本發(fā)明公開一種鼠毛滴蟲nested PCR檢測試劑盒，主要用于鼠糞便中鼠三毛滴蟲(Tritrichomonas muris)或人五毛滴蟲(Pentatrichomonas hominis)的快速PCR檢測，本發(fā)明還提供了該試劑盒的制備方法和用法，屬于寄生蟲檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

毛滴蟲(Trichomoniasis)是原生動(dòng)物門(Protozoa)鞭毛綱(Flagellata)動(dòng)鞭毛亞綱(Zoomastigina)毛滴蟲目(Trichomonadida)的條件性致病寄生蟲。在臨床上，鼠類動(dòng)物尤以鼠三毛滴蟲(T.muris)和人五毛滴蟲(P.hominis)的致病性最強(qiáng)，普遍存在于多種動(dòng)物消化道，特別是鼠的盲腸中。

小白鼠、豚鼠等鼠常用作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，是很重要的實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測》(GB14922.1-2001)規(guī)定：無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級的小鼠、大鼠、豚鼠和地鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)體內(nèi)不得攜帶鞭毛蟲及纖毛蟲。從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理層面上看，動(dòng)物的屏障系統(tǒng)作用下小鼠、大鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染了毛滴蟲，說明實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理水平有待提高或?qū)嶒?yàn)員的操作技術(shù)不成熟，需進(jìn)一步加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理。從寄生蟲角度上看，小鼠、大鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中存在毛滴蟲，在一定程度上預(yù)示著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可能感染了其他病原體，對以后的實(shí)驗(yàn)具有一定預(yù)警作用，提示實(shí)驗(yàn)員需加強(qiáng)預(yù)防、控制病原體的侵入。

目前，鼠毛滴蟲檢測試劑盒暫時(shí)沒有，因而鼠毛滴蟲nested PCR檢測試劑盒同樣空缺。檢測鼠毛滴蟲的主要方法是涂片鏡檢法，該法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢出率和可信度低。研發(fā)一種與免疫學(xué)技術(shù)相關(guān)的檢測試劑盒周期長、耗費(fèi)大，故從分子生物學(xué)技術(shù)的角度研發(fā)一種特異性和靈敏度高的鼠毛滴蟲特異PCR檢測試劑盒是首選。由于糞便樣本組分十分復(fù)雜，其中含有大量生物，使用普通PCR法進(jìn)行檢測經(jīng)常出現(xiàn)假陽性結(jié)果。而nested PCR針對普通PCR的缺陷改進(jìn)后，其特異性、靈敏性進(jìn)一步提升。本專利以鼠毛滴蟲16S rRNA 基因部分保守序列為靶序列，設(shè)計(jì)兩對特異nested PCR 引物，建立特異nested PCR 檢測方法，制備鼠毛滴蟲nested PCR檢測試劑盒，用于檢測鼠毛滴蟲。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種鼠毛滴蟲nested PCR檢測試劑盒，能檢測鼠糞便中鼠三毛滴蟲、人五毛滴蟲的nested PCR檢測試劑盒，可用于鼠三毛滴蟲或人五毛滴蟲的快速檢測。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了鼠毛滴蟲nested PCR檢測試劑盒的制備方法。

本發(fā)明所述的一種鼠毛滴蟲nested PCR檢測試劑盒的組成材料：

（1）PCR反應(yīng)液：dNTP Mixture(2.5mM/each)，MgCl₂(25mM)，10╳PCR Buffer(Mg²⁺free)，和滅菌ddH₂O。其中，r Taq Polymerase(5U/μl)另裝。

（2）特異nested PCR 引物(均15pM)：

第一輪PCR引物：F₁：5'-ACA CTT CGG TCA TAG ATT AA-3'

F₂：5'-AGG GAT TCC TGG TTC AT-3'

第二輪PCR引物：R₁：5'-AGT TTG CTC CCA TAT TGT TG-3'

R₂：5'-CAC GGA CCT GTT ATT GCT AC-3'

（3）陽性對照：陽性對照的糞便基因組DNA 模板為鼠三毛滴蟲(T.muris)或人五毛滴蟲(P.hominis)基因組DNA，用于比較PCR產(chǎn)物以及監(jiān)測PCR操作過程是否正確；

