本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種腈水解酶突變體及其在煙酸合成中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

煙酸，又名尼克酸，化學(xué)名為吡啶3-甲酸，其化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、理化性質(zhì)穩(wěn)定，與煙酰胺一起被稱(chēng)為維生素B3或者維生素PP，在食品、醫(yī)藥和工業(yè)上有著重要的應(yīng)用。在醫(yī)藥領(lǐng)域，煙酸可直接作為防治糙皮病等皮膚病和類(lèi)似的維生素缺乏癥的有效藥物，還可用于治療動(dòng)脈粥樣硬化和末梢神經(jīng)血管痙攣等病癥；煙酸可作為醫(yī)藥中間體合成酞胺和酰類(lèi)藥物。在食品領(lǐng)域，煙酸常用作乳制品、糕點(diǎn)、玉米粉等的添加劑。煙酸還可以在肉類(lèi)制品的加工中作為發(fā)色劑，另外其可以作為保鮮劑、去味劑和保色劑等。煙酸最主要的應(yīng)用領(lǐng)域就是作為飼料添加劑，在美國(guó)，煙酸和煙酰胺作為第二位的飼料用維生素物質(zhì)。此外，煙酸還可應(yīng)用于日化產(chǎn)品中做染料或抗氧化劑等。

目前，煙酸工業(yè)生產(chǎn)方法主要有高錳酸鉀氧化法、硝酸氧化法、硝酸-硫酸氧化法、氨氧化法等。其缺點(diǎn)有反應(yīng)需要高溫下進(jìn)行能耗高，反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重等。因此，尋求高效綠色環(huán)保的煙酸生產(chǎn)方式是目前面臨的重要問(wèn)題之一。

目前，利用微生物酶法轉(zhuǎn)化獲得煙酸受到重視，已有許多研究者不斷的發(fā)掘具有腈水解酶活性的微生物并應(yīng)用于制備煙酸。R.rhodochrousJ1的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶生成煙酸，其轉(zhuǎn)化率能達(dá)到100％，采用分批補(bǔ)料的方式添加底物連續(xù)轉(zhuǎn)化26h后，煙酸的產(chǎn)量達(dá)到172g·L^-1。固定化B.pallidus Dac521細(xì)胞轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶獲得煙酸，采用柱式反應(yīng)器，連續(xù)注入100mmol·L^-1底物，分別在50℃和60℃獲得轉(zhuǎn)化效率為104mg(底物)·h^-1·g(細(xì)胞)^-1和208mg(底物)·h^-1·g(細(xì)胞)^-1。Sharma等在1L體系的分批補(bǔ)料轉(zhuǎn)化中，利用4.2g小球諾卡氏菌(N.globerula)NHB-2的靜息細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化共1M的3-氰基吡啶，98.6％的3-氰基吡啶被轉(zhuǎn)化為煙酸，其產(chǎn)率為3.21g(煙酸)·h^-1·g(細(xì)胞)^-1。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種重組腈水解酶制備煙酸的方法，并且通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)提高此腈水解酶對(duì)3-氰基吡啶的催化能力，獲得一株高產(chǎn)煙酸的菌株。

本發(fā)明的目的之一是提供一種腈水解酶突變體，所述突變體是將序列SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第168位苯丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸和192位絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?，所述所述突變體氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核酸序列為SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明的目的之二是提供上述腈水解酶突變體構(gòu)建的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明的目的之三是提供含有上述重組質(zhì)粒的大腸桿菌重組菌。

本發(fā)明的目的之四是提供所述腈水解酶突變體在生產(chǎn)煙酸中的應(yīng)用。

上述的應(yīng)用具體為：以含腈水解酶突變體編碼基因的重組工程菌在經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后獲得的濕菌體為酶源，以3-氰基吡啶為反應(yīng)底物，以pH＝7.0的PBS緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在40℃下水浴反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束獲得反應(yīng)液。反應(yīng)菌體的用量為10g/L，所述底物的濃度為100mmol/L。

本發(fā)明所述濕菌體制備方式如下：將含腈水解酶突變體基因的工程菌接種到含終濃度為0.1g/L卡納霉素的5ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm/min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取培養(yǎng)液以1％體積比接種到含有0.1g/L卡納霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中。37℃，200rpm/min震蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.4～0.8時(shí)加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG，25℃，200rpm/min誘導(dǎo)培養(yǎng)16h,將發(fā)酵液與4℃下8000rpm/min離心10min，收集菌體。

本發(fā)明的有益效果在于：(1)本發(fā)明提供一種由腈水解酶基因編碼的腈水解酶，其在適合條件下，能有效生產(chǎn)煙酸，一步擴(kuò)充了煙酸生產(chǎn)的微生物資源。(2)突變菌株獲得更高的酶促反應(yīng)速率。細(xì)胞水平下轉(zhuǎn)化100mM底物，原始菌需要30min，而突變型腈水解酶轉(zhuǎn)化時(shí)間縮短為10min，對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)化的煙酸的速率分別為42.1mg/g/min，123mg/g/min。

