-取代的吡嗪，據(jù)稱其在治療癌癥中是有用的。Ioannidis等人，2009，描述了某些化合物，其抑制Janus-相關(guān)激酶(JAK，兩面神激酶)。參見，例如，其中第6526頁方案5。Lin等人，2005，描述了某些大環(huán)脲化合物，據(jù)稱其作為蛋白激酶抑制劑為有用的。參見，例如，其中第1頁[0004]段。Tao等人，2005，描述了某些大環(huán)脲化合物，據(jù)稱其作為蛋白激酶抑制劑為有用的。參見，例如，其中第2頁。Li等人，2007，描述了某些大環(huán)脲CHK1抑制劑的制備和測(cè)試。參見，其中第6502頁表1。Tao等人，2007a，描述了某些大環(huán)脲CHK1抑制劑的制備和測(cè)試。參見，其中第6596頁表2。Tao等人，2007b，描述了某些大環(huán)脲CHK1抑制劑的制備和測(cè)試。參見，其中第1517頁表3。發(fā)明人中的一個(gè)或更多個(gè)已經(jīng)貢獻(xiàn)于本出版物，其中描述了許多CHK1抑制劑，包括稱作CCT244747的下列化合物。參見，Lainchbury等人，2012(顯然于2012年10月19日在線公開)和Walton等人，2012(顯然于2012年10月15日公開)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：如在此描述的，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及5-[[4-[[嗎啉-2-基]甲基氨基]-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氨基]吡嗪-2-腈化合物(在此稱作“TFM化合物”)。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含如在此描述的TFM化合物以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的組合物(例如，藥物組合物)。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物(例如，藥物組合物)適合于口服給予至受試者。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物為以下的形式：口服片劑、口服顆粒劑、口服粉末劑、口服膠囊劑、口服扁囊劑或口服丸劑。本發(fā)明的另一方面涉及制備組合物(例如，藥物組合物)的方法，包括使如在此描述的TFM化合物和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑混合的步驟。本發(fā)明的另一方面涉及在細(xì)胞中體外或體內(nèi)抑制CHK1激酶功能的方法，包括使細(xì)胞與有效量的如在此描述的TFM化合物接觸。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括使細(xì)胞與一種或更多種選自以下的其他藥劑接觸：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)電離輻射；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。本發(fā)明的另一方面涉及以下的方法：在體外或體內(nèi)調(diào)節(jié)(例如，抑制)細(xì)胞增殖(例如，細(xì)胞的增殖)、抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、促進(jìn)細(xì)胞凋亡或這些中的一種或更多種的組合，包括使細(xì)胞與有效量的如在此描述的TFM化合物接觸。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括使細(xì)胞與一種或更多種選自以下的其他藥劑接觸：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)電離輻射；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。本發(fā)明的另一方面涉及治療的方法，包括給予需要治療的受試者治療有效量的如在此描述的TFM化合物，優(yōu)選以藥物組合物的形式。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述給予為口服給予。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括給予受試者一種或更多種選自以下的其他藥劑：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)電離輻射；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。本發(fā)明的另一方面涉及如在此描述的TFM化合物用于在通過療法治療人或動(dòng)物體的方法中使用。在一個(gè)實(shí)施方式中，化合物用于通過口服給予在通過療法治療人或動(dòng)物體的方法中使用。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療的方法進(jìn)一步包括用(i)TFM化合物和(ii)一種或更多種的選自以下的其他藥劑治療：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)電離輻射；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。本發(fā)明的另一方面涉及如在此描述的TFM化合物在制備用于在治療中使用的藥物中的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方式中，藥物為用于口服給予的藥物。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療包括用(i)包含TFM化合物的藥物和(ii)一種或更多種選自以下的其他藥劑治療：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)電離輻射；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為由CHK1介導(dǎo)的疾病或病況的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為通過抑制CHK1激酶功能改善的疾病或病況的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為增殖性病況的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為癌癥的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為以下的治療：頭癌；頸癌；神經(jīng)系統(tǒng)癌癥；腦癌；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；肺/縱隔癌；乳癌；食道癌；胃癌；肝癌；膽道癌；胰腺癌；小腸癌；大腸癌；結(jié)腸直腸癌；婦科癌癥；泌尿生殖系統(tǒng)癌癥；卵巢癌；甲狀腺癌；腎上腺癌；皮膚癌；黑色素瘤；骨肉瘤；軟組織肉瘤；小兒惡性腫瘤；霍奇金氏(Hodgkin’s)病；非霍奇金氏(Hodgkin’s)淋巴瘤；骨髓瘤；白血??；或從未知原發(fā)部位轉(zhuǎn)移。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為以下的治療：肺癌、乳癌、卵巢癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、淋巴瘤、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)或成神經(jīng)細(xì)胞瘤。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為p53缺陷性癌癥(p53deficientcancer)的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為MYC-擴(kuò)增的癌癥(MYCamplifiedcancer)的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為c-MYC-擴(kuò)增的癌癥的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為MYCN-擴(kuò)增的癌癥的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為以MYC的過表達(dá)為特征的癌癥的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為以MYCN的過表達(dá)為特征的癌癥的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為以c-MYC的過表達(dá)為特征的癌癥的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為MYCN-擴(kuò)增的成神經(jīng)細(xì)胞瘤的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為c-MYC-擴(kuò)增的B細(xì)胞淋巴瘤的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為以增強(qiáng)的內(nèi)源性復(fù)制應(yīng)激為特征的癌癥的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為以CHK1信號(hào)的增強(qiáng)的內(nèi)源性激活為特征的癌癥的治療。本發(fā)明的另一方面涉及試劑盒，包含(a)如在此描述的TFM化合物，優(yōu)選以藥物組合物提供并且在合適的容器和/或具有合適的包裝；和(b)使用說明，例如，如何服用化合物的書面說明。在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒進(jìn)一步包含一種或更多選自以下的其他藥劑：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)全身放射性藥物；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。本發(fā)明的另一方面涉及通過在此描述的合成方法或包含如在此描述的合成方法的方法可獲得的TFM化合物。本發(fā)明的另一方面涉及通過在此描述的合成方法或包含如在此描述的合成方法的方法獲得的TFM化合物。本發(fā)明的另一方面涉及新的中間體，如在此描述，其適用于在在此描述的合成方法中使用。本發(fā)明的另一方面涉及如在此描述的這樣的新的中間體在在此描述的合成方法中的應(yīng)用。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明的一個(gè)方面的特征和優(yōu)選的實(shí)施方式還將涉及本發(fā)明的其他方面。具體實(shí)施方式化合物本發(fā)明的一個(gè)方面涉及下列式的化合物和其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物和溶劑化物(為了方便，在此全體稱為“5-[[4-[[嗎啉-2-基]甲基氨基]-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氨基]吡嗪-2-腈化合物”或“TFA化合物”)：嗎啉基團(tuán)的連接點(diǎn)為手性中心(在下式中用星號(hào)標(biāo)記)，其可以獨(dú)立地為(R)或(S)構(gòu)型。除非另外說明，否則意在兩種構(gòu)型都包括在內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，化合物為下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或溶劑化物：上述化合物還被稱為5-[[4-[[(2R)-嗎啉-2-基]甲基氨基]-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氨基]吡嗪2-腈。在一個(gè)實(shí)施方式中，化合物為下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或溶劑化物：上述化合物還被稱為5-[[4-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基氨基]-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氨基]吡嗪2-腈?