本發(fā)明涉及生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體而言，涉及一種冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵廢液的再利用方法。

背景技術(shù)：

冬蟲(chóng)夏草又名蟲(chóng)草、冬蟲(chóng)草、夏草冬蟲(chóng)。為麥角菌科植物冬蟲(chóng)夏草菌寄生在蝙蝠科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)體上的子坐及幼蟲(chóng)尸體內(nèi)為菌核的復(fù)合體。主產(chǎn)于四川、青海、西藏、云南等地。夏至前后挖取，曬干或烘干，生用?，F(xiàn)代研究表明，冬蟲(chóng)夏草具有重要的食用、藥用和其它經(jīng)濟(jì)價(jià)值，蟲(chóng)草中含有豐富的蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草素及各類(lèi)氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有擴(kuò)張氣管、鎮(zhèn)靜、抗各類(lèi)細(xì)菌、降血壓的功效。近年來(lái)，美國(guó)、日本等相繼報(bào)道蟲(chóng)草具有提高人體抑止腫瘤能力，能加強(qiáng)人體排異作用。解放后我國(guó)也對(duì)食用菌和冬蟲(chóng)夏草的人工引種、馴化、栽培、遺傳、應(yīng)用等方面進(jìn)行了很多研究。

目前我國(guó)冬蟲(chóng)夏草培養(yǎng)大部分是人工栽培培養(yǎng)，由于受地理環(huán)境、氣候、水土及蟲(chóng)草品種等各方面的自然條件影響，冬蟲(chóng)夏草的質(zhì)量和產(chǎn)量極不穩(wěn)定，難于實(shí)現(xiàn)規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。采用深層發(fā)酵生產(chǎn)蟲(chóng)草菌絲體，一方面很容易從培養(yǎng)液中分離和提取出各種有效成份物質(zhì)，例如提取蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖等有用物質(zhì)和具有抗癌作用的冬蟲(chóng)夏草素及多種氨基酸，另一方面利用大容積的發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)能夠提高產(chǎn)量，保證篩選用藥的物質(zhì)來(lái)源，緩解蟲(chóng)草資源的緊張狀況。

冬蟲(chóng)夏草的人工培養(yǎng)的過(guò)程中，經(jīng)發(fā)酵后的菌絲體一般只占發(fā)酵物總量的3％左右，而將其余97％的發(fā)酵液當(dāng)作廢液棄去，對(duì)發(fā)酵液成分進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，蟲(chóng)草多糖的發(fā)酵廢液內(nèi)含有多種蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、D-甘露糖、麥角甾醇、和微量元素，如果直接將蟲(chóng)草發(fā)酵廢液棄去，則不但浪費(fèi)資源，同時(shí)也會(huì)造成環(huán)境污染。因此，本領(lǐng)域亟需一種能夠回收利用蟲(chóng)草發(fā)酵廢液，降低資源浪費(fèi)和環(huán)境污染的方法。

本領(lǐng)域已有將生物發(fā)酵產(chǎn)生的廢液經(jīng)過(guò)處理后再次作為培養(yǎng)基的組成部分循環(huán)使用，但基于發(fā)酵菌種和產(chǎn)物的不同，如何循環(huán)利用生物發(fā)酵廢液，并沒(méi)有固定的方法，也不可能借鑒已有方法而直接套用，而是需要根據(jù)菌種發(fā)酵廢液的具體情況，通過(guò)不斷的嘗試才能得出。生物發(fā)酵產(chǎn)生的廢液中除了包含上述有效成分以及一些殘?zhí)侵?，還包括一些能夠抑制微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)，為了實(shí)現(xiàn)發(fā)酵廢液的循環(huán)利用，需要對(duì)這些抑制物質(zhì)進(jìn)行處理，消除對(duì)菌種生長(zhǎng)繁殖的抑制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種能夠有效回收和利用冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵廢液的方法，即將發(fā)酵廢液在添加特定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后按照特定比例返回培養(yǎng)基循環(huán)利用的方法。具體步驟如下：

(1)收集冬蟲(chóng)夏草真菌經(jīng)液體深層發(fā)酵并提取菌絲后產(chǎn)生的廢液，采用板框過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液A；

(2)用增壓泵將濾液A泵入排渣三級(jí)機(jī)械精密過(guò)濾器進(jìn)行處理，得到濾液B；

(3)將濾液B濃縮至其原體積的1/10，得到濃縮發(fā)酵液C；

(4)將濃縮發(fā)酵液C進(jìn)行超濾，得到超濾發(fā)酵液D；

(5)在超濾發(fā)酵液D中補(bǔ)加新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，得到可循環(huán)利用的發(fā)酵液E；