附圖說(shuō)明

圖1為重組大腸桿菌E.coli BL21pET28a-nitA和突變株E.coli BL21pET28a-nitA-C2的蛋白膠電泳示意圖。

圖2腈水解酶酶活測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3為重組大腸桿菌E.coli BL21pET28a-nitA、E.coli BL21pET28a-nitA-C2催化制備煙酸的反應(yīng)

具體實(shí)施方式

本發(fā)明下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制：

實(shí)施例一、原始型腈水解酶重組菌E.coli BL21pET28a-nitA的構(gòu)建

以合成的基因SEQ ID NO.1(NCBI GenBank No.DQ444267，由金斯瑞公司合成)為模板，根據(jù)SEQ ID NO.1的基因序列與大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(+)的多克隆酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。

上游引物：P1:5’-GGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGTTTCGTATAACAGCA-3’。

下游引物：P2:5’-GCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTTTGCTGGGACCGGTTCT-3’。

PCR反應(yīng)條件為：

PCR的反應(yīng)條件為：99℃蓋溫；94℃預(yù)變性10min；94℃變性45s，50℃退火45s，72延伸2min，共32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物使用0.8％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后切膠使用Biomiga公司DNA凝膠回收試劑盒回收片段。

將含有pET-28a質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α(購(gòu)買(mǎi)于ATCC菌種保藏中心)接試管，加入卡納霉素，搖床37℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。使用質(zhì)粒提取試劑盒(莊盟生物)提取質(zhì)粒，用Nde I與Sal I進(jìn)行雙酶切，37℃下酶切過(guò)夜，酶切體系如下：

雙酶切線性化的載體與PCR產(chǎn)物進(jìn)行一步克隆，進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒。

重組質(zhì)粒與感受態(tài)的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂布到含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8h左右。

實(shí)施例二、突變菌的構(gòu)建

以實(shí)施例一中的合成的基因SEQ ID NO.1為模板，根據(jù)SEQ ID NO.1的基因序列與突變位點(diǎn)的核酸序列設(shè)計(jì)引物。

以含有目的基因片段的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Nit作為模板，根據(jù)重疊延伸PCR的方法對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，方法原理同實(shí)施例一。整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程分兩步進(jìn)行。首先分別加入引物P1和F168V-F，與P2和F168V-R對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得兩段DNA序列。然后將兩段序列添加入一個(gè)PCR體系中，加入引物P1和P2，繼續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得全長(zhǎng)的F168V突變體DNA序列。在168位突變體的基礎(chǔ)上按照上述方法對(duì)192位氨基酸進(jìn)行突變，獲得F168V-S192F的雙突變體NitA-C2。

突變體質(zhì)粒構(gòu)建與大腸桿菌的轉(zhuǎn)化參考實(shí)施例一。

實(shí)施例三、腈水解酶基因的表達(dá)

挑選單菌落接入5ml液體LB培養(yǎng)基試管中，培養(yǎng)基含0.1g/L的卡納霉素。37℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日將試管液體種子以體積比3％的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的含有0.1g/L的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌體OD₆₀₀約為0.4-0.8左右時(shí)，向上述LB液體培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為0.1mM)，25℃誘導(dǎo)20h，然后將發(fā)酵液在4℃下、8000rpm離心10min，收集濕菌體，用pH＝7.0的PBS緩沖液洗滌菌體2次，收集菌體。

實(shí)施例四、腈水解酶酶活測(cè)定方法

酶活測(cè)定根據(jù)Berthelot比色法建立。

1、顯色劑的配制：

(1)A液：將6g NaOH溶于蒸餾水中，加入3ml次氯酸鈉后定容至100ml。

(2)B液：將30mg亞硝基鐵氰化鈉和6g苯酚溶于100ml蒸餾水中避光保存。

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

配制10mmol/L的(NH₄)₂SO₄標(biāo)準(zhǔn)液，根據(jù)下表配制反應(yīng)體系，37℃搖床振蕩顯色30min，于630nm下測(cè)吸光值，對(duì)其進(jìn)行繪圖，如圖2。

3.待測(cè)樣品的檢測(cè)：取10ml離心管加入2ml H₂O，1ml A液，1ml B液，20μl待測(cè)樣品，混勻后置于37℃搖床中振蕩顯色30min，檢測(cè)A₆₃₀，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程帶入吸光值求得NH₄⁺的量，進(jìn)一步算出轉(zhuǎn)化的煙酸的量。

實(shí)施例五、利用重組腈水解酶制備煙酸

采用實(shí)施例三中收集到的菌體為酶源，添加入反應(yīng)體系中(總體系1ml,底物3-氰基吡啶100mM，pH＝7.0的PBS緩沖液)，40℃下水浴反應(yīng)10min取樣，加入100μl 2M HCl終止反應(yīng)。取反應(yīng)液顯色檢測(cè)產(chǎn)物含量。結(jié)果如圖3所示。