；炯兊男问奖景l(fā)明的一個(gè)方面涉及純的形式的TFM化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，化合物為基本純的形式和/或基本無污染物的形式。在一個(gè)實(shí)施方式中，化合物為具有以下的純度的基本純的形式：按重量計(jì)至少50％(至少50wt％)，例如至少60wt％、例如至少70wt％、例如至少80wt％、例如至少90wt％、例如至少95wt％、例如至少97wt％、例如至少98wt％、例如至少99wt％。除非規(guī)定，否則基本純的形式指為任何立體異構(gòu)體形式或?qū)τ钞悩?gòu)體形式的化合物。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，基本純的形式指對(duì)映異構(gòu)體的混合物，即，相對(duì)于其他化合物純化的。在一個(gè)實(shí)施方式中，基本純的形式指對(duì)映異構(gòu)體的等摩爾混合物(即，外消旋混合物，外消旋體)。在一個(gè)實(shí)施方式中，基本純的形式指一種對(duì)映異構(gòu)體，例如，光學(xué)純對(duì)映異構(gòu)體。在一個(gè)實(shí)施方式中，化合物為基本無污染物的形式，其中污染物存在不多于50wt％、例如不多于40wt％、例如不多于30wt％、例如不多于20wt％、例如不多于10wt％、例如不多于5wt％、例如不多于3wt％、例如不多于2wt％、例如不多于1wt％。除非規(guī)定，否則污染物指其他化合物，即，除了對(duì)映異構(gòu)體外的。在一個(gè)實(shí)施方式中，污染物指其他化合物和其他對(duì)映異構(gòu)體。在一個(gè)實(shí)施方式中，化合物為具有以下光學(xué)純度的基本純的形式：至少60％(即，基于摩爾，60％的化合物為所需的對(duì)映異構(gòu)體，而40％為非所需的對(duì)映異構(gòu)體)，例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％。同分異構(gòu)體某些化合物可存在為一種或更多的特定的幾何的、光學(xué)的、對(duì)映異構(gòu)體的、非對(duì)映的、差向異構(gòu)體的、阻轉(zhuǎn)的(atropic)、立體異構(gòu)的、互變異構(gòu)的、構(gòu)象異構(gòu)的或異頭物的形式，其包括但不限于，順式和反式(cis-andtrans-forms)；E型和Z型(E-andZ-forms)；c型、t型和r型(c-,t-,andr-forms)；內(nèi)型和外型(endo-andexo-forms)；R型、S型和內(nèi)消旋型(R-,S-,andmeso-forms)；D型和L型(D-andL-forms)；d型和l型(d-andl-forms)；(+)型和(-)型((+)and(-)forms)；酮形式、烯醇形式和烯醇化物形式；順式和反式(syn-andanti-forms)；向斜式和背斜式(synclinal-andanticlinal-forms)；α型和β型(α-andβ-forms)；軸向形式和赤道向形式(axialandequatorialforms)；船式、椅式、扭曲式、信封式和半椅式；以及它們的組合，下文中全體稱為“同分異構(gòu)體”(或“同分異構(gòu)體形式”)。需要注意的是，除了以下面討論的互變異構(gòu)形式，從術(shù)語“同分異構(gòu)體”中特別排除，如在此使用，為結(jié)構(gòu)(或構(gòu)造的)同分異構(gòu)體(即，同分異構(gòu)體差異在于原子之間的連接，而不是僅僅由原子在空間中的位置)。上述排除與互變異構(gòu)形式無關(guān)，例如，酮形式、烯醇形式和烯醇化物形式，例如，如在下列互變異構(gòu)對(duì)中：酮/烯醇(以下所示)、亞胺/烯胺、酰胺/亞氨基醇，脒/脒，亞硝基/肟、硫酮/烯硫醇、N-亞硝基/羥基偶氮、和硝基/酸式硝基。需要注意的是，具有一個(gè)或更多個(gè)同位素取代的化合物特別包括在術(shù)語“同分異構(gòu)體”中。例如，H可為任何同位素形式，包括1H、2H(D)、和3H(T)；C可為任何同位素形式，包括12C、13C和14C；O可為任何同位素形式，包括16O和18O；等。除非另外規(guī)定，否則，對(duì)特定化合物的引用包括所有的這樣同分異構(gòu)體形式，包括其混合物(例如，外消旋混合物)。用于制備(例如，不對(duì)稱合成)和分離(例如，分步結(jié)晶和色譜手段)這樣同分異構(gòu)體形式的方法已為本領(lǐng)域所知，或者是以已知的方式通過改變?cè)诖私虒?dǎo)的方法或已知的方法而容易地獲得的。鹽制備、純化和/或處理化合物對(duì)應(yīng)的鹽，例如，藥學(xué)上可接受的鹽，可以是方便的或令人滿意的。Berge等人，1977，“PharmaceuticallyAcceptableSalts,”，J.Pharm.Sci.,Vol.66,pp.1-19中討論了藥學(xué)上可接受的鹽的實(shí)例。例如，如果化合物為陰離子的，或具有其可以為陰離子的官能團(tuán)(例如，-COOH可以為-COO-)，那么可以合適的陽離子形成鹽。合適的無機(jī)陽離子的實(shí)例包括，但不限于，堿金屬離子如Na+和K+、堿土金屬陽離子如Ca2+和Mg2+、以及其他陽離子如Al3+。合適的有機(jī)陽離子的實(shí)例包括，但不限于，銨離子(即NH4+)和取代的銨離子(例如，NH3R+、NH2R2+、NHR3+、NR4+)。一些合適的取代銨離子的實(shí)例為由以下衍生的那些：乙胺、二乙胺、二環(huán)己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、芐胺、苯基芐胺、膽堿、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，如賴氨酸和精氨酸。常見的季銨離子的實(shí)例為N(CH3)4+。如果化合物為陽離子的，或具有可為陽離子的官能團(tuán)(例如，-NH2可以為-NH3+)，那么可用合適的陰離子形成鹽。合適的無機(jī)陰離子的實(shí)例包括，但不限于，由下列無機(jī)酸衍生的那些：鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、亞硫酸(磺酸)、硝酸、亞硝酸、磷酸和亞磷酸。合適的有機(jī)陰離子的實(shí)例包括，但不限于，由下列有機(jī)酸衍生的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗壞血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟腦磺酸、肉桂酸、檸檬酸、依地酸、乙二磺酸、乙磺酸、甲酸、富馬酸、葡庚糖酸(glucheptonicacid)、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羥基馬來酸、羥基萘甲酸、羥乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、馬來酸、蘋果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕櫚酸、雙羥萘酸(帕莫酸，pamoic)、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水楊酸、硬脂酸、琥珀酸、對(duì)氨基苯磺酸(sulfanilic)、酒石酸、甲苯磺酸和戊酸。合適的聚合酸有機(jī)陽離子的實(shí)例包括，但不限于，由下列聚合酸衍生的那些：單寧酸、羧甲基纖維素。除非另外規(guī)定，否則對(duì)特定的化合物的引用還包括其鹽形式。水合物和溶劑化物制備、純化和/或處理化合物對(duì)應(yīng)的溶劑化物可以是方便的或令人滿意的。在此使用的術(shù)語“溶劑化物”的常規(guī)含義是指溶質(zhì)(例如，化合物、化合物的鹽)和溶劑的復(fù)合物。如果溶劑為水，溶劑化物可簡單地理解為水合物，例如，半水合物、單水合物、倍半水合物、二水合物、三水合物等。除非另外規(guī)定，否則對(duì)特定化合物的引用還包括其溶劑化物和水合物形式?；瘜W(xué)受保護(hù)形式制備、純化、和/或處理化學(xué)保護(hù)形式的化合物可以是方便的或令人滿意的。在此以常規(guī)化學(xué)含義使用術(shù)語“化學(xué)受保護(hù)形式”，且其涉及在規(guī)定的條件下(例如，pH、溫度、輻射、溶劑等)其中一個(gè)或更多個(gè)活性的官能團(tuán)受到保護(hù)免于不期望的化學(xué)反應(yīng)的化合物。在實(shí)踐中，利用熟知的化學(xué)方法以可逆地呈現(xiàn)(render)惰性的官能團(tuán)，其否則在規(guī)定的條件下為活性的。在化學(xué)受保護(hù)形式中，一個(gè)或更多個(gè)活性的官能團(tuán)以受保護(hù)的或保護(hù)的基團(tuán)的形式存在(也稱為受掩蔽的或掩蔽的基團(tuán)或者被阻止的或阻止的基團(tuán))。通過保護(hù)活性的官能團(tuán)，可以進(jìn)行包含其他不受保護(hù)的反應(yīng)官能團(tuán)的反應(yīng)，而不會(huì)影響受保護(hù)的基團(tuán)；保護(hù)基團(tuán)可被去除，通常在后續(xù)步驟中，而基本上不影響余下的分子。參見，例如，《有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)》(ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,T.Greene與P.Wuts；第四版；JohnWiley與Sons，2006)。各種各樣的這樣的“保護(hù)的”、“阻斷的”或“掩蔽的”方法被廣泛地使用且在有機(jī)合成中熟知。例如，化合物其具有兩個(gè)不等價(jià)的活性的官能團(tuán)，在規(guī)定條件下兩個(gè)都可為活性的，在規(guī)定的條件下，可以被衍生以使一個(gè)官能團(tuán)成為“受保護(hù)的”，并且因此是惰性的；這樣受保護(hù)，化合物可用作實(shí)際上只有一個(gè)活性的官能團(tuán)的反應(yīng)物。完成所需的反應(yīng)(包含其他官能團(tuán))后，受保護(hù)的基團(tuán)可“去保護(hù)”以返還其原來的功能性官能度。例如，氨基可被保護(hù)，例如，為酰胺(-NRCO-R)或氨基甲酸酯(-NRCO-OR)，例如，為：甲基酰胺(-NHCO-CH3)；芐氧基酰胺(-NHCO-OCH2C6H5，-NH-Cbz)；為叔丁氧基酰胺(-NHCO-OC(CH3)3，-NH-Boc)；2-聯(lián)苯基-2-丙氧基酰胺(-NHCO-OC(CH3)2C6H4C6H5，-NH-Bpoc)，為9-芴基甲氧基酰胺(-NH-Fmoc)，為6-硝基藜蘆基氧基酰胺(-NH-Nvoc)，為2-三甲基甲硅烷基乙氧基酰胺(-NH-Teoc)，為2,2,2-三氯乙氧基酰胺(-NH-Troc)，為烯丙基氧基酰胺(-NH-Alloc)，為2-(苯基磺?；?乙氧基酰胺(-NH-Psec)；或，在合適的情況下(例如，環(huán)狀胺)，為氮氧自由基(>N-O●)。前藥制備、純化和/或處理前藥形式的化合物可為方便或令人滿意的。如在此使用的，術(shù)語“前藥”，涉及當(dāng)被代謝時(shí)(例如，在體內(nèi))，產(chǎn)生所需的反應(yīng)活性的化合物的化合物。典型地，前藥為惰性的，或比所需的活性化合物反應(yīng)活性更低，但可提供有利的處理、給予或代謝特性。組合物本發(fā)明的一個(gè)方面涉及組合物(例如，藥物組合物)，包含如在此描述的TFM化合物，和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。本發(fā)明的另一方面涉及制備組合物(例如，藥物組合物)的方法，包括使如在此描述的TFM化合物和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物(例如，藥物組合物)適合于口服給予受試者。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物為口服片劑、口服顆粒劑、口服粉末劑、口服膠囊劑、口服扁囊劑或口服丸劑的形式。應(yīng)用如在此描述的，TFM化合物在例如通過抑制CHK1激酶功能而改善的病癥(disorder)(例如，疾病)的治療中為有用的，如在此描述的。在抑制CHK1方法中的應(yīng)用本發(fā)明的一個(gè)方面涉及在體外或體內(nèi)抑制CHK1激酶功能的方法，包括使細(xì)胞與如在此描述的有效量的TFM化合物接觸。本發(fā)明的另一方面涉及在體外或體內(nèi)，在細(xì)胞中抑制CHK1激酶功能的方法，包括使細(xì)胞與如在此描述的有效量的TFM化合物接觸。