(6)將可循環(huán)利用的發(fā)酵液E返回三級(jí)培養(yǎng)基。

具體而言，步驟(1)中的冬蟲(chóng)夏草真菌為(Cordyceps sinensis)的無(wú)性型-中國(guó)被毛孢(Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng)；板框過(guò)濾時(shí)的壓力0.35-0.45Mpa，經(jīng)300目濾布過(guò)濾；

步驟(2)中，使用排渣三級(jí)機(jī)械精密過(guò)濾器精密過(guò)濾濾液A的具體過(guò)程為，在排渣三級(jí)機(jī)械精密過(guò)濾器內(nèi)依次通過(guò)100μm一級(jí)精密過(guò)濾器、10μm二級(jí)精密過(guò)濾器和1μm二級(jí)精密過(guò)濾器處理；

步驟(3)中，濃縮溫度為60-70℃；

步驟(4)中，超濾使用的超濾膜的截留分子量為500道爾頓，進(jìn)水壓力1.2-1.3Mpa，超濾溫度20-30℃，pH值為6.2～6.8；

步驟(5)中，按百分質(zhì)量補(bǔ)加的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如下：蠶豆粉5.5-6％、玉米粉4.5-5％、葡萄糖6-7％、酵母膏2.0-2.5％、蛋白胨1.2-1.8％、硫酸鎂0.4-0.8％、磷酸氫二鉀0.05-0.1％。

步驟(6)中，原三級(jí)培養(yǎng)基與加入的發(fā)酵液E的體積比為3：1-5：1。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

本發(fā)明以冬蟲(chóng)夏草真菌經(jīng)液體深層發(fā)酵并提取菌絲后產(chǎn)生的廢液為原料，經(jīng)過(guò)處理后除去了抑制冬蟲(chóng)夏草真菌生長(zhǎng)的抑制物質(zhì)，并保留了對(duì)冬蟲(chóng)夏草真菌生長(zhǎng)和繁殖有利的物質(zhì)，有效利用了冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵廢液中殘存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并通過(guò)循環(huán)使用回收的發(fā)酵液，意外的發(fā)現(xiàn)其可提高冬蟲(chóng)夏草菌絲體的產(chǎn)量。通過(guò)該方法，達(dá)到了既減少了對(duì)資源的浪費(fèi)，又解決了發(fā)酵液對(duì)環(huán)境造成污染的問(wèn)題，并且提高了冬蟲(chóng)夏草菌絲體的產(chǎn)量的綜合良好效果，同時(shí)降低了企業(yè)生產(chǎn)的成本，提高了產(chǎn)業(yè)的附加值，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

附圖1為本發(fā)明循環(huán)利用冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵廢液的流程示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1)收集冬蟲(chóng)夏草真菌經(jīng)液體深層發(fā)酵并提取菌絲后產(chǎn)生的廢液，采用板框過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液A；冬蟲(chóng)夏草真菌為(Cordyceps sinensis)的無(wú)性型-中國(guó)被毛孢(Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng)；板框過(guò)濾時(shí)的壓力0.35Mpa，經(jīng)300目濾布過(guò)濾；具體的發(fā)酵過(guò)程可參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利CN201210389147.5的說(shuō)明書(shū)。

(2)用增壓泵將濾液A泵入排渣三級(jí)機(jī)械精密過(guò)濾器進(jìn)行處理，得到濾液B，使用排渣三級(jí)機(jī)械精密過(guò)濾器精密過(guò)濾濾液A的具體過(guò)程為，在排渣三級(jí)機(jī)械精密過(guò)濾器內(nèi)依次通過(guò)100μm一級(jí)精密過(guò)濾器、10μm二級(jí)精密過(guò)濾器和1μm二級(jí)精密過(guò)濾器處理；

(3)將濾液B濃縮至其原體積的1/10，得到濃縮發(fā)酵液C，濃縮溫度為60℃；

(4)將濃縮發(fā)酵液C進(jìn)行超濾，得到超濾發(fā)酵液D，超濾使用的超濾膜的截留分子量為500道爾頓，進(jìn)水壓力1.3Mpa，超濾溫度20℃，pH值為6.2；

