本發(fā)明屬于真菌培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種三孢布拉霉菌的篩選培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：番茄紅素是植物中所含的一種天然色素，主要存在于茄科植物西紅柿的成熟果實(shí)中。是許多類胡蘿卜素生物合成的中間體。其抗氧化性能在所有類胡蘿卜素中是最強(qiáng)的，它清除單線態(tài)氧的能力是常用抗氧化劑維生素E的100倍，是β-胡蘿卜素的2倍以上；番茄紅素具有優(yōu)越的生理功能，它不僅具有抗癌抑癌的功效，而且對(duì)于預(yù)防心血管疾病、動(dòng)脈硬化等各種成人病、增強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)以及延緩衰老等都具有重要意義，是一種很有發(fā)展前途的新型功能性天然色素。三孢布拉霉Blakesleatrispora是笄霉菌科（Choanephoraceae），毛霉菌目（Mucorales），接合菌門（Zygomycota），真菌界（Fungi），是雌雄異株，有正負(fù)菌之分。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，將三孢布拉霉正菌、負(fù)菌單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，能產(chǎn)生無性孢子和少量的類胡蘿卜素，而將正負(fù)菌混合培養(yǎng)時(shí)能大大提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量。利用三孢布拉霉菌生產(chǎn)的番茄紅素已經(jīng)在國(guó)際市場(chǎng)作為一種新型的食品添加劑使用。但現(xiàn)有的培養(yǎng)基培養(yǎng)在篩選三孢布拉霉高產(chǎn)菌株時(shí)，呈蔓延生長(zhǎng)狀態(tài)，生產(chǎn)過于旺盛，難以將單個(gè)孢子形成的菌落分隔開，給挑選單菌落的菌株帶來困難，難獲取高產(chǎn)番茄紅素的三孢布拉霉菌株，導(dǎo)致發(fā)酵生產(chǎn)過程番茄紅素低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的發(fā)明目標(biāo)是針對(duì)上述不足，提供一種得到獨(dú)立的單菌落，快速、準(zhǔn)確的篩選出三孢布拉霉高產(chǎn)菌株的培養(yǎng)基。本發(fā)明的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種高產(chǎn)番茄紅素的三孢布拉霉菌的篩選培養(yǎng)基，包含葡糖糖、土豆、瓊脂、水，其特征是添加去氧膽酸鈉，葡糖糖、土豆、去氧膽酸鈉、瓊脂、水的質(zhì)量百分比為：葡糖糖2.0～2.5%，土豆20～25%，去氧膽酸鈉0.05%～0.06%，瓊脂2.0～2.5%，其余為水。本發(fā)明加入了去氧膽酸鈉后，有效地防止了霉菌菌絲蔓延，抑制革蘭氏陽性菌的生長(zhǎng)，在培養(yǎng)篩種過程中有助于得到獨(dú)立的單菌落，篩選出有高產(chǎn)的三孢布拉霉菌。實(shí)驗(yàn)1以配制500ml的培養(yǎng)基為例：按比例大致取土豆，去皮切塊（約3cm×3cm×1cm），再準(zhǔn)確稱量200g，沸煮30分鐘，過濾，加入準(zhǔn)確量取的葡糖糖10g、去氧膽酸鈉0.25g，瓊脂4g，充分混勻，加水定容，裝瓶，封口，高溫121℃滅菌20-30分鐘。取出降溫至徒手可承受的溫度，將其倒入已滅菌平板，靜置，冷卻。接種2ml孢子濃度為10-5的三孢布拉霉菌接種液。共計(jì)接種平板10皿，接種后在27℃培養(yǎng)7天。每天觀察，記錄菌落初出時(shí)間、單菌落數(shù)量、菌落直徑、菌落顏色，并統(tǒng)計(jì)所有平板內(nèi)細(xì)菌的污染數(shù)量（細(xì)菌菌落數(shù)量）。具體結(jié)果如下：表1：天數(shù)單菌落數(shù)(個(gè))菌落平均直徑（mm）菌絲狀態(tài)菌落顏色細(xì)菌菌落數(shù)（個(gè)）10//020//03233.5±0.45白色04696±0.4白色，略顯淺黃05757±0.2菌絲均勻，菌絲淺黃，有少數(shù)黑色孢子出現(xiàn)06799±0.33菌絲均勻，菌絲淺黃，黑色孢子增多078211±0.2菌絲均勻，菌絲淺黃，黑色孢子較多0實(shí)驗(yàn)2以配制500ml的培養(yǎng)基為例：按比例大致取土豆，去皮切塊（約3cm×3cm×1cm），再準(zhǔn)確稱量200g，沸煮30分鐘，過濾，加入準(zhǔn)確量取的葡糖糖10g，瓊脂4g，充分混勻，加水定容，裝瓶，封口，高溫121℃滅菌20-30分鐘。取出降溫至徒手可承受的溫度，將其倒入已滅菌平板，靜置，冷卻。接種2ml孢子濃度為10-5的三孢布拉霉菌接種液。共計(jì)接種平板10皿，接種后在27℃培養(yǎng)7天。