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法進(jìn)一步包含使細(xì)胞與一種或更多種選自以下的其他的藥劑接觸：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)電離輻射；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。用于測(cè)定CHK1激酶功能抑制的合適的分析在此描述和/或是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法在體外進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法在體內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方式中，以藥學(xué)上可接受的組合物的形式提供TFM化合物?？梢灾委熑魏晤愋偷募?xì)胞，包括但不限于，脂肪、肺、胃腸道(包括，例如，腸、結(jié)腸)、胸部(乳房)、卵巢、前列腺、肝臟(肝)、腎臟(腎)、膀胱、胰腺、腦和皮膚。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠很容易地確定候選化合物是否抑制CHK1激酶功能。例如，在此描述了合適的分析。在抑制細(xì)胞增殖等的方法中的應(yīng)用在此描述的TFM化合物，例如，(a)調(diào)節(jié)(例如，抑制)細(xì)胞增殖；(b)抑制細(xì)胞周期進(jìn)程；(c)促進(jìn)細(xì)胞凋亡；或(d)這些中的一種或更多種的組合。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及在體外或體內(nèi)，調(diào)節(jié)(例如，抑制)細(xì)胞增殖(例如，細(xì)胞的增殖)、抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、促進(jìn)細(xì)胞凋亡或這些中的一種或更多種的組合的方法，包括使細(xì)胞與如在此描述的有效量的TFM化合物接觸。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法是在體外或體內(nèi)調(diào)節(jié)(例如，抑制)細(xì)胞增殖(例如，細(xì)胞的增殖)的方法，包括使細(xì)胞與如在此描述的有效量的TFM化合物接觸。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法進(jìn)一步包含使細(xì)胞與一種或更多種選自以下的其他藥劑接觸：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)電離輻射；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法在體外進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法在體內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方式中，以藥學(xué)上可接受的組合物的形式提供TFM化合物?？梢灾委熑魏晤愋偷募?xì)胞，包括但不限于，肺、胃腸道(包括，例如，腸、結(jié)腸)、胸部(乳房)、卵巢、前列腺、肝臟(肝)、腎臟(腎)、膀胱、胰腺、腦和皮膚。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易能夠確定候選化合物是否調(diào)節(jié)(例如，抑制)細(xì)胞增殖等。例如，在此描述了可以方便地用于評(píng)估由特定化合物提供的活性的分析。例如，細(xì)胞的樣品(例如，來源于腫瘤)可在體外生長并且將化合物與所述的細(xì)胞接觸，并觀察化合物對(duì)那些細(xì)胞的影響。作為“影響”的實(shí)例，可以確定細(xì)胞的形態(tài)學(xué)狀態(tài)(例如，存活或死亡，等)。其中發(fā)現(xiàn)化合物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響，在治療攜帶相同細(xì)胞類型的細(xì)胞患者的方法中，這可用作化合物的效力的預(yù)測(cè)標(biāo)志物或診斷標(biāo)志物。在療法中的應(yīng)用本發(fā)明的另一方面涉及如在此描述的TFM化合物用于在通過療法治療人或動(dòng)物體的方法中使用。本發(fā)明的另一方面涉及如在此描述的TFM化合物用于在通過療法通過口服給予治療人或動(dòng)物體的方法中使用。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療的方法包括用(i)如在此描述的TFM化合物和(ii)一種或更多種選自以下的其他藥劑治療：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)電離輻射；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。本發(fā)明的另一方面涉及(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)全身放射性藥物；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑，如在此描述的，用于在通過療法治療人或動(dòng)物體的方法中使用，其中，治療的方法包括用(i)如在此描述的TFM化合物和以下治療：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)全身放射性藥物；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。在制備藥物中的應(yīng)用本發(fā)明的另一方面涉及如在此描述的TFM化合物在制備用于在治療中使用的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一方面涉及如在此描述的TFM化合物在制備通過口服給予用于在治療中使用的藥物中的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方式中，藥物包含TFM化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療包括用(i)含有如在此描述的TFM化合物的藥物和(ii)一種或更多種選自以下的其他藥劑治療：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)電離輻射；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。本發(fā)明的另一方面涉及如在此描述的以下各項(xiàng)在制備用于在治療中使用的藥物中的應(yīng)用：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)電離輻射；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑，其中治療包括用(i)如在此描述的TFM化合物和以下治療：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)電離輻射；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。治療的方法本發(fā)明的另一方面涉及治療的方法，包括將治療有效量的如在此描述的TFM化合物、優(yōu)選以藥物組合物的形式給予至需要治療的受試者。本發(fā)明的另一方面涉及治療的方法，包括將治療有效量的如在此描述的TFM化合物、優(yōu)選以藥物組合物的形式口服給予至需要治療的受試者。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法進(jìn)一步包括將一種或更多中選自以下的其他藥劑給予至受試者：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)電離輻射；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。治療的病況-由CHK1介導(dǎo)的病況在一個(gè)實(shí)施方式中(例如在療法中的應(yīng)用的實(shí)施方式、在制備藥物中的應(yīng)用的實(shí)施方式、治療的方法的實(shí)施方式)，治療是由CHK1介導(dǎo)的疾病或病況的治療。治療的病況-通過抑制CHK1激酶功能改善的病況在一個(gè)實(shí)施方式中(例如，在療法中的應(yīng)用的實(shí)施方式、在制備藥物中的應(yīng)用的實(shí)施方式、治療的方法的實(shí)施方式)，治療為：通過抑制CHK1激酶功能改善的疾病或病況的治療。治療的病癥-增殖性病況在一個(gè)實(shí)施方式中(例如療法中的應(yīng)用的實(shí)施方式、在制備藥物中的應(yīng)用的實(shí)施方式、治療的方法的實(shí)施方式)，治療為：增殖性(增生性，proliferative)病況的治療。如在此使用的術(shù)語“增殖性病況”，涉及過度的或不正常的細(xì)胞的不需要的或不受控制的細(xì)胞的增殖，如腫瘤的(neoplastic)或增生的(hyperplastic)生長，這是非期望的。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為以良性、惡性前期或惡性細(xì)胞增殖為特征的增殖性病況的治療，包括例如：腫瘤，增生，和瘤(tumour)(例如，組織細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、骨瘤)、癌癥(cancer)(見下文)、銀屑病、骨疾病，纖維增殖性病癥(例如，結(jié)締組織的)、肺纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化、血管平滑肌細(xì)胞增殖，如血管成形術(shù)后狹窄或再狹窄。治療的病癥-癌癥在一個(gè)實(shí)施方式中(例如療法中的應(yīng)用的實(shí)施方式、在制備藥物中的應(yīng)用的實(shí)施方式、治療的方法的實(shí)施方式)，治療為癌癥的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為增殖性病況的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為癌癥的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為下列的治療：肺癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃腸癌、胃癌、腸癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、甲狀腺癌、乳癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、睪丸癌、肝癌、腎癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌、胰腺癌、腦癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤、骨肉瘤、骨癌、鼻咽癌(例如，頭癌、頸癌)、皮膚癌、鱗狀細(xì)胞癌、卡波濟(jì)氏肉瘤、黑色素瘤、惡性黑色素瘤、淋巴瘤或白血病。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為下列的治療：癌(carcinoma)，例如下列的癌：膀胱、胸部、結(jié)腸(例如，結(jié)腸直腸癌如結(jié)腸腺癌(adenocarcinoma)和結(jié)腸腺瘤(adenoma))、腎、表皮、肝、肺(例如，腺癌、小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)、食管、膽囊、卵巢、胰腺(例如，外分泌胰腺癌)、胃、宮頸、甲狀腺、前列腺、皮膚(例如，鱗狀細(xì)胞癌)；淋巴系的造血腫瘤，例如白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、毛細(xì)胞淋巴瘤或伯克特氏(Burkett's)淋巴瘤；骨髓系的造血腫瘤，例如急性和慢性髓細(xì)胞性白血病、骨髓增生異常綜合征或早幼粒細(xì)胞性白血??