（4）陰性對照：陰性對照的模板為滅菌ddH₂O，目的在排除反應(yīng)液中的核酸污染和操作過程中的假陽性問題。

本發(fā)明的試劑盒還可以含有瓊脂糖（Agarose）、溴酚藍(lán)點(diǎn)樣緩沖液和溴化乙錠(E.B)10μg/μl，也還可以含有PCR反應(yīng)管。

本發(fā)明所述的一種鼠毛滴蟲nested PCR檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

1) 糞便基因組DNA的提?。?/p>

使用生物公司出售的糞便基因組DNA提取試劑盒，提取鼠糞便中鼠三毛滴蟲(T.muris)、人五毛滴蟲(P.hominis)的基因組DNA。

2）PCR 擴(kuò)增：

（1）準(zhǔn)備待檢樣品的PCR 反應(yīng)管并分別標(biāo)記，管內(nèi)加入PCR 反應(yīng)液，然后加入引物、基因組DNA模板和r Taq Polymerase(5U/μl)，渦旋混勻后瞬時(shí)離心后，放入PCR儀中，設(shè)置PCR反應(yīng)條件。

（2）第一輪PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min、95℃變性50s、50℃退火50s、72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，后72℃延伸12min。

（3）以第一輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR，第二輪PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min、95℃變性50s、50℃退火50s、72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，后72℃延伸12min。

3）PCR產(chǎn)物觀察：

配制1.0%瓊脂糖凝膠(加入濃度0.5μg/mL的E.B)，加樣后100V-150V電壓下電泳20-30min，之后在紫外燈或凝膠成像系統(tǒng)下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，若樣品第二輪在724bp或727bp大小處存在條帶就證明該樣品為陽性。測序可準(zhǔn)確知道是何種鼠毛滴蟲。

本發(fā)明的積極效果在于：根據(jù)鼠三毛滴蟲、人五毛滴蟲16S rRNA基因的部分保守序列設(shè)計(jì)引物，建立特異nested PCR檢測方法，并且通過優(yōu)化PCR反應(yīng)的Mg²⁺濃度、退火溫度等反應(yīng)條件來提高其靈敏性和準(zhǔn)確性，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果方便、快捷。用一套nested PCR引物即可對鼠三毛滴蟲和人五毛滴蟲進(jìn)行快速檢測，具有操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。

附圖說明

附圖1：鼠毛滴蟲nested PCR的引物驗(yàn)證圖；

附圖2：鼠毛滴蟲nested PCR的Mg²⁺濃度的優(yōu)化圖；

附圖3：第一輪PCR退火溫度的優(yōu)化圖；

附圖4：第二輪PCR退火溫度的優(yōu)化圖；

附圖5：鼠毛滴蟲nested PCR的靈敏度試驗(yàn)圖；

附圖6：鼠毛滴蟲nested PCR的特異性試驗(yàn)圖；

附圖7：鼠毛滴蟲nested PCR的實(shí)際應(yīng)用圖。

具體實(shí)施方式

下列實(shí)施例旨在更清楚地闡明該發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員充分可以明白到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何平行改變和改動(dòng)都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。

實(shí)施例1

1、鼠毛滴蟲nested PCR檢測試劑盒的引物設(shè)計(jì)

根據(jù)鼠三毛滴蟲、人五毛滴蟲16S rRNA基因部分保守序列，用生物軟件設(shè)計(jì)特異性診斷引物如下：

第一輪PCR引物：F₁：5'-ACA CTT CGG TCA TAG ATT AA-3'

F₂：5'-AGG GAT TCC TGG TTC AT-3'

第二輪PCR引物：R₁：5'-AGT TTG CTC CCA TAT TGT TG-3'

R₂：5'-CAC GGA CCT GTT ATT GCT AC-3'

以上兩對引物中F₁、F₂為第一輪PCR 引物，R₁、R₂為第二輪PCR引物。其中，第一輪在基因組DNA濃度較高時(shí)能擴(kuò)增出1362bp或 1360bp大小的條帶，第二輪能擴(kuò)增出724bp或727bp大小診斷基因片斷，目的條帶明亮，無非特異性雜帶(見附圖1)。能夠?qū)崿F(xiàn)靈敏、特異地檢測出鼠三毛滴蟲、人五毛滴蟲的目的。