每天觀察，記錄菌落初出時(shí)間、單菌落數(shù)量、菌落直徑、菌落顏色，并統(tǒng)計(jì)所有平板內(nèi)細(xì)菌的污染數(shù)量（細(xì)菌菌落數(shù)量）。具體結(jié)果如下：表2：實(shí)驗(yàn)3以配制500ml的培養(yǎng)基為例：按比例大致取土豆，去皮切塊（約3cm×3cm×1cm），再準(zhǔn)確稱量200g，沸煮30分鐘，過濾，加入準(zhǔn)確量取的葡糖糖10g、去氧膽酸鈉0.1g，瓊脂4g，充分混勻，加水定容，裝瓶，封口，高溫121℃滅菌20-30分鐘取出降溫至徒手可承受的溫度，將其倒入已滅菌平板，靜置，冷卻。接種2ml孢子濃度為10-5的三孢布拉霉菌接種液。共計(jì)接種平板10皿，接種后在27℃培養(yǎng)7天。每天觀察，記錄菌落初出時(shí)間、單菌落數(shù)量、菌落直徑、菌落顏色，并統(tǒng)計(jì)所有平板內(nèi)細(xì)菌的污染數(shù)量（細(xì)菌菌落數(shù)量）。具體結(jié)果如下：表3比較實(shí)驗(yàn)1和2，實(shí)驗(yàn)2中不加去氧膽酸鈉，結(jié)果顯示：三孢布拉霉菌菌絲較容易蔓延，單菌落在5天時(shí)連成整體，不利于選種過程中單菌落的挑選，由此可能會(huì)影響篩選得到最優(yōu)菌株的結(jié)果，繼而影響后續(xù)生物發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的產(chǎn)量。另外，不加去氧膽酸鈉，平板被污染的概率較高。比較實(shí)驗(yàn)3和實(shí)驗(yàn)1、2，實(shí)驗(yàn)3中氧膽酸鈉僅加0.1g，結(jié)果顯示：三孢布拉霉菌菌絲蔓延程度較實(shí)驗(yàn)2高，較實(shí)驗(yàn)1低，單菌落在7天時(shí)連成整體，影響篩選最優(yōu)菌株。另外，平板被污染的概率也介于二者之間。綜合以上實(shí)驗(yàn)表明，使用本發(fā)明的培養(yǎng)基可得到獨(dú)立的單菌落，快速、準(zhǔn)確的篩選出三孢布拉霉高產(chǎn)菌株，通過本發(fā)明的培養(yǎng)基篩選出的三孢布拉霉菌生長(zhǎng)速度快，生長(zhǎng)繁殖量高，發(fā)酵生產(chǎn)所得番茄紅素產(chǎn)量高。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。1、培養(yǎng)基的制備：以配制500ml的培養(yǎng)基為例：按比例大致取土豆，去皮切塊（約3cm×3cm×1cm），再準(zhǔn)確稱量200g，沸煮30分鐘，過濾，加入準(zhǔn)確量取的葡糖糖10g、去氧膽酸鈉0.25g，瓊脂4g，充分混勻，加水定容，裝瓶，封口，高溫121℃滅菌20-30分鐘。取出降溫至徒手可承受的溫度，將其倒入已滅菌平板，靜置，冷卻。2、斜面培養(yǎng)：挑一環(huán)斜面中的菌絲到裝有已滅菌生理鹽水和小玻璃珠的三角瓶中，振蕩混勻，稀釋至10-3-10-7，涂平板，在27-28℃，相對(duì)濕度50%左右培養(yǎng)。待有菌落出現(xiàn)，挑選單菌落移接到斜面上（每個(gè)菌落接2支斜面），培養(yǎng)4-5天。正菌成熟斜面特征：菌絲淺黃色，菌絲比負(fù)株略粗，孢子較多且黑；負(fù)菌成熟斜面特征：菌絲淺黃色，菌絲狀態(tài)均勻，孢子較少。其中正負(fù)菌株各20支斜面甘油保存于超低溫冰箱，另外相同順序編號(hào)的正負(fù)菌株各20支斜面則進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)。3、平板培養(yǎng)：取用甘油保存的菌種，20ml無菌水洗下孢子，取0.1ml涂平板，在27-28℃，相對(duì)濕度50%左右，培養(yǎng)5-7天。正負(fù)菌株分別進(jìn)行操作，切不可將二者混淆。正菌成熟平板特征：菌絲淺黃色，菌絲比負(fù)株略粗，菌落直徑10-12mm，4天出孢，6-7天孢子長(zhǎng)齊，孢子較多且為黑色；負(fù)菌成熟平板特征：菌絲鮮黃色，菌絲狀態(tài)均勻，菌落直徑10mm，比正株略小，產(chǎn)色素。注意：正負(fù)菌株分別進(jìn)行操作，切不可將二者混淆。4、初篩：如A，B中所述，挑出并保存的菌，每株兩瓶分兩批進(jìn)行初篩。正負(fù)株隨機(jī)結(jié)合，按1:5~7比例接入發(fā)酵搖瓶，發(fā)酵周期5天。放瓶后，測(cè)定番茄紅素含量。從中選出單位較高的5株正菌和5株負(fù)菌。5、復(fù)篩：經(jīng)初篩選出的5株正菌和5株負(fù)菌，按初篩的結(jié)合順序，繼續(xù)進(jìn)行搖瓶復(fù)篩試驗(yàn)。發(fā)酵周期5天，以生產(chǎn)菌作為對(duì)照，共進(jìn)行3次對(duì)比實(shí)驗(yàn)。并選出產(chǎn)單位最高的2株正菌和2株負(fù)菌，擴(kuò)大培養(yǎng)，保存，備用。當(dāng)前第1頁1 2 3