；間充質(zhì)來源的腫瘤，例如纖維肉瘤或橫紋肌肉瘤；中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，例如星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或神經(jīng)鞘瘤；黑色素瘤；精原細(xì)胞瘤；畸胎癌；骨肉瘤；著色性干皮病(xenoderomapigmentoum)；角化棘皮瘤(keratoctanthoma)；甲狀腺濾泡癌；或卡波西氏(Kaposi's)肉瘤。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為下列的治療：頭癌；頸癌；神經(jīng)系統(tǒng)癌癥；腦癌；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；肺/縱隔癌；乳癌；食道癌；胃癌；肝癌；膽道癌；胰腺癌；小腸癌；大腸癌；結(jié)腸直腸癌；婦科癌癥；泌尿生殖系統(tǒng)癌癥；卵巢癌；甲狀腺癌；腎上腺癌；皮膚癌；黑色素瘤；骨肉瘤；軟組織肉瘤；小兒惡性腫瘤；霍奇金氏?。环腔羝娼鹗狭馨土?；骨髓瘤；白血病；或從未知原發(fā)部位轉(zhuǎn)移。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為下列的治療：肺癌、乳癌、卵巢癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、淋巴瘤、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或成神經(jīng)細(xì)胞瘤。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥以或進(jìn)一步以為p53缺陷性癌癥為特征。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥為p53缺陷性癌癥。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥以或進(jìn)一步以為MYC-擴(kuò)增的癌癥為特征。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥為MYC-擴(kuò)增的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥以或進(jìn)一步以為c-MYC-擴(kuò)增的癌癥為特征。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥為c-MYC-擴(kuò)增的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥以或進(jìn)一步以為MYCN-擴(kuò)增的癌癥為特征。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥為MYCN-擴(kuò)增的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥以或進(jìn)一步以MYC的過表達(dá)為特征。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥為以MYC的過表達(dá)為特征的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥以或進(jìn)一步以MYCN的過表達(dá)為特征。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥為以MYCN的過表達(dá)為特征的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥以或進(jìn)一步以c-MYC的過表達(dá)為特征。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥為以c-MYC的過表達(dá)為特征的癌癥。一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥為MYCN-擴(kuò)增的成神經(jīng)細(xì)胞瘤。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥為c-MYC-擴(kuò)增的B細(xì)胞淋巴瘤。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥以或進(jìn)一步以增加的內(nèi)源性復(fù)制應(yīng)激為特征。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥為以增加的內(nèi)源性復(fù)制應(yīng)激為特征的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥以或進(jìn)一步以增加的CHK1信號(hào)的內(nèi)源性激活為特征。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥為以增加的CHK1信號(hào)的內(nèi)源性激活為特征的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療為癌癥轉(zhuǎn)移的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥以或進(jìn)一步以癌癥干細(xì)胞為特征。通過一種或更多機(jī)制可提高抗癌效果，包括但不限于：細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期進(jìn)程的抑制、血管生成(新血管的形成)的抑制、轉(zhuǎn)移(腫瘤從其原位的擴(kuò)散)的抑制、細(xì)胞遷移(癌細(xì)胞擴(kuò)散到身體的其他部分)的抑制、侵襲(腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散至相鄰的正常結(jié)構(gòu))的抑制或細(xì)胞凋亡(程序性細(xì)胞死亡)的促進(jìn)。本發(fā)明化合物可用于在此描述的癌癥的治療，而獨(dú)立于在此討論的機(jī)制。治療如在此使用的在治療病癥的背景下使用的術(shù)語“治療”，總體上涉及人或動(dòng)物(例如，在獸醫(yī)應(yīng)用中)的治療，其中實(shí)現(xiàn)一些所需的治療效果，例如，病癥的發(fā)展的抑制，并且“治療”包括進(jìn)展速度的降低、進(jìn)展速度的停止、病癥癥狀的減輕、病癥的改善和病癥的治愈。作為預(yù)防措施的治療(即，預(yù)防)也包括在內(nèi)。例如，對(duì)尚未發(fā)展該病癥、但處于發(fā)展該病癥的風(fēng)險(xiǎn)中的患者的使用也包括在術(shù)語“治療”內(nèi)。例如，治療包括癌癥的預(yù)防、降低癌癥的發(fā)病率、減輕癌癥的癥狀等。如在此使用的術(shù)語“治療有效量”，涉及化合物或物質(zhì)、包含化合物的組合物或劑型的量，當(dāng)按照所需的治療方案給予時(shí)，其有效產(chǎn)生一些期望的治療效果，與合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱。組合療法(CombinationTherapies)術(shù)語“治療”包括組合治療和療法，其中，例如，順序或同時(shí)組合兩種或更多種治療或療法。例如，在此描述的化合物也可用于組合療法中，例如，與其他藥劑一起。治療和療法的實(shí)例包括，但不限于，化療(給予活性劑，包括，例如，藥物、抗體(例如，如在免疫療法中)、前藥(例如，如在光動(dòng)力療法、GDEPT、ADEPT等中)；手術(shù)；放射療法；光動(dòng)力療法；基因治療；和控制飲食。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及如在此描述的化合物與一種或更多種(例如，1、2、3、4等)另外的治療藥劑組合，例如，通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞生長或存活或分化的藥劑或療法，從而治療癌癥發(fā)展的數(shù)個(gè)特征。特定的組合將按照醫(yī)生的判斷，其將利用他的常見一般知識(shí)和熟練的醫(yī)生熟知的給藥方案選用給藥。藥劑(即，在此描述的化合物，加上一種或更多種其他藥劑)可以同時(shí)或順序給予，并且可單獨(dú)改變劑量方案和經(jīng)由不同的途徑給予。例如，當(dāng)順序給予時(shí)，可以在緊密間隔的時(shí)間間隔(例如，越過(over)5-10分鐘的時(shí)間段)或在較長的時(shí)間間隔(例如，1、2、3、4或更多小時(shí)的間隔，或當(dāng)需要時(shí)甚至更長的時(shí)間段)給予藥劑，精確的給藥方案與一種或多種治療藥劑的性質(zhì)相稱。藥劑(即，在此描述的化合物，加上一種或更多其他藥劑)可以以單獨(dú)劑型配制在一起，或者可選擇地，單獨(dú)的藥劑可各自配制并一起存在于試劑盒的形式中，可選地與它們的使用說明一起。用于組合療法的另外的藥劑如在此討論的，在一些實(shí)施方式中，TFM化合物與一種或更多種選自以下的其他藥劑組合(例如，結(jié)合)使用：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)電離輻射；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。當(dāng)TFM化合物和一種或更多種的其他藥劑都使用時(shí)，可以任何順序使用(例如，接觸、給予等)它們。而且，它們可一起(例如，接觸、給予等)、作為單一制劑的部分、或分別地作為單獨(dú)的制劑使用。例如，關(guān)于使用TFM化合物和一種或更多種其他藥劑的治療的方法，用TFM化合物的治療(例如，給予)可以先于、同時(shí)、或可以后于用一種或更多種其他藥劑的治療，或它們的組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，用TFM化合物的治療(例如，給予)同時(shí)、或后于用一種或更多種其他藥劑的治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種或更多種其他藥劑為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；例如，依托泊苷、拓?fù)涮婵?、喜樹堿、伊立替康、SN-38、阿霉素、道諾霉素、表柔比星和米托蒽醌。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種或更多種其他藥劑為DNA損傷劑；例如，烷基化劑，例如，替莫唑胺、達(dá)卡巴嗪、絲裂霉素C、環(huán)磷酰胺、樂果(fosfamid)、BCNU、CCNU、美法侖、白消安和苯丁酸氮芥；鉑酸鹽(platinating)藥劑，例如，順鉑、卡鉑和奧沙利鉑；或產(chǎn)生自由基的化合物，例如，博萊霉素。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種或更多種其他藥劑為抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；例如，5-氟尿嘧啶、羥基脲、吉西他濱、阿糖胞苷、氟達(dá)拉濱、卡培他濱、奈拉濱、雷替曲塞、培美曲塞和ZD9331。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種或更多種其他藥劑為微管靶向劑；例如，紫杉醇、多西紫杉醇、卡巴他賽、艾日布林、長春新堿、長春堿和長春瑞濱。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種或更多種其他藥劑為例如，通過外部波束照射遞送的或通過給予全身放射性藥物遞送的電離輻射(例如，作為輻射療法的一部分)，例如，131I-間碘苯甲胍(Metaiodobenzylguanidine)、(131I)碘化鈉、碘(131I)Tositumab、和(90Y)替坦異貝莫單抗(Ibritumomab(90Y)Tiuxetan)。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種或更多種其他藥劑為有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑，例如，Wee1激酶的抑制劑、極光激酶的抑制劑或馬球樣激酶1(polo-likekinase1)的抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種或更多種其他藥劑為DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑，例如，ATR激酶的抑制劑、ATM激酶的抑制劑、CHK2的抑制劑或MK2的抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種或更多種其他藥劑為DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑，例如，聚ADP核糖聚合酶(PARP)的抑制劑，例如，奧拉帕尼。