、鼠毛滴蟲nested PCR檢測試劑盒的組成

（1）PCR反應(yīng)液：dNTP Mixture(2.5mM/each)， MgCl₂(25mM)，10╳PCR Buffer(Mg²⁺free) 和滅菌ddH₂O。其中，r Taq Polymerase(5U/μl)另裝。

（2）引物：外側(cè)上游引物(F₁)、外側(cè)下游引物(F₂)、內(nèi)側(cè)上游引物（R₁）和內(nèi)側(cè)下游引物(R₂)(均15pM)。

（3）陽性對照：陽性對照的糞便基因組DNA 模板為鼠三毛滴蟲或人五毛滴蟲基因組DNA，用于比較PCR產(chǎn)物以及監(jiān)測PCR操作過程是否正確。

（4）陰性對照的模板為滅菌ddH₂O，目的在排除反應(yīng)液中的核酸污染和操作過程中的假陽性問題。

此外，本發(fā)明的試劑盒還可以含有瓊脂糖（Agarose）、溴酚藍(lán)點(diǎn)樣緩沖液和溴化乙錠(E.B)10μg/μl，還可以含有PCR反應(yīng)管。

實(shí)施例2

1、鼠毛滴蟲nested PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

特異nested PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化過程為：

Mg²⁺濃度的優(yōu)化：設(shè)置Mg²⁺濃度梯度分別為0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、2.5 mmol/L、3.0 mmol/L、3.5 mmol/L、4.0 mmol/L，結(jié)果顯示最佳Mg²⁺濃度為2.0 mmol/L(見附圖2)。第一輪PCR退火溫度的優(yōu)化：設(shè)置退火溫度梯度分別為44.0℃、47.0℃、50.0℃、53.0℃、56.0℃、59.0℃、62.0℃、65.0℃、68.0℃、71.0℃，結(jié)果顯示最佳退火溫度為50.0℃(見附圖3)。

第二輪PCR退火溫度的優(yōu)化：設(shè)置退火溫度梯度分別為44.0℃、47.0℃、50.0℃、53.0℃、56.0℃、59.0℃、62.0℃、65.0℃、68.0℃、71.0℃，結(jié)果顯示最佳退火溫度為50.0℃(見附圖4)。

、鼠毛滴蟲nested PCR靈敏度試驗(yàn)

將培養(yǎng)的毛滴蟲計(jì)數(shù)后，并用滅菌的ddH₂O依次倍比稀釋為每毫升中含 10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰個(gè)鼠毛滴蟲，分別提取其基因組DNA。應(yīng)用上述含不同蟲體數(shù)量的基因組DNA作為模板，混合液按照上游引物1.5μl、下游引物1.5μl、dNTP Mixture 4μl、10╳PCR Buffer(Mg²⁺ free) 5μl、MgCl₂ 4μl、DNA模板1μl、r Taq Polymerase 0.5μl，最后用滅菌ddH₂O補(bǔ)至50μl體系，并且用優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，以此來確定nested PCR的靈敏度。第一輪能檢測出10³個(gè)/mL鼠毛滴蟲，第二輪可檢測出10¹個(gè)/mL鼠毛滴蟲，最終確定nested PCR可檢測到糞便10個(gè)/mL鼠毛滴蟲的DNA，屬高靈敏度檢測方法，符合敏感性檢測標(biāo)準(zhǔn)(見附圖5)。

、鼠毛滴蟲nested PCR特異性試驗(yàn)

為了確定nested PCR特異性，本實(shí)驗(yàn)可選取鼠三毛滴蟲或人五毛滴蟲作為陽性對照，滅菌的ddH₂O作為陰性對照，然后選取吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲科研實(shí)驗(yàn)室保存的寄生蟲基因組，分別是隱孢子蟲、新孢子蟲、Eimeria tenella、弓形蟲、伊氏錐蟲、賈第蟲作為DNA模板，同時(shí)按照上述的體系操作和優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，來確定所建立的nested PCR檢測方法是否特異，結(jié)果只有陽性對照（鼠毛滴蟲）出現(xiàn)特異條帶，證明所建立的nested PCR方法特異性良好(見圖6)。