(5)在超濾發(fā)酵液D中補(bǔ)加新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，得到可循環(huán)利用的發(fā)酵液E，按百分質(zhì)量補(bǔ)加的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如下：蠶豆粉6％、玉米粉4.5％、葡萄糖7％、酵母膏2.0％、蛋白胨1.2％、硫酸鎂0.4％、磷酸氫二鉀0.1％；

(6)將可循環(huán)利用的發(fā)酵液E返回三級(jí)培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，原三級(jí)培養(yǎng)基與加入的發(fā)酵液E的體積比為3：1，經(jīng)過(guò)四級(jí)發(fā)酵后分離回收生成的菌絲體，烘干，粉碎，測(cè)定菌絲體的產(chǎn)量以及產(chǎn)品質(zhì)量。

實(shí)施例2

(1)收集冬蟲(chóng)夏草真菌經(jīng)液體深層發(fā)酵并提取菌絲后產(chǎn)生的廢液，采用板框過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液A；冬蟲(chóng)夏草真菌為(Cordyceps sinensis)的無(wú)性型-中國(guó)被毛孢(Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng)；板框過(guò)濾時(shí)的壓力0.4Mpa，經(jīng)300目濾布過(guò)濾；具體的發(fā)酵過(guò)程可參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利CN201210389147.5的說(shuō)明書(shū)。

(2)用增壓泵將濾液A泵入排渣三級(jí)機(jī)械精密過(guò)濾器進(jìn)行處理，得到濾液B，使用排渣三級(jí)機(jī)械精密過(guò)濾器精密過(guò)濾濾液A的具體過(guò)程為，在排渣三級(jí)機(jī)械精密過(guò)濾器內(nèi)依次通過(guò)100μm一級(jí)精密過(guò)濾器、10μm二級(jí)精密過(guò)濾器和1μm二級(jí)精密過(guò)濾器處理；

(3)將濾液B濃縮至其原體積的1/10，得到濃縮發(fā)酵液C，濃縮溫度為65℃；

(4)將濃縮發(fā)酵液C進(jìn)行超濾，得到超濾發(fā)酵液D，超濾使用的超濾膜的截留分子量為500道爾頓，進(jìn)水壓力1.2Mpa，超濾溫度25℃，pH值為6.5；

(5)在超濾發(fā)酵液D中補(bǔ)加新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，得到可循環(huán)利用的發(fā)酵液E，按百分質(zhì)量補(bǔ)加的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如下：蠶豆粉5.8％、玉米粉4.8％、葡萄糖6.5％、酵母膏2.2％、蛋白胨1.5％、硫酸鎂0.6％、磷酸氫二鉀0.07％；

(6)將可循環(huán)利用的發(fā)酵液E返回三級(jí)培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，原三級(jí)培養(yǎng)基與加入的發(fā)酵液E的體積比為4：1，經(jīng)過(guò)四級(jí)發(fā)酵后分離回收生成的菌絲體，烘干，粉碎，測(cè)定菌絲體的產(chǎn)量以及產(chǎn)品質(zhì)量。

實(shí)施例3

(1)收集冬蟲(chóng)夏草真菌經(jīng)液體深層發(fā)酵并提取菌絲后產(chǎn)生的廢液，采用板框過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液A；冬蟲(chóng)夏草真菌為(Cordyceps sinensis)的無(wú)性型-中國(guó)被毛孢(Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng)；板框過(guò)濾時(shí)的壓力0.45Mpa，經(jīng)300目濾布過(guò)濾；具體的發(fā)酵過(guò)程可參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利CN201210389147.5的說(shuō)明書(shū)。

(2)用增壓泵將濾液A泵入排渣三級(jí)機(jī)械精密過(guò)濾器進(jìn)行處理，得到濾液B，使用排渣三級(jí)機(jī)械精密過(guò)濾器精密過(guò)濾濾液A的具體過(guò)程為，在排渣三級(jí)機(jī)械精密過(guò)濾器內(nèi)依次通過(guò)100μm一級(jí)精密過(guò)濾器、10μm二級(jí)精密過(guò)濾器和1μm二級(jí)精密過(guò)濾器處理；

(3)將濾液B濃縮至其原體積的1/10，得到濃縮發(fā)酵液C，濃縮溫度為70℃；

(4)將濃縮發(fā)酵液C進(jìn)行超濾，得到超濾發(fā)酵液D，超濾使用的超濾膜的截留分子量為500道爾頓，進(jìn)水壓力1.3Mpa，超濾溫度30℃，pH值為6.8；