其他應(yīng)用在此描述的TFM化合物還可以用作細(xì)胞培養(yǎng)添加劑以抑制CHK1激酶功能，例如，以抑制細(xì)胞增殖，等。在此描述的TFM化合物還可用作體外分析的部分，例如，為了確定候選候選宿主是否有可能從用所討論的化合物治療中獲益。在此描述的TFM化合物還可用作標(biāo)準(zhǔn)，例如，在分析中，以識(shí)別其他化合物、其他CHK1激酶功能抑制劑、其他抗增殖性藥劑、其他抗癌藥劑，等。試劑盒本發(fā)明的一個(gè)方面涉及試劑盒，包括(a)如在此描述的TFM化合物，或包含如在此描述的TFM化合物的組合物，例如，優(yōu)選以在合適的容器中和/有合適的包裝提供；和(b)使用說明，例如，如何給予化合物或組合物的書面說明。在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒進(jìn)一步包含一種或更多種選自以下的其他藥劑：(a)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑；(b)DNA損傷劑；(c)抗代謝物或胸苷酸合成酶(TS)抑制劑；(d)微管靶向劑；(e)全身放射性藥物；(f)有絲分裂調(diào)節(jié)劑或有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)劑的抑制劑；(g)DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的抑制劑；和(h)DNA損傷修復(fù)酶的抑制劑。書面說明還可以包括活性成分適用治療的適用癥狀列表。給予的途徑可通過任何方便的給予途徑給受試者給予TFM化合物或含有TFM化合物的藥物組合物，不論是全身性/外周或局部地(即，在所需作用部位)。給予的途徑包括，但不限于：口服(例如，通過攝入)；含服；舌下；透皮(包括，例如，通過貼劑(patch)、膏劑(plaster)等)；透粘膜(transmucosal)(包括，例如，通過貼劑、膏劑等)；鼻內(nèi)(例如通過鼻噴霧劑)；眼部(例如，通過滴眼劑)；肺部(例如，通過吸入或吹入療法，其使用，例如，憑借氣溶膠，例如，經(jīng)由口腔或鼻部)；直腸(例如，通過栓劑或灌腸劑)；陰道(例如，通過陰道栓)；腸胃外，例如，通過注射，包括皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、心臟內(nèi)、鞘內(nèi)、脊柱內(nèi)、囊內(nèi)、囊下、眼眶內(nèi)、腹膜內(nèi)、氣管內(nèi)、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下和胸骨內(nèi)；通過植入補(bǔ)給器(depot)或儲(chǔ)器，例如，皮下或肌內(nèi)地。優(yōu)選地，給予的途徑為口服，并且TFM化合物或包含TFM化合物的藥物組合物口服地給予至受試者。受試者/患者受試者/患者可為脊索動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、胎盤哺乳動(dòng)物、有袋動(dòng)物(例如，袋鼠、袋熊)、嚙齒類動(dòng)物(例如，豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠)、鼠科動(dòng)物(例如，小鼠)、兔形動(dòng)物(例如，兔子)、禽類(例如，鳥)、犬科動(dòng)物(例如，家犬)、貓科動(dòng)物(例如，家貓)、馬科動(dòng)物(例如，馬)、豬(例如，家豬)、羊(例如，綿羊)、?？苿?dòng)物(例如，家牛)、靈長類、猿(例如，猴子或類人猿)、猴(例如，狨猴、狒狒)、類人猿(例如，大猩猩、黑猩猩、猩猩、長臂猿)或人。此外，受試者/患者可為其發(fā)育形式中的任一種，例如，胎兒。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試者/患者為人。制劑盡管可能單獨(dú)給予TFM化合物，但優(yōu)選以包含至少一種如在此描述的TFM化合物、連同一種或更多種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他藥學(xué)上可接受的成分的藥物制劑(例如，組合物、配制物、藥物)存在，所述成分包括，但不限于，藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑、佐劑、填充劑、緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑、潤滑劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、表面活性劑(例如，潤濕劑)、掩蔽劑、著色劑、調(diào)味劑和甜味劑。制劑可以進(jìn)一步包含其他活性藥劑，例如，其他治療藥劑或預(yù)防藥劑。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供如上限定的藥物組合物，和制備藥物組合物的方法，包括使至少一種如在此描述的TFM化合物，連同一種或更多種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他藥學(xué)上可接受的成分例如載體、稀釋劑、賦形劑等混合。如果作為分離的(discrete)單元(例如，片劑等)配制，各單元含有預(yù)定量(劑量)的化合物。如在此使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的(藥用的)”，涉及化合物、成分、材料、組合物、劑型等，在合理的醫(yī)藥判斷范圍內(nèi)，它們適用于與討論的受試者(例如，人)的組織接觸而沒有過度的毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或其他問題或并發(fā)癥，與合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱。每種載體、稀釋劑、賦形劑等也必須在與制劑中的其他成分相容的意義上為“可接受的”?？稍跇?biāo)準(zhǔn)藥物學(xué)文本中找到合適的載體、稀釋劑、賦形劑等，例如，《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第18版，Mack出版公司，Easton，Pa.，1990；和《HandbookofPharmaceuticalExcipients》，第5版，2005?？梢酝ㄟ^藥學(xué)領(lǐng)域熟知的任何方法制備制劑。這樣的方法包括使化合物與由一種或更多輔助成分構(gòu)成的載體結(jié)合的步驟。通常，通過均勻地并且緊密地將化合物和載體(例如，液態(tài)載體、細(xì)分的固體載體等)結(jié)合，并且如有必要，則隨后使產(chǎn)品成形而制備制劑?？梢灾苽渲苿┮蕴峁┛焖倩蚓徛尼尫牛涣⒓?、延遲、定時(shí)或持續(xù)釋放；或它們的組合。制劑可以適宜地為以下的形式：液體、溶液(例如，水性、非水性)、懸浮液(例如，水性、非水性)、乳劑(例如，水包油、油包水)、酏劑、糖漿劑、干藥糖劑、漱口劑、滴劑、片劑(包括，例如，包衣片劑)、顆粒劑、粉劑、含片(losenges)、錠劑、膠囊劑(包括，例如，硬和軟明膠膠囊劑)、扁囊劑、丸劑、安瓿劑、大丸劑、栓劑、陰道栓劑、酊劑、凝膠劑、糊劑、軟膏劑、霜?jiǎng)?、洗劑、油劑、泡沫劑、噴霧劑、液體噴霧或氣霧劑。制劑可適宜地以貼劑、粘附性膏劑、繃帶、敷料等提供，其浸有一種或更多種化合物和可選地一種或多種其他藥學(xué)上可接受的成分的，包括，例如，穿透、滲透和吸收增強(qiáng)劑。制劑還可適宜地以補(bǔ)給器或儲(chǔ)器形式提供。化合物可以溶解于、懸浮于或混合一種或更多其他藥學(xué)上可接受的成分?；衔锟梢灾|(zhì)體或其他微粒存在，其被設(shè)計(jì)以靶向化合物，例如，到血液成分或者一種或更多種器官。適合口服給予(例如，通過攝取)的制劑包括：液體、溶液、(例如，水性、非水性)、懸浮液(例如，水性、非水性)、乳劑(例如，水包油、油包水)、酏劑、糖漿劑、干藥糖劑、片劑、顆粒劑、粉劑、膠囊劑、扁囊劑、丸劑、安瓿劑、大丸劑。適合含服給予的制劑包括：漱口劑、含片、錠劑，以及貼劑、粘附性膏劑、補(bǔ)給器和儲(chǔ)器。含片一般在調(diào)味基質(zhì)(通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠)中包含化合物。錠劑一般在惰性基質(zhì)(如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠)中包含化合物。漱口劑一般在合適的液態(tài)載體中包含化合物。適合舌下給予的制劑包括片劑、含片、錠劑、膠囊和丸劑。適合口腔透黏膜給予的制劑包括：液體、溶液、(例如，水性、非水性)、懸浮液(例如，水性、非水性)、乳劑(例如，水包油、油包水)、漱口劑、含片、錠劑，以及貼劑、粘附性膏劑、補(bǔ)給器和儲(chǔ)器。適合非口腔透黏膜給予的制劑包括：液體、溶液、(例如，水性、非水性)、懸浮液(例如，水性、非水性)、乳劑(例如，水包油、油包水)、栓劑、陰道栓劑、酊劑、凝膠劑、糊劑、軟膏劑、霜?jiǎng)⑾磩?、油劑，以及貼劑、粘附性膏劑、補(bǔ)給器和儲(chǔ)器。適合透皮給予的制劑包括：凝膠劑、糊劑、軟膏劑、霜?jiǎng)?、洗劑、油劑，以及貼劑、粘附性膏劑、繃帶、敷料、補(bǔ)給器和儲(chǔ)器可以通過方便的方式制作片劑，例如，壓制或模制，可選地與一種或更多種輔助成分?？梢酝ㄟ^在合適的機(jī)器中壓縮自由流動(dòng)形式如粉末或顆粒的化合物，可選地與一種或更多以下各項(xiàng)混合來制備壓縮的片劑：粘合劑(例如，聚維酮、明膠、阿拉伯膠、山梨糖醇、黃芪膠、羥基丙基甲基纖維素)；填充劑或稀釋劑(例如，乳糖、微晶纖維素、磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石粉、二氧化硅)；崩解劑(例如，羥基乙酸淀粉鈉、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)；表面活性劑或分散劑或潤濕劑(例如，月桂基硫酸鈉)；防腐劑(例如，對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、山梨酸)；矯味劑、增香劑和增甜劑?？梢酝ㄟ^在合適的機(jī)器中模制用惰性液體稀釋劑潤濕的粉末狀的混合物制作模制的片劑。片劑可以可選地被包覆或刻痕，并且可以被配制來提供其中使用的化合物(例如，不同的比例的羥丙基甲基纖維素)的緩慢或受控釋放以提供所需的釋放曲線。片劑可以可選地提供有涂層，例如，以影響釋放，例如腸溶包衣，以提供在腸部而不是胃釋放。一般由化合物和石蠟或水溶性的軟膏基質(zhì)制備軟膏。一般由化合物和水包油的霜基質(zhì)制備霜?jiǎng)?。如果需要，霜基質(zhì)的水溶相可包括，例如，至少約30％w/w的多元醇，即，具有兩個(gè)或更多個(gè)羥基的醇，如丙二醇、丁烷-1,3-二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇及它們的混合物。局部制劑可以期望地包括通過皮膚或其他受影響區(qū)域增強(qiáng)化合物的吸收或滲透的化合物。這樣的真皮滲透增強(qiáng)劑的實(shí)例包括二甲亞砜和相關(guān)類似物。一般由化合物和油相制備乳劑，其可以可選地僅包含乳化劑(emulsifier)(或者稱為乳化劑(emulgent))，或者其可以包含至少一種乳化劑與脂肪或油或者與脂肪和油兩者的混合物。優(yōu)選地，親水性乳化劑與作為穩(wěn)定劑的親油乳化劑包括在一起。還優(yōu)選包括油和脂肪。一起，一種或多種乳化劑與或不與一種或多種穩(wěn)定劑組成所謂的乳化蠟，并且乳化蠟與油和/或脂肪一起組成所謂的乳化軟膏基質(zhì)，其形成霜?jiǎng)┲苿┑挠托苑稚⑾唷：线m的乳化劑和乳液穩(wěn)定劑包括吐溫(Tween)60、司盤(Span)80、鯨蠟硬脂醇、肉豆蔻醇、單硬脂酸甘油酯和月桂基硫酸鈉。由于化合物在大多可用于藥物乳劑制劑的油中的溶解度可能非常低，所以用于制劑的合適的油或脂肪的選擇基于實(shí)現(xiàn)所需的化妝品的特性。因此霜?jiǎng)?yīng)優(yōu)選為具有合適的稠度(consistency)以避免從管或其他容器中滲漏的非油膩、不染色和可洗的產(chǎn)品?？梢允褂弥辨溁蛑ф湣位螂p鹽基(dibasic)烷基酯如二異己二酸酯、硬脂酸異鯨蠟醇酯、椰油酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸癸酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、棕櫚酸2-乙基己基酯或稱為CrodamolCAP的支鏈酯的共混物，后三者為優(yōu)選的酯。