、實(shí)際樣品檢測

購買遼寧省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心普通級小白鼠62只，取其盲腸糞便作為檢測樣品62份，提取其糞便基因組DNA 62份，按照上述的體系操作和優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，操作重復(fù)3次，經(jīng)nested PCR檢測出51個(gè)陽性結(jié)果(見附圖7)。

實(shí)施例3

1、鼠毛滴蟲nested PCR檢測試劑盒的穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)

陽性模板、nested PCR反應(yīng)液、引物和r Taq Polymerase(5U/μl)在-20℃條件下貯存，溴酚藍(lán)等其它物品常溫保存即可。當(dāng)貯存時(shí)間為1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、5個(gè)月和6個(gè)月時(shí)取出試劑盒，用已知的陽性樣品鑒定試劑盒穩(wěn)定性。取10份陽性樣品用該試劑盒重復(fù)檢測3次，同時(shí)做陰性對照，結(jié)果表明在724bp或727bp大小處有特異的目的帶，而陰性對照均無任何擴(kuò)增帶，故此試劑盒穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。

、鼠毛滴蟲nested PCR檢測試劑盒的保質(zhì)期試驗(yàn)

將在-20℃貯存1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月的試劑盒取出并對已知陽性樣品進(jìn)行檢測。按照該試劑盒的說明進(jìn)行操作，結(jié)果表明在-20℃條件下保存達(dá)6月之久的試劑盒依然能擴(kuò)增出清晰的目的條帶，無雜帶。

序列表

<110> 吉林大學(xué)

<120>

<140>

<160> 1

<210> 1

<211> 1362

<212> DNA

<213>鼠三毛滴蟲(Tritrichomonas muris)