(5)在超濾發(fā)酵液D中補(bǔ)加新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，得到可循環(huán)利用的發(fā)酵液E，按百分質(zhì)量補(bǔ)加的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如下：蠶豆粉5.5％、玉米粉5％、葡萄糖6％、酵母膏2.5％、蛋白胨1.8％、硫酸鎂0.8％、磷酸氫二鉀0.05％；

(6)將可循環(huán)利用的發(fā)酵液E返回三級(jí)培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，原三級(jí)培養(yǎng)基與加入的發(fā)酵液E的體積比為5：1，經(jīng)過(guò)四級(jí)發(fā)酵后分離回收生成的菌絲體，烘干，粉碎，測(cè)定菌絲體的產(chǎn)量以及產(chǎn)品質(zhì)量。

對(duì)比例1

配置冬蟲(chóng)夏草真菌的無(wú)性型-中國(guó)被毛孢三級(jí)補(bǔ)加培養(yǎng)液，具體成分為(按百分質(zhì)量)：蠶豆粉6％、玉米粉4.5％、葡萄糖7％、酵母膏2.0％、蛋白胨1.2％、硫酸鎂0.4％、磷酸氫二鉀0.1％，其余為水；將該補(bǔ)加培養(yǎng)液加入三級(jí)培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，原三級(jí)培養(yǎng)基與加入的補(bǔ)加培養(yǎng)液的體積比為3：1，經(jīng)過(guò)四級(jí)發(fā)酵后分離回收生成的菌絲體，烘干，粉碎，測(cè)定菌絲體的產(chǎn)量以及產(chǎn)品質(zhì)量。

對(duì)比例2

配置冬蟲(chóng)夏草真菌的無(wú)性型-中國(guó)被毛孢三級(jí)培養(yǎng)液，具體成分為(按百分質(zhì)量)：蠶豆粉5.8％、玉米粉4.8％、葡萄糖6.5％、酵母膏2.2％、蛋白胨1.5％、硫酸鎂0.6％、磷酸氫二鉀0.07％，其余為水；將該補(bǔ)加培養(yǎng)液加入三級(jí)培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，原三級(jí)培養(yǎng)基與加入的補(bǔ)加培養(yǎng)液的體積比為4：1,經(jīng)過(guò)四級(jí)發(fā)酵后分離回收生成的菌絲體，烘干，粉碎，測(cè)定菌絲體的產(chǎn)量以及產(chǎn)品質(zhì)量。

對(duì)比例3

配置冬蟲(chóng)夏草真菌的無(wú)性型-中國(guó)被毛孢三級(jí)培養(yǎng)液，具體成分為(按百分質(zhì)量)：蠶豆粉5.5％、玉米粉5％、葡萄糖6％、酵母膏2.5％、蛋白胨1.8％、硫酸鎂0.8％、磷酸氫二鉀0.05％，其余為水；將該補(bǔ)加培養(yǎng)液加入三級(jí)培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，原三級(jí)培養(yǎng)基與加入的補(bǔ)加培養(yǎng)液的體積比為5：1,經(jīng)過(guò)四級(jí)發(fā)酵后分離回收生成的菌絲體，烘干，粉碎，測(cè)定菌絲體的產(chǎn)量以及產(chǎn)品質(zhì)量。

對(duì)比例4

按照CN201210389147.5實(shí)施例5中的方法進(jìn)行發(fā)酵，在三級(jí)發(fā)酵時(shí)不添加培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)四級(jí)發(fā)酵后分離回收生成的菌絲體，烘干，粉碎，測(cè)定菌絲體的產(chǎn)量以及產(chǎn)品質(zhì)量。

按《中華人民共和國(guó)藥典2005年版》中所記載的測(cè)定方法，將實(shí)施例1-3所制得的產(chǎn)品與對(duì)比例1-4所制得的產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)下表：

由上述測(cè)定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)處理后返回添加至三級(jí)培養(yǎng)基中，既減少了對(duì)資源的浪費(fèi)，又解決了發(fā)酵液對(duì)環(huán)境造成污染的問(wèn)題，同時(shí)還意外的發(fā)現(xiàn)可以提高冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵所得的菌絲體的產(chǎn)量以及質(zhì)量，推測(cè)出現(xiàn)該效果的原因?yàn)槎x(chóng)夏草的發(fā)酵廢液中含有對(duì)冬蟲(chóng)夏草真菌生長(zhǎng)和繁殖或者對(duì)產(chǎn)生有效代謝產(chǎn)物有利的物質(zhì)成分。