根據(jù)要求的特性，這些可單獨(dú)或組合使用。可選擇地，可以使用高熔點(diǎn)的脂質(zhì)如白軟石蠟和/或液體石蠟或其他礦物油。其中載體為液體的適合鼻內(nèi)給予的制劑，包括，例如，鼻噴霧劑、滴鼻劑，或者通過霧化器的氣溶膠給予，包括化合物的水性或油性溶液。其中載體為固體的適合鼻內(nèi)給予的制劑，包括，例如，表現(xiàn)為具有例如，在約20至約500微米范圍內(nèi)的粒徑的粗糙粉末，其以其中采用鼻吸藥(snuff)的方式，即，通過從持握靠近鼻子的粉末容器中經(jīng)由鼻道迅速吸入的方式給予的那些。適合肺部給予(例如，通過吸入或吹入療法)的制劑包括那些以從加壓包中的氣溶膠噴霧存在的那些，伴隨著合適的推進(jìn)劑如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體的使用。適合眼部給予的制劑包括滴眼劑，其中化合物溶解于或懸浮于合適的載體中，特別是化合物的水性溶劑。適合直腸給予的制劑可以以帶有合適基質(zhì)的栓劑存在，基質(zhì)包括，例如，天然的或硬化的油、蠟、脂肪、半液體或液體多元醇，例如，可可脂或水楊酸酯；或作為用于通過灌腸劑治療的溶液或懸浮液。適合陰道給予的制劑可以以除了化合物外含有如本領(lǐng)域已知的合適的載體的陰道栓劑、棉塞、霜?jiǎng)⒛z劑、糊劑、泡沫劑或噴霧制劑。適合腸胃外給予(例如，通過注射)的制劑，包括水性或非水性的、等滲的、無熱原的、無菌液體(例如，溶液、懸浮液)，其中，化合物是溶解的、懸浮的或以其他方式提供(例如，在脂質(zhì)體或其他微粒中)。這樣的液體可以另外地含有其他藥學(xué)上可接受的成分，如抗氧化劑、緩沖劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、抑菌劑、助懸劑、增稠劑和使制劑與預(yù)期接受者的血液(或其他相關(guān)體液)等滲的溶質(zhì)。賦形劑的實(shí)例包括，例如，水、醇、多元醇、甘油、植物油等。用于在這樣制劑中使用的合適的等滲載體的實(shí)例包括氯化鈉注射液、林格氏(Ringer's)液，或乳酸林格氏注射液。一般而言，液體中化合物的濃度為從約1ng/mL至約10μg/mL，例如從約10ng/mL至約1μg/mL。制劑可存在于單劑量或多劑量密封容器例如安瓿和小瓶中，并且可以存儲(chǔ)于冷凍干燥的(凍干的)條件下，在即將使用前僅需要加入無菌液體載體例如注射用水?？捎蔁o菌粉末、顆粒和片劑制備即用的注射溶液和懸浮液。劑量本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，TFM化合物和包含TFM化合物的組合物的適當(dāng)劑量可以因患者而改變。確定最優(yōu)劑量將通常涉及治療效益水平與任何風(fēng)險(xiǎn)或有害副作用的平衡。選擇的劑量水平將取決于各種因素，包括，但不限于，特定TFM化合物的活性、給予途徑、給予時(shí)間、TFM化合物排泄速度、治療的持久度、其他藥物、組合中使用的化合物和/或材料、病癥的嚴(yán)重程度，以及物種、性別、年齡、體重、條件、一般健康和患者的前藥物史。TFM化合物的量和給予的途徑將最終由醫(yī)生、獸醫(yī)或臨床醫(yī)師確定，盡管通常選擇劑量，以在作用部位達(dá)到實(shí)現(xiàn)所需效果而不引起相當(dāng)程度的傷害或有害副作用的局部濃度。貫穿治療的過程，可以以一個(gè)劑量、連續(xù)或間歇地(例如，在合適的時(shí)間間隔分開的劑量)完成給予。本領(lǐng)域技術(shù)人員已熟知確定給予最有效的方式和劑量的方法，并且其隨用于治療的制劑、治療的目的、待治療的一個(gè)或多個(gè)靶細(xì)胞和待治療的受試者而變化?？梢愿鶕?jù)由治療醫(yī)生、獸醫(yī)或臨床醫(yī)師選擇的劑量水平和模式進(jìn)行單一或多次給予。通常，TFM化合物合適的劑量在約10μg至約250mg(更典型地約100μg至約25mg)每千克受試者體重每天的范圍內(nèi)。當(dāng)其中化合物為鹽、酯、酰胺、前藥等時(shí)，給予的量基于母體化合物計(jì)算，并且因此使用的實(shí)際重量按比例地增加。實(shí)例化學(xué)合成如在此描述的，提供下列實(shí)例僅為闡述本發(fā)明且并不意在限制本發(fā)明的范圍。合成15-[[4-[[(2R)嗎啉-2-基]甲基氨基]-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氨基]吡嗪-2-腈(化合物1)合成1A2-(甲苯磺酰氧基甲基)嗎啉-4-羧酸(R)-叔丁基酯((R)-tert-Butyl2-(tosyloxymethyl)morpholine-4-carboxylate)將三乙胺((15.46mL，110mmol)加入到在二氯甲烷(50.0mL)中的2-(羥甲基)-嗎啉-4-羧酸(R)-叔丁基酯((R)-tert-butyl2-(hydroxymethyl)-morpholine-4-carboxylate)(21.73g，100mmol)中以得到用無色溶液，其用冰浴冷卻。在保持低于3℃的內(nèi)部溫度下，將4-甲苯磺酰氯(20.02g，105mmol)分小部分地加入。在真空濃縮前，漿料在室溫下攪拌21小時(shí)。將粗物質(zhì)溶解于乙酸乙酯(750mL)，用水(450mL)、鹽水(200mL)洗滌并用硫酸鎂干燥。過濾和在真空中去除揮發(fā)物后，加入己烷(150mL)并將得到的白色沉淀過濾、用己烷(300mL)洗滌、并干燥以得到標(biāo)題化合物，為白色粉末(35.66g，96％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ1.46(9H,s),2.46(3H,s),2.62-2.73(1H,m),2.85-2.94(1H,m),3.44-3.49(1H,m),3.58-3.63(1H,m),3.77-3.94(3H,m),3.99-4.06(2H,m),7.36(2H,d,J＝8.5Hz),7.80(2H,d,J＝8.5Hz).LC-MS(Agilent4min)Rt2.90min；m/z(ESI)372[M+H+]。合成1B2-((2-氯-5(三氟甲基)吡啶-4-基氨基)甲基)嗎啉-4-羧酸(S)-叔丁基酯((S)-tert-Butyl2-((2-chloro-5-(trifluoromethyl)pyridin-4-ylamino)methyl)morpholine-4-carboxylate)在室溫下向2-氯-5(三氟甲基)吡啶-4-胺(2.9g，14.75mmol)在二甲基甲酰胺(95mL)中的溶液中分批加入氫化鈉(在油中60wt％；1.180g，29.5mmol)，并且在80℃攪拌混合物10分鐘。分批加入2-(甲苯磺酰氧基甲基)嗎啉-4-羧酸(R)-叔丁基酯并且在80℃攪拌反應(yīng)混合物2.5小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻并倒入飽和碳酸氫鈉水溶液(100mL)，用水(250mL)稀釋并用乙酸乙酯(100mL)萃取。分成兩層后，進(jìn)一步用乙酸乙酯(2x100mL)萃取水層。合并的有機(jī)層用鹽水(4x100mL)洗滌、硫酸鎂干燥、過濾、濃縮并在真空下完全地干燥。用柱色譜法純化粗物質(zhì)，首先用在二氯甲烷中的2.5％乙醚/2.5％乙酸乙酯洗脫，然后用二氯甲烷中的20％乙醚洗脫，同時(shí)所需產(chǎn)物從柱中洗脫出來。合并并濃縮適當(dāng)?shù)募?jí)分以得到標(biāo)題化合物，為灰白色粉末(4.51g，77％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ1.49(9H,s),2.70-2.84(1H,m),2.92-3.05(1H,m),3.18-3.23(1H,m),3.33-3.37(1H,m),3.55-3.61(1H,m),3.66-3.71(1H,m),3.80-4.07(3H,m),5.32(1H,寬s),6.61(1H,s),8.24(1H,s).LC-MS(Agilent4min)Rt3.04min；m/z(ESI)396[MH+]。合成1C2-((2-(5-氰基吡嗪-2-基氨基)-5-(三氟甲基)吡啶-4-基氨基)甲基)嗎啉-4-羧酸(S)-叔丁基酯((S)-tert-Butyl2-((2-(5-cyanopyrazin-2-ylamino)-5-(trifluoromethyl)pyridin-4-ylamino)methyl)morpholine-4-carboxylate)2-((2-氯-5-(三氟甲基)吡啶-4-基氨基)甲基)嗎啉-4-羧酸(S)-叔丁基酯(4.67g，11.8mmol)，2-氨基-5-氰基吡嗪(1.98g，16.5mmol)，三(二亞芐基丙酮)二鈀(0)(tris(dibenzylideneacetone)dipalladium(0))(0.86g，0.94mmol)，外消旋-2,2'-雙(二苯基膦)-1,1'-聯(lián)萘(0.54g，0.87mmol)和碳酸銫(7.69g，23.6mmol)，在氬氣下懸浮于無水二噁烷(108mL)中。氬氣鼓泡通過混合物30分鐘，之后懸浮液加熱至100℃持續(xù)29小時(shí)。冷卻反應(yīng)混合物并用二氯甲烷稀釋，然后吸收到硅膠上。將預(yù)吸收的硅膠加入到用在己烷中的20％乙酸乙酯平衡過的340gKP-SilSNAP柱中。柱色譜法，用在己烷中的20-35％乙酸乙酯梯度洗脫，得到部分純化的物質(zhì)，為橙色膠狀物。進(jìn)一步用柱色譜法純化，用在二氯甲烷中的20％乙酸乙酯洗脫，以得到標(biāo)題化合物，為淡褐色粉末(3.28g，58％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ1.49(9H,s),2.73-2.86(1H,m),2.94-3.07(1H,m),3.26-3.31(1H,m),3.38-3.43(1H,m),3.57-3.61(1H,m),3.70-3.75(1H,m),3.83-4.08(3H,m),5.31(1H,寬s),7.12(1H,s),8.13(1H,s),8.23(1H,s),8.57(1H,s),8.87(1H,s).LC-MS(Agilent4min)Rt2.90min；m/z(ESI)480[MH+]。合成1D5-[[4-[[(2R)-嗎啉-2-基]甲基氨基]-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氨基]吡嗪-2-腈(化合物1)二氯甲烷(8mL)中的2-((2-(5-氰基吡嗪-2-基氨基)-5-(三氟甲基)吡啶-4-基氨基)甲基)嗎啉-4-羧酸(S)-叔丁基酯(1.09g，2.273mmol)溶液在室溫下超過10分鐘逐滴地加入到在干燥的二氯甲烷(227mL)中的三氟乙酸(52.7mL，709mmol)和三異丙基硅烷(2.61mL，12.73mmol)的溶液中。攪拌30分鐘后，在真空中濃縮混合物。濃縮物重懸浮于二氯甲烷(200mL)中并在真空中濃縮，然后重懸浮于甲苯(100mL)中并濃縮。上述程序一式三份進(jìn)行，(每次以1.09g2-((2-(5-氰基吡嗪-2-基氨基)-5-(三氟甲基)吡啶-4-基氨基)甲基)嗎啉-4-羧酸(S)-叔丁基酯開始)并且合并這樣產(chǎn)生的三部分粗產(chǎn)物用于通過離子交換色譜法、在2x20gBiotageNH2Isolute柱上、用甲醇洗脫純化。將洗脫液濃縮，并加入在乙醚(25mL)中的10％甲醇。將得到的固體過濾、用乙醚(30mL)洗滌，并在真空中干燥，以得到標(biāo)題化合物，為淺稻草色粉末(2.30g，89％)。1HNMR(500MHz,CD3OD)δ2.62(1H,J＝12,10Hz),2.78-2.84(2H,m),2.95(1H,dd,J＝12,2Hz),3.27-3.38(2H,m),3.63(1H,ddd,J＝14,9.5,3Hz),3.73-3.78(1H,m),3.91(1H,ddd,J＝11,4,2Hz),7.26(1H,s),8.18(1H,s),8.63(1H,s),9.01(1H,s).LC-MS(Agilent4min)Rt1.22min；m/z(ESI)380[M+H+]。旋光度[α]D24＝+7.0(c1.0,DMF)。合成25-[[4-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基氨基]-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氨基]吡嗪-2-腈(化合物2)合成2A2-(甲苯磺酰氧基甲基)嗎啉-4-羧酸(S)-叔丁基酯將三乙胺(6.05mL，43.0mmol)加入在二氯甲烷(19.56mL)中的2-(羥甲基)-嗎啉-4-羧酸(S)-叔丁基酯(8.5g，39.1mmol)中，以得到無色溶液。在0℃下4-甲苯磺酰氯(7.83g，41.1mmol)分成小份地加入。