<400> 1

1 ACACTTCGGT CATAGATTAA GCCATGCAAG TGTTAGTTCA GGCAACGAAA CTGCGAACAG

61 CTCATTAATA CGCTCAGAAT CTACCTGGTG GCAACCTTTC AGGTTTTATT TGGATAGCAG

121 CAGTAATTCT GGTGCTAATA CATGCGATTG TTTCACTACG TTGAGAAATA GTGGAAAAGT

181 TGACCCTTAC GGGCACACCA ATCGATTGAG CGACCTATCA TGCTTGTACT TAGGGTCTTT

241 ACCTAGGTAG GCTATCACGG GTAACGGGCG GTTACCGTCG GACTGCCGGA GAAGGCGCCT

301 GAGAGATAGC GACTATATCC ACGGGTAGCA GCAGGCGCGA AACTTACCCA CTCGAGACTT

361 TCGGAGGTGG TAATGACCAG TTACATGTTA TCCCTTTTGG GGTATTTGTA TAGGATCGCA

421 CTTTTCCAGT GCGGTGCAAT CTAGCAGAGG GCCAGTCTGG TGCCAGCAGC TGCGGTAATT

481 CCAGCTCTGC GAGTTTGCTC CCATATTGTT GCAGTTAAAA CGCTCGTAGT CAGAATTGCC

541 TGTCAAAGGC TTGCGAACTT CTGTTCGTTC ACTGTGAACA AATCAGGACG CTTAGCGTAC

601 GGTTTTCGGG AATGACTCAG CGCAGTATGA TATCTTTACT TCTAGTAAAA TCAATGAGAG

661 CCACCGGGGG TAGATCTATT TCATGGCGAA CGGTGGAATG TTTTGACCCA TGAGAGAGAA

721 ACGAAGGCGA AAGCATCTAC CTAGAGGGTT TCTGTCGATC AAGGGCGAGA GTAGGAGTAT

781 CCAACCGGAT CAGAGACCCG GGTAGTTCCT ACCTTAAACG ATGCCGACAG GGGCTTGTCC

841 TTTCATGAGG GCAGGACCTT AGGAGAAATC ATAGTTCTTG GGCTCTGGGG GAACTACGAC

901 CGCAAGGCTG AAACTTGAAG GAATTGACGG AAGGGCACAC CAGGGGTGGA GCTTGTGGCT

961 TAATTTGAAT CAACACGGGG AAACTTACCA GGACCAGATG TTTTTTATGA CTGACAGGCT

1021 TTAGGTCTTT CAGGATATGA TTTTTGGTGG TGCATGGCCG TTGGTGGTGC GTGGGTTGAC

1081 CTGTCATGCG TTGATTCAGA TAACGAGCGA GATTATCGCC AATTAAATAC CAGGTTCTGC

1141 TTTCAGATCT ATGGTTCTAA TTGGGACTCC CTGCGTTTCA AGCAGGAGGA AGAGGGTAGC

1201 AATAACAGGT CCGTGATGTC CTTTAGATGC TCTGGGCTGC ACGCGCGCTA CAATGTTAGG

1261 ATCAATGGGA TTCTGCTGCA CCGAAAGGTT TTAGCTACTC CCACAATACC TAACGTAGTT

1321 GGGATTGAGG ATTGTAATCA TTCTCATGAA CCAGGAATCC CT

<110> 吉林大學(xué)

<120>

<140>

<160> 1

<210> 1

<211> 724

<212> DNA

<213>鼠三毛滴蟲(Tritrichomonas muris)

<400> 1

1 AGTTTGCTCC CATATTGTTG CAGTTAAAAC GCTCGTAGTC AGAATTGCCT GTCAAAGGCT

61 TGCGAACTTC TGTTCGTTCA CTGTGAACAA ATCAGGACGC TTAGCGTACG GTTTTCGGGA

121 ATGACTCAGC GCAGTATGAT ATCTTTACTT CTAGTAAAAT CAATGAGAGC CACCGGGGGT

181 AGATCTATTT CATGGCGAAC GGTGGAATGT TTTGACCCAT GAGAGAGAAA CGAAGGCGAA

241 AGCATCTACC TAGAGGGTTT CTGTCGATCA AGGGCGAGAG TAGGAGTATC CAACCGGATC

301 AGAGACCCGG GTAGTTCCTA CCTTAAACGA TGCCGACAGG GGCTTGTCCT TTCATGAGGG

361 CAGGACCTTA GGAGAAATCA TAGTTCTTGG GCTCTGGGGG AACTACGACC GCAAGGCTGA

421 AACTTGAAGG AATTGACGGA AGGGCACACC AGGGGTGGAG CTTGTGGCTT AATTTGAATC

481 AACACGGGGA AACTTACCAG GACCAGATGT TTTTTATGAC TGACAGGCTT TAGGTCTTTC

541 AGGATATGAT TTTTGGTGGT GCATGGCCGT TGGTGGTGCG TGGGTTGACC TGTCATGCGT

601 TGATTCAGAT AACGAGCGAG ATTATCGCCA ATTAAATACC AGGTTCTGCT TTCAGATCTA

661 TGGTTCTAAT TGGGACTCCC TGCGTTTCAA GCAGGAGGAA GAGGGTAGCA ATAACAGGTC

721 CGTG

<110> 吉林大學(xué)

<120>

<140>

<160> 1

<210> 1

<211> 1360

<212> DNA

<213>人五毛滴蟲(Pentatrichomonas hominis)

<400> 1

1 ACACTTCGGT CATAGATTAA GCCATGCAAG TGTTAGTTCA GGTAACGAAA CTGCGAATAG

61 CTCATTAATA CGCTCAGAAT CTATTCGACG ACAACCAACA GGTTTTAAAT GGATAGCAGC

121 AGTAACTCTG GTGCTAATAC ATGCGATTGT TTCTCCAGAA GCGAATTATG GAGGAAAAGT

181 TGACCTCTTA CGAGGCGCGT CGTTCGACTG AGTGACCTAT CAGCTTGTAC TTAGGGTCTT

241 TACCTAGGTA GGCTATCACG GGTAACGGGC GGTTACCGTC GGACTGCCGG AGAAGGCGCC

301 TGAGAGATAG CGACTATATC CACGGGTAGC AGCAGGCGCG AAACTTTCCC ACTCGAGACT

361 TTCGGAGGAG GTAATGACCA GTTTCATGTG AAGCTTATGC TTCTGTGAAT AGGATCACAC

421 TTTTCCAGTG TGGTGAAACC TAGCAGAGGG CCAGTCTGGT GCCAGCAGCT GCGGTAATTC

481 CAGCTCTGCG AGTTTGCTCC CATATTGTTG CAGTTAAAAC GCCCGTAGTC GGAATTGGAC

541 AGCAATGTCC CTACGTTTCA ACGTTCACTG TGAACAAATC AGGACGCTTA GAGTATGGTA

601 ACAAGAATGA CTCAGCGCAG TATGAAGTCT TTGTTTCTTT CGGGAAACAA GCTCAATGAG

661 AGCCATCGGG GGTGGATCTA TTTCATGGCG AGTGGTGGAA TACTTTGACC CATGAGAGAG

721 ACACGGAGGC GAAGGCGTCC ACCTAGAGGG TTTCTGTCGA TCAAGGGCGA GAGTAGGAGT

781 ATCCAACCGG ACTAGAGACC CGGGTAGTTC CTACTGTAAA CGATGCCGAC AGAGGTTTGT

841 CATTTTATAA TGGCAGAACT TTTAGAGAAA TCATAGTTCT TGGGCTCTGG GGGAACTACG

901 ACCGCAAGGC TGAAACTTGA AGGAATTGAC GGAAGGGCAC ACCAGGGGTG GAGCCTGTGG

961 CTTAATTTGA ATCAACACGG GGAAGCTTAC CAGGACCAGA TGTTTTTTAT GACTGACAGG

1021 CTTCGGGTCT TTCAGGATAT TGCTTTTGGT GGTGCATGGC CGTTGGTGGT GCGTGGGTTG

1081 ACCTGTCTAG CGTTGATTCA GCTAACGAGC GAGATTATCG CCAATTATAT ACCTCGCATT

1141 GGCTTCAGTG TTGAGGTTCT AATTGGGACT CCCTGCGATT TTAGCAGGCG GAAGAGGGTA

1201 GCAATAACAG GTCCGTGATG TCCTTTAGAT GCTCTGGGCT GCACGCGTGC TACAATGCTA

1261 AGATCAATAG GAAGCTAGTC TGATAGGACA TGCTACTCTT ATAATCCTTA GCGTAGTTGG

1321 GATTGATCCT TGTAATCAGG ATCATGAACC AGGAATCCCT

<110> 吉林大學(xué)

<120>

<140>

<160> 1

<210> 1

<211> 727

<212> DNA

<213>人五毛滴蟲(Pentatrichomonas hominis)

<400> 1

1 AGTTTGCTCC CATATTGTTG CAGTTAAAAC GCCCGTAGTC GGAATTGGAC AGCAATGTCC

61 CTACGTTTCA ACGTTCACTG TGAACAAATC AGGACGCTTA GAGTATGGTA ACAAGAATGA

121 CTCAGCGCAG TATGAAGTCT TTGTTTCTTT CGGGAAACAA GCTCAATGAG AGCCATCGGG

181 GGTGGATCTA TTTCATGGCG AGTGGTGGAA TACTTTGACC CATGAGAGAG ACACGGAGGC

241 GAAGGCGTCC ACCTAGAGGG TTTCTGTCGA TCAAGGGCGA GAGTAGGAGT ATCCAACCGG

301 ACTAGAGACC CGGGTAGTTC CTACTGTAAA CGATGCCGAC AGAGGTTTGT CATTTTATAA

361 TGGCAGAACT TTTAGAGAAA TCATAGTTCT TGGGCTCTGG GGGAACTACG ACCGCAAGGC

421 TGAAACTTGA AGGAATTGAC GGAAGGGCAC ACCAGGGGTG GAGCCTGTGG CTTAATTTGA

481 ATCAACACGG GGAAGCTTAC CAGGACCAGA TGTTTTTTAT GACTGACAGG CTTCGGGTCT

541 TTCAGGATAT TGCTTTTGGT GGTGCATGGC CGTTGGTGGT GCGTGGGTTG ACCTGTCTAG

601 CGTTGATTCA GCTAACGAGC GAGATTATCG CCAATTATAT ACCTCGCATT GGCTTCAGTG

661 TTGAGGTTCT AATTGGGACT CCCTGCGATT TTAGCAGGCG GAAGAGGGTA GCAATAACAG

721 GTCCGTG

<110> 吉林大學(xué)