反應(yīng)在室溫下攪拌18小時(shí)，之后在減壓下蒸發(fā)濃縮。濃縮物溶解于乙酸乙酯(300mL)，并且得到的溶液用水(150mL)、鹽水(150mL)洗滌、硫酸鎂干燥、過濾并在減壓下蒸發(fā)濃縮。向濃縮物中加入己烷，并且在真空下除去揮發(fā)物，以得到標(biāo)題化合物，為白色粉末(14.46g，99％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ1.46(9H,s),2.46(3H,s),2.61-2.75(1H,m),2.85-2.94(1H,m),3.43-3.49(1H,m),3.58-3.63(1H,m),3.76-3.93(3H,m),3.99-4.06(2H,m),7.35(2H,d,J＝8.5Hz),7.80(2H,d,J＝8.5Hz).LC-MS(Agilent4min)Rt2.94min；m/z(ESI)394[M+Na+]。合成2B2-((2-氯-5(三氟甲基)吡啶-4-基氨基)甲基)嗎啉-4-羧酸(R)-叔丁基酯在室溫下向在二甲基甲酰胺(32.6mL)中的2-氯-5(三氟甲基)吡啶-4-胺(1g，5.09mmol)溶液中分批加入氫化鈉(在油中60wt％；0.407g，10.18mmol)，隨后在80℃攪拌10分鐘。然后分批加入2-(甲苯磺酰氧基甲基)嗎啉-4-羧酸(S)-叔丁基酯(2.268g，6.11mmol)，且反應(yīng)混合物在80℃攪拌2.5小時(shí)。冷卻后，混合物分段于飽和碳酸氫鈉水溶液(30mL)、水(100mL)和乙酸乙酯(30mL)。分離有機(jī)層，且水層進(jìn)一步用乙酸乙酯(2x30mL)萃取。合并的有機(jī)層用鹽水(2x70mL)洗滌、硫酸鎂干燥、過濾、濃縮并在真空下完全地干燥。粗物質(zhì)在90gThomsonSingleStep柱上用柱色譜法純化，以在二氯甲烷中的2.5％乙醚/2.5％乙酸乙酯的等度(isocratic)混合物洗脫，以得到標(biāo)題化合物，為清澈的膠狀物，重結(jié)晶后，以得到白色粉末(1.47g,73％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ1.48(9H,s),2.71-2.83(1H,m),2.92-3.05(1H,m),3.18-3.23(1H,m),3.33-3.37(1H,m),3.56-3.61(1H,m),3.66-3.71(1H,m),3.80-4.07(3H,m),5.32(1H,寬s),6.61(1H,s),8.24(1H,s).LC-MS(Agilent4min)Rt3.04min；m/z(ESI)396[MH+]。合成2C2-((2-(5-氰基吡嗪-2-基氨基)-5-(三氟甲基)吡啶-4-基氨基)甲基)嗎啉-4-羧酸(R)-叔丁基酯2-((2-氯-5(三氟甲基)吡啶-4-基氨基)甲基)嗎啉-4-羧酸(R)-叔丁基酯(1.44g，3.64mmol)，2-氨基-5-氰基吡嗪(0.612g，5.09mmol，1.4eq.)，三(二亞芐基丙酮)二鈀(0)(0.267g，0.291mmol，0.08eq.)，外消旋-2,2'-雙(二苯基膦)-1,1'-聯(lián)萘(0.362g，0.582mmol，0.16eq.)和碳酸銫(2.37g，7.28mmol)在氬氣下懸浮于無水二噁烷(33mL)中。氬氣鼓泡通過混合物30分鐘，之后懸浮液加熱至100℃持續(xù)22小時(shí)。冷卻反應(yīng)混合物并用二氯甲烷稀釋，然后吸收到硅膠上。預(yù)吸收的硅膠加入到用在己烷中的20-50％乙酸乙酯洗脫的100gKP-SilSNAP柱中，以得到部分純化產(chǎn)物，為橙色膠狀物。粗產(chǎn)物溶解于二氯甲烷并通過柱色譜法、在90gSingleStepThomson柱上、用在二氯甲烷中的20％乙酸乙酯洗脫純化，以得到標(biāo)題化合物(1.19g，68％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ1.50(9H,s),2.71-2.88(1H,m),2.93-3.08(1H,m),3.27-3.32(1H,m),3.40-3.44(1H,m),3.55-3.64(1H,m),3.71-3.77(1H,m),3.82-4.11(3H,m),5.33(1H,寬s),7.19(1H,s),8.23(1H,s),8.58(1H,s),8.84(1H,s).LC-MS(Agilent4min)Rt2.93min；m/z(ESI)480[MH+]。合成2D5-[[4-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基氨基]-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氨基]吡嗪-2-腈(化合物2)二氯甲烷(8mL)中的2-((2-(5-氰基吡嗪-2-基氨基)-5-(三氟甲基)吡啶-4-基氨基)甲基)嗎啉-4-羧酸(R)-叔丁基酯(1.19g，2.48mmol)溶液在室溫下超過10分鐘逐滴地加入到在干燥的二氯甲烷(248mL)中的三氟乙酸(57.5mL，774mmol)和三異丙基硅烷(2.85mL，13.90mmol)溶液中。攪拌30分鐘后，在真空中濃縮混合物。濃縮物重懸浮于二氯甲烷(200mL)中并在真空中濃縮，然后重懸浮于甲苯(100mL)中并在真空中濃縮。粗物質(zhì)通過離子交換色譜法、在20gBiotageNH2Isolute柱上、用甲醇洗脫純化。將洗脫液濃縮，并加入在乙醚(8mL)中的10％甲醇。將固體過濾、用乙醚(20mL)洗滌，并在真空中干燥，以得到標(biāo)題化合物，為淺稻草色粉末(0.604g，64％產(chǎn)率)。1HNMR(500MHz,CD3OD)δ2.62(1H,J＝12,10Hz),2.78-2.84(2H,m),2.95(1H,dd,J＝12,2Hz),3.27-3.38(2H,m),3.63(1H,ddd,J＝14,9.5,3Hz),3.73-3.78(1H,m),3.91(1H,ddd,J＝11,4,2Hz),7.26(1H,s),8.18(1H,s),8.63(1H,s),9.01(1H,s).LC-MS(Agilent4min)Rt1.26min；m/z(ESI)380[M+H+]。旋光度[α]D24＝-6.9(c1.0,DMF)。生物學(xué)方法分析1：在Caliper分析形式中測(cè)定抑制劑藥效與CHK1在微流體分析中測(cè)定CHK1激酶活性，該分析監(jiān)控磷酸化產(chǎn)物與其底物的分離。該分析在EZReaderII(CaliperLifeSciences有限公司，Runcorn，英國)上運(yùn)行，其采用含有CR-8(500nM，#760278，CaliperLS)的分離緩沖液(#760367CaliperLS)。使用550(Labcyte公司TM)聲學(xué)分配器以直接在384聚丙烯分析板(GreinerBio-One，Gloucestershire，英國)里產(chǎn)生重復(fù)的8pt稀釋曲線。對(duì)每個(gè)試驗(yàn)化合物，采用在100％DMSO中的50μM儲(chǔ)備液(stock)濃度。每孔分配的DMSO總量為250nL，以得到2.5％DMSO的最終分析濃度和在0.5-1000nM范圍內(nèi)的測(cè)試化合物濃度。將均稀釋在激酶緩沖液(HEPES50mM，NaN30.02％，BSA0.01％，原釩酸鈉0.1mM，DTT1mM，MgCl22mM，Tween200.1％)中的以下物質(zhì)加入到該分析板上：6μLCHK1(2nM最終濃度，內(nèi)部(in-house)蛋白質(zhì)制備)，2μL肽10(5-FAM-KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR-COOH，1.5μM最終濃度，#760354CaliperLS)和2μLATP(90μM最終濃度)。在室溫下溫育一個(gè)小時(shí)前，密封并離心測(cè)試板(1分鐘，1000rpm)。通過加入分離緩沖液(90μL)停止反應(yīng)。在EZReaderII上讀取該測(cè)試板，采用帶有1.5psi和1750ΔV的儀器設(shè)置的12-吸管芯片(760137-0372R,CaliperLS)。自動(dòng)產(chǎn)生從底物的產(chǎn)物的百分濃度且相對(duì)于空白孔(不含酶和2.5％DMSO)和總孔(含全部試劑和2.5％DMSO)計(jì)算百分抑制。在GraphPadPrism5中采用對(duì)數(shù)(抑制劑濃度)對(duì)關(guān)于可變斜率公式的響應(yīng)的非線性回歸擬合計(jì)算CHK1IC50值。分析2：在有絲分裂抑制分析(MIA)中的細(xì)胞的藥效通過CHK1激酶功能抑制劑與基因毒性劑結(jié)合評(píng)估檢測(cè)點(diǎn)去除，其采用基于銪的ELISA分析，該分析被設(shè)計(jì)用以量化用基因毒性劑治療(以誘發(fā)G2停滯)后，隨后CHK1抑制劑測(cè)試化合物與諾考達(dá)唑組合以去除該停滯，截留在有絲分裂中的細(xì)胞數(shù)量。以每孔104細(xì)胞以160μL的體積將HT29細(xì)胞接種于96-孔板并使其附著36小時(shí)。依托泊苷(在DMSO中的10mM儲(chǔ)備液)在培養(yǎng)基中稀釋至250μM，然后取40μL加入到適當(dāng)?shù)目字?，以得?0μM的最終濃度并溫育1小時(shí)。該治療之前已進(jìn)行最優(yōu)化以誘導(dǎo)在治療后16小時(shí)80％細(xì)胞的G2停滯。在基因毒性藥物暴露后，去除培養(yǎng)基，并用新培養(yǎng)基替換(160μL)。細(xì)胞未處理(未處理對(duì)照組或依托泊苷單獨(dú)預(yù)處理)，依托泊苷預(yù)處理后暴露于諾考達(dá)唑或僅諾考達(dá)唑(100ng/mL最終濃度)，或者暴露于與諾考達(dá)唑(100ng/mL最終濃度)組合的升高濃度的測(cè)試化合物(從0.01nM至200μM最終濃度)。每個(gè)濃度采用一式四份孔，CHK1抑制劑測(cè)試化合物加入在40μL等分試樣中。21小時(shí)暴露后，除去培養(yǎng)基，并且將細(xì)胞在4％甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水中(PBS，pH7.4，預(yù)冷卻至4℃)在4℃固定30分鐘，隨后在環(huán)境溫度下，100％甲醇(預(yù)冷卻至-20℃)固定10分鐘?？子肞BS洗滌并用在三元緩沖鹽水(TBS，pH7.4)中的5％干奶粉(Marvel)在37℃下封閉30分鐘。每孔用含有0.1％Tween20的水洗滌三遍。將初級(jí)抗體(MPM-2，Upstatecat#05-368，TBS中的5％奶粉中的1μg/mL)加入到每孔，并在4℃下震蕩溫育過夜。除去初級(jí)抗體，且孔用含0.1％Tween20的水洗滌。將二級(jí)抗體(銪標(biāo)記的抗小鼠，Perkin-Elmercat#AD0124，在分析緩沖液Perkin-Elmercat#1244-111中，333ng/mL)加入到每孔，并在37℃下溫育1小時(shí)。每孔用含0.1％Tween20的水洗滌，并用增強(qiáng)溶液(Perkin-Elmercat#1244-105)處理。在Wallac，Victor2計(jì)數(shù)器(Perkin-Elmer，BucksUK)上計(jì)數(shù)銪發(fā)射。適當(dāng)?shù)膶?duì)照組包括在內(nèi)，且結(jié)果表達(dá)為允許50％的細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂需要的CHK1抑制劑測(cè)試化合物的濃度(MIAIC50)。分析3：CHK1依賴的細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)去除對(duì)細(xì)胞毒性在細(xì)胞中選擇性的評(píng)估采用96小時(shí)磺基羅丹明B分析(SRB，Sigma目錄號(hào)S9012)評(píng)估化合物細(xì)胞毒性。以1.6至3.2x103細(xì)胞每孔以160μL培養(yǎng)基的體積將HT29或SW620細(xì)胞接種于96孔板中，并在處理前允許附著36小時(shí)。對(duì)于CHK1抑制劑(DMSO中的10mM儲(chǔ)備液)的細(xì)胞毒性分析，化合物從250μM的起始濃度連續(xù)地稀釋在培養(yǎng)基中，然后將40μL加入到適當(dāng)?shù)目字校皇剿姆?，以得?0至0.1μM的最終濃度范圍(10個(gè)濃度)。對(duì)于基因毒性藥劑，化合物(SN38，LKT實(shí)驗(yàn)室目錄號(hào)C0154和吉西他濱，Lilly“Gemzar”，在DMSO中的10mM儲(chǔ)備液)從2μM的起始濃度連續(xù)地稀釋在培養(yǎng)基中，并且40μL加入到適當(dāng)?shù)目字?