<120> 鼠毛滴蟲nested PCR 檢測試劑盒及其方法

<140>

<160> 4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>鼠三毛滴蟲(Tritrichomonas muris)、人五毛滴蟲(Pentatrichomonas hominis)

<400> 1

ACA CTT CGG TCA TAG ATT AA 20

<110> 吉林大學(xué)

<120>鼠毛滴蟲nested PCR 檢測試劑盒及其方法

<140>

<160> 4

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213>鼠三毛滴蟲(Tritrichomonas muris)、人五毛滴蟲(Pentatrichomonas hominis)

<400> 1

AGG GAT TCC TGG TTC AT 17

<110> 吉林大學(xué)

<120>鼠毛滴蟲nested PCR 檢測試劑盒及其方法

<140>

<160> 4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>鼠三毛滴蟲(Tritrichomonas muris)、人五毛滴蟲(Pentatrichomonas hominis)

<400> 1

AGT TTG CTC CCA TAT TGT TG 20

<110> 吉林大學(xué)

<120>鼠毛滴蟲nested PCR 檢測試劑盒及其方法

<140>

<160> 4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>鼠三毛滴蟲(Tritrichomonas muris)、人五毛滴蟲(Pentatrichomonas hominis)

<400> 1

CAC GGA CCT GTT ATT GCT AC 20

<110> 吉林大學(xué)

<120>

<140>

<160> 1

<210> 1

<211> 1360

<212> DNA

<213>人五毛滴蟲(Pentatrichomonas hominis)