，一式四份，以得?00至0.39μM的最終濃度(10個(gè)濃度)。在加濕的5％CO2環(huán)境中，細(xì)胞在37℃下溫育96小時(shí)(四倍)，然后固定，并用SRB染色。適當(dāng)?shù)膶?duì)照組包括在內(nèi)且結(jié)果表達(dá)為相對(duì)于未處理的對(duì)照組抑制細(xì)胞生長50％需要的測(cè)試化合物的濃度(SRBIC50)?；钚灾笖?shù)(AI)，影響CHK1依賴的細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)去除對(duì)細(xì)胞毒性的CHK1抑制劑測(cè)試化合物的選擇性的測(cè)量結(jié)果是從CHK1抑制劑毒性IC50對(duì)MIAIC50的比值計(jì)算(即，AI＝CHK1抑制劑SRBIC50/MIAIC50)的，都在HT29細(xì)胞中測(cè)量。分析4：在HT29或SW620結(jié)腸癌細(xì)胞與SN38或吉西他濱組合中細(xì)胞的效力采用96小時(shí)磺基羅丹明B分析法(SRB，Sigmacat#S9012)評(píng)估CHK1抑制劑化合物增強(qiáng)SN38(拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑伊立替康的活性代謝物)和吉西他濱(抗代謝物)細(xì)胞毒性的能力。HT29或SW620細(xì)胞以1.6至3.2x103細(xì)胞每孔接種于在160μL體積的培養(yǎng)基中的96孔板中，并在處理前允許附著36小時(shí)。增強(qiáng)分析涉及將在20μL體積的培養(yǎng)基中的吉西他濱或SN38(采用上述分析3中的方法確定的)的固定的SRBIC50濃度添加到每孔(10x最終濃度)，一式四份，和混合1分鐘。CHK1抑制劑測(cè)試化合物(10mM儲(chǔ)備液)從50μM的起始濃度連續(xù)稀釋在培養(yǎng)基中，并且取20μL加入到每孔，一式四份，以得到5至0.39μM的范圍(8個(gè)濃度)的最終濃度，并在固定和SRB染色之前，在37℃的加濕處理環(huán)境中在37℃溫育96小時(shí)(四倍)之前，混合1分鐘。未處理的和僅基因毒性處理對(duì)照組包括在內(nèi)，且結(jié)果表達(dá)為抑制細(xì)胞生長50％需要的CHK1抑制劑的濃度(增強(qiáng)IC50)。增強(qiáng)指數(shù)(PI)計(jì)算為CHK1抑制劑增強(qiáng)SN38或吉西他濱細(xì)胞毒性的能力的測(cè)定結(jié)果，并且限定為僅CHK1抑制劑的細(xì)胞毒性IC50與結(jié)合了基因毒性的CHK1抑制劑的增強(qiáng)IC50的比值(即，PI＝CHK1抑制劑SRBIC50/增強(qiáng)IC50)。分析5：小鼠中的口服生物利用度和藥代動(dòng)力學(xué)按照動(dòng)物(科學(xué)程序)法案1986下的內(nèi)政部法規(guī)(theHomeOfficeregulationsundertheAnimals(ScientificProcedures)Act1986)，并根據(jù)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的UKCCCR準(zhǔn)則進(jìn)行所有的工作。CHK1抑制劑化合物配制于10％DMSO、1％Tween20和89％無菌生理鹽水中。雌性BALB/c小鼠(CharlesRiverUKLtd，Margate，英國)靜脈內(nèi)(iv)和口服(po)給予10mg/kg的CHK1抑制劑化合物。對(duì)照組動(dòng)物僅接受賦形劑(媒介物，vehicle)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)注射3只小鼠的組。在給藥后5、15和30分鐘以及1、2、4、6和24小時(shí)，用肝素化注射器通過心臟刺穿從麻醉狀態(tài)下(氟烷/氧氣混合)的小鼠收集血液。離心(9000xg，2分鐘，4℃)后，血漿在干冰上冷凍并貯存在-80℃下。切下組織，迅速冷凍于液氮中，并貯存在-80℃下。解凍后的血漿樣品用3倍體積的含有內(nèi)標(biāo)甲醇通過蛋白沉淀萃取。通過扣除空白血漿基質(zhì)與CHK1抑制劑化合物并按每測(cè)試樣品提取制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)(血漿中2至10000nM)和QC。離心后，轉(zhuǎn)移上清液用于分析。在耦合到Agilent6410三重四極質(zhì)譜的Agilent1200或1290LC上通過LC-MS-MS分析提取的血漿樣品用于CHK1抑制劑化合物和內(nèi)標(biāo)物的定量。化合物在維持在55℃的PhenomenexKinetexC18分析柱(50x2.1mm,2.6μm)上分離。采用7分鐘梯度分離分析物。采用在陽離子模式下電噴霧電離，且化合物通過MRM檢測(cè)，MRM帶有適當(dāng)?shù)倪^渡監(jiān)控的(例如對(duì)化合物為380.2至320.3)，與碰撞電壓154V和碰撞能量20V。用PharsightWinNonlin軟件(版本5.2.1)進(jìn)行非房室藥代動(dòng)力學(xué)分析(模式200和201)。生物學(xué)數(shù)據(jù)采用上述描述的分析獲得的化合物1和化合物2的數(shù)據(jù)，概括于下列的表中。化合物1和2的CHK1IC50數(shù)據(jù)(通過上述分析1獲得)與在Collins等人，2009a中示出的16種類似的化合物獲得的對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)(采用如Collins等人，2009a中描述的DELFIA分析獲得)的比較提供于下表。對(duì)化合物1和2的CHK1細(xì)胞藥效MIA數(shù)據(jù)(通過上述分析2獲得)與在Collins等人，2009a中示出的16種類似的化合物獲得的對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)的比較提供于下表。很清楚，化合物1和2具有突出的CHK1細(xì)胞藥效(MIA分析)。對(duì)于抑制CHK1的高的細(xì)胞藥效對(duì)于CHK1抑制劑的開發(fā)至關(guān)重要。對(duì)于CHK1介導(dǎo)的效果，化合物1和2比所有的16種化合物具有相當(dāng)更高的細(xì)胞藥效，并且分別比其次最有效的化合物(Y-154)更有效約為3倍和5倍。對(duì)化合物1和2的細(xì)胞選擇性數(shù)據(jù)(通過上述分析3獲得)與在Collins等人，2009a中示出的16種類似的化合物獲得的對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)的比較提供于下表。很清楚，化合物1和2具有突出的細(xì)胞選擇性，測(cè)定為在生長抑制分析中CHK1細(xì)胞藥效(MIA分析)與非特異性的細(xì)胞毒性的之間的比率。與非特異性的細(xì)胞毒性相對(duì)，對(duì)于CHK1介導(dǎo)的效果的細(xì)胞的選擇性對(duì)于CHK1抑制劑的開發(fā)是重要的，以使治療窗口最大化?；衔?和2分別約為26倍選擇性的和150倍選擇性的，而其次最具選擇性的化合物僅約為11倍選擇性的(Y-155)。對(duì)化合物1和2的細(xì)胞效力數(shù)據(jù)(通過上述分析4獲得)與在Collins等人，2009a中示出的16種類似的化合物獲得的對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)的比較提供于下表。很明顯，化合物1和2具有突出的細(xì)胞效力，測(cè)定為使細(xì)胞對(duì)兩種代表性的基因毒性治療藥劑：SN38和吉西他濱敏感的能力。>1的值對(duì)可開發(fā)的化合物是必不可少的(否則化合物對(duì)降低基因毒性療法的效果起作用)?；衔?具有對(duì)SN38幾乎最高的增強(qiáng)(大約1.8倍)和對(duì)吉西他濱最高的增強(qiáng)(大學(xué)17倍)，表明了強(qiáng)大的療效。對(duì)SN38最增強(qiáng)的化合物為Y-150(大約2倍)，其對(duì)吉西他濱具有僅約4.8倍增強(qiáng)。對(duì)于吉西他濱，其次最增強(qiáng)的化合物為Y-153(大約8.6倍)，其對(duì)SN38沒有增強(qiáng)(即，大約1倍)。此外，在小鼠中化合物1具有突出的口服生物利用度：100％(在上表中報(bào)道為105％)。***上述描述了原理、優(yōu)選的實(shí)施方式和操作本發(fā)明的模式。但是，本發(fā)明不應(yīng)解釋為局限于討論的特定的實(shí)施方式。反而，上述描述的實(shí)施方式應(yīng)被視為用作說明的，而不是限制的，并且應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可不偏離本發(fā)明的范圍在那些實(shí)施方式中做變體。參考文獻(xiàn)在此引用了許多出版物以更全面地描述和公開本發(fā)明以及本發(fā)明涉及的現(xiàn)有技術(shù)的狀況。對(duì)這些出版物的全引用提供于下。這些出版物的每一個(gè)都以其全部內(nèi)容包括在此本公開內(nèi)以供參考，如同各個(gè)出版物以相同程度明確且單獨(dú)地指明通過引用被并入。Almeidaetal.,2008,“Pyrazolyl-amino-substitutedpyrazinesandtheiruseforthetreatmentofcancer”,international(PCT)patentpublicationnumberWO2008/117050A1published02October2008.BalaintandVousden,2001,“Activationandactivitiesofthep53tumoursuppressorprotein,”Br.J.Cancer,Vol.85,pp.1813-1823.BartekandLukas,2003,“Chk1andChk2kinasesincheckpointcontrolandcancer,”CancerCell,Vol.3,pp.421-429.Brooksetal.,2012,“Apotentchk1inhibitorisselectivelytoxicinmelanomaswithhighlevelsofreplicativestress,”O(jiān)ncogene,doi:10.1038/onc.2012.72.CarsonandLois,1995,“Cancerprogressionandp53,”Lancet,Vol.346,pp.1009-1011.Cavelieretal.,2009,“ConstitutiveactivationoftheDNAdamagesignalingpathwayinacutemyeloidleukemiawithcomplexkaryotype:Potentialimportanceforcheckpointtargetingtherapy,”CancerRes.,Vol.69,pp.8652-8661.Coleetal.,2011“RNAiscreenoftheproteinkinomeidentifiescheckpointkinase1(chk1)asatherapeutictargetinneuroblastoma,”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.108,pp.3336-3341.Collinsetal.,2009a,“Pyrazin-2-yl-2-yl-amineandpyrazin-2-yl-pyrimidin-4-yl-aminecompoundsandtheiruse”,international(PCT)patentpublicationnumberWO2009/044162A1published09April2009.Collinsetal.,2009b,“Bicyclylaryl-aryl-aminecompoundsandtheiruse”,international(PCT)patentpublicationnumberWO2009/103966A1published27August2009.Daviesetal.,2011,“Single-agentinhibitionofchk1isantiproliferativeinhumancancercelllinesinvitroandinhibitstumorxenograftgrowthinvivo,”O(jiān)ncol.Res.,Vol.19,pp.349-36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