<400> 1

1 ACACTTCGGT CATAGATTAA GCCATGCAAG TGTTAGTTCA GGTAACGAAA CTGCGAATAG

61 CTCATTAATA CGCTCAGAAT CTATTCGACG ACAACCAACA GGTTTTAAAT GGATAGCAGC

121 AGTAACTCTG GTGCTAATAC ATGCGATTGT TTCTCCAGAA GCGAATTATG GAGGAAAAGT

181 TGACCTCTTA CGAGGCGCGT CGTTCGACTG AGTGACCTAT CAGCTTGTAC TTAGGGTCTT

241 TACCTAGGTA GGCTATCACG GGTAACGGGC GGTTACCGTC GGACTGCCGG AGAAGGCGCC

301 TGAGAGATAG CGACTATATC CACGGGTAGC AGCAGGCGCG AAACTTTCCC ACTCGAGACT

361 TTCGGAGGAG GTAATGACCA GTTTCATGTG AAGCTTATGC TTCTGTGAAT AGGATCACAC

421 TTTTCCAGTG TGGTGAAACC TAGCAGAGGG CCAGTCTGGT GCCAGCAGCT GCGGTAATTC

481 CAGCTCTGCG AGTTTGCTCC CATATTGTTG CAGTTAAAAC GCCCGTAGTC GGAATTGGAC

541 AGCAATGTCC CTACGTTTCA ACGTTCACTG TGAACAAATC AGGACGCTTA GAGTATGGTA

601 ACAAGAATGA CTCAGCGCAG TATGAAGTCT TTGTTTCTTT CGGGAAACAA GCTCAATGAG

661 AGCCATCGGG GGTGGATCTA TTTCATGGCG AGTGGTGGAA TACTTTGACC CATGAGAGAG

721 ACACGGAGGC GAAGGCGTCC ACCTAGAGGG TTTCTGTCGA TCAAGGGCGA GAGTAGGAGT

781 ATCCAACCGG ACTAGAGACC CGGGTAGTTC CTACTGTAAA CGATGCCGAC AGAGGTTTGT

841 CATTTTATAA TGGCAGAACT TTTAGAGAAA TCATAGTTCT TGGGCTCTGG GGGAACTACG

901 ACCGCAAGGC TGAAACTTGA AGGAATTGAC GGAAGGGCAC ACCAGGGGTG GAGCCTGTGG

961 CTTAATTTGA ATCAACACGG GGAAGCTTAC CAGGACCAGA TGTTTTTTAT GACTGACAGG

1021 CTTCGGGTCT TTCAGGATAT TGCTTTTGGT GGTGCATGGC CGTTGGTGGT GCGTGGGTTG

1081 ACCTGTCTAG CGTTGATTCA GCTAACGAGC GAGATTATCG CCAATTATAT ACCTCGCATT

1141 GGCTTCAGTG TTGAGGTTCT AATTGGGACT CCCTGCGATT TTAGCAGGCG GAAGAGGGTA

1201 GCAATAACAG GTCCGTGATG TCCTTTAGAT GCTCTGGGCT GCACGCGTGC TACAATGCTA

1261 AGATCAATAG GAAGCTAGTC TGATAGGACA TGCTACTCTT ATAATCCTTA GCGTAGTTGG

1321 GATTGATCCT TGTAATCAGG ATCATGAACC AGGAATCCCT

<110> 吉林大學(xué)

<120>

<140>

<160> 1

<210> 1

<211> 727

<212> DNA

<213>人五毛滴蟲(Pentatrichomonas hominis)

<400> 1

1 AGTTTGCTCC CATATTGTTG CAGTTAAAAC GCCCGTAGTC GGAATTGGAC AGCAATGTCC

61 CTACGTTTCA ACGTTCACTG TGAACAAATC AGGACGCTTA GAGTATGGTA ACAAGAATGA

121 CTCAGCGCAG TATGAAGTCT TTGTTTCTTT CGGGAAACAA GCTCAATGAG AGCCATCGGG

181 GGTGGATCTA TTTCATGGCG AGTGGTGGAA TACTTTGACC CATGAGAGAG ACACGGAGGC

241 GAAGGCGTCC ACCTAGAGGG TTTCTGTCGA TCAAGGGCGA GAGTAGGAGT ATCCAACCGG

301 ACTAGAGACC CGGGTAGTTC CTACTGTAAA CGATGCCGAC AGAGGTTTGT CATTTTATAA

361 TGGCAGAACT TTTAGAGAAA TCATAGTTCT TGGGCTCTGG GGGAACTACG ACCGCAAGGC

421 TGAAACTTGA AGGAATTGAC GGAAGGGCAC ACCAGGGGTG GAGCCTGTGG CTTAATTTGA

481 ATCAACACGG GGAAGCTTAC CAGGACCAGA TGTTTTTTAT GACTGACAGG CTTCGGGTCT

541 TTCAGGATAT TGCTTTTGGT GGTGCATGGC CGTTGGTGGT GCGTGGGTTG ACCTGTCTAG

601 CGTTGATTCA GCTAACGAGC GAGATTATCG CCAATTATAT ACCTCGCATT GGCTTCAGTG

661 TTGAGGTTCT AATTGGGACT CCCTGCGATT TTAGCAGGCG GAAGAGGGTA GCAATAACAG

721 GTCCGTG

<110> 吉林大學(xué)

<120> 鼠毛滴蟲特異nested PCR 檢測試劑盒及其制備方法

<140>

<160> 4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>鼠三毛滴蟲(Tritrichomonas muris)、人五毛滴蟲(Pentatrichomonas hominis)

<400> 1

ACA CTT CGG TCA TAG ATT AA 20

<110> 吉林大學(xué)

<120>鼠毛滴蟲特異nested PCR 檢測試劑盒及其制備方法

<140>

<160> 4

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213>鼠三毛滴蟲(Tritrichomonas muris)、人五毛滴蟲(Pentatrichomonas hominis)

<400> 1

AGG GAT TCC TGG TTC AT 17

<110> 吉林大學(xué)

<120>鼠毛滴蟲特異nested PCR 檢測試劑盒及其制備方法

<140>

<160> 4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>鼠三毛滴蟲(Tritrichomonas muris)、人五毛滴蟲(Pentatrichomonas hominis)

<400> 1

AGT TTG CTC CCA TAT TGT TG 20

<110> 吉林大學(xué)

<120>鼠毛滴蟲特異nested PCR 檢測試劑盒及其制備方法

<140>

<160> 4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>鼠三毛滴蟲(Tritrichomonas muris)、人五毛滴蟲(Pentatrichomonas hominis)

<400> 1

CAC GGA CCT GTT ATT GCT AC 20