由上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明將腈水解酶基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌得到的重組大腸桿菌具有很好的腈水解酶能力，可直接以含酶的菌體細(xì)胞為酶源進(jìn)行生物催化或轉(zhuǎn)化反應(yīng)，該腈水解酶可以將3-氰基吡啶轉(zhuǎn)化制備煙酸。并且突變體NitA-C2較原始型NitA具有更高的反應(yīng)活性。在上述條件下原始性重組菌E.coli BL21pET28a-nitA與E.coli BL21pET28a-nitA-C2在10min的反應(yīng)速率為0.342mmol/g/·min與1mmol/g/min。對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)化的煙酸的量為42.1mg/g/min,123mg/g/min。

序列表

<110> 南京工業(yè)大學(xué)

<120> 一種腈水解酶突變體及其在煙酸制備中的應(yīng)用

<130> xb16081101

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1110

<212> DNA

<213> 腈水解酶

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

atggtttcgt ataacagcaa gttcctcgcg gcaaccgttc aggcagagcc ggtatggctc 60

gacgcagacg caacgatcga caagtcgatc ggcatcatcg aagaagctgc ccaaaagggc 120

gcgagtctga tcgctttccc ggaagtattc attccgggct acccctattg ggcgtggctc 180

ggcgacgtga agtacagcct aagctttact tcacgctatc acgagaattc gttggagcta 240

ggtgacgacc gtatgcgtcg cctccagctg gccgcgcgcc gcaacaaaat cgcactcgtc 300

atgggctatt cggagcggga agccggatcg cgctatctga gccaggtgtt catcgacgag 360

cgtggcgaga tcgttgccaa tcggcgcaag ctgaagccca cacacgttga gcgtacgatc 420

tacggcgaag gcaacggaac cgatttcctc acgcacgact tcgcgttcgg acgcgtcggt 480

ggattgaact gctgggaaca tttccaaccg ctcagcaagt tcatgatgta cagcctcggt 540

gagcaggtcc acgttgcatc gtggccggcg atgtcccctc ttcagccgga tgttttccaa 600

ctgagcatcg aagccaacgc gacggtcacc cgctcgtacg caatcgaagg ccaaaccttt 660

gtgctttgct cgacgcaggt gatcggacct agcgcgatcg aaacgttctg cctcaacgac 720

gaacagcgcg cactgttgcc gcaaggatgt ggctgggcgc gcatttacgg cccggatgga 780

agcgagcttg cgaagcctct ggcggaagat gctgagggga tcttgtacgc agagatcgat 840

ctggagcaga ttctgctggc gaaggctgga gccgatccgg tcgggcacta ttcgcggcct 900

gacgtgctgt cggtccagtt cgacccgcgc aatcatacgc cagttcatcg catcggcatt 960

gacggtcgct tggatgtgaa tacccgcagt cgcgtggaga atttccgact gcgacaagcg 1020

gctgagcagg agcgtcaggc atccaagcgg ctcggaacga aactctttga acaatccctt 1080

ctggctgaag aaccggtccc agcaaagtag 1110

<210> 2

<211> 369

<212> PRT

<213> 腈水解酶突變體

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu

1 5 10 15

Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile

20 25 30

Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu

35 40 45

Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu

65 70 75 80

Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys

85 90 95

Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr

100 105 110

Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg

115 120 125

Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly

130 135 140

Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly

145 150 155 160

Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met

165 170 175

Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser

180 185 190

Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr

195 200 205

Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser

210 215 220

Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp

225 230 235 240

Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr

245 250 255

Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu

260 265 270

Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys

275 280 285

Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser

290 295 300

Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile

305 310 315 320

Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg

325 330 335

Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly

340 345 350

Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala

355 360 365

Lys

<210> 3

<211> 1107

<212> DNA

<213> 腈水解酶突變體

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

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gacgcagacg caacgatcga caagtcgatc ggcatcatcg aagaagctgc ccaaaagggc 120

gcgagtctga tcgctttccc ggaagtattc attccgggct acccctattg ggcgtggctc 180

ggcgacgtga agtacagcct aagctttact tcacgctatc acgagaattc gttggagcta 240

ggtgacgacc gtatgcgtcg cctccagctg gccgcgcgcc gcaacaaaat cgcactcgtc 300

atgggctatt cggagcggga agccggatcg cgctatctga gccaggtgtt catcgacgag 360

cgtggcgaga tcgttgccaa tcggcgcaag ctgaagccca cacacgttga gcgtacgatc 420

tacggcgaag gcaacggaac cgatttcctc acgcacgact tcgcgttcgg acgcgtcggt 480

ggattgaact gctgggaaca tgtccaaccg ctcagcaagt tcatgatgta cagcctcggt 540

gagcaggtcc acgttgcatc gtggccggcg atgttccctc ttcagccgga tgttttccaa 600

ctgagcatcg aagccaacgc gacggtcacc cgctcgtacg caatcgaagg ccaaaccttt 660

gtgctttgct cgacgcaggt gatcggacct agcgcgatcg aaacgttctg cctcaacgac 720

gaacagcgcg cactgttgcc gcaaggatgt ggctgggcgc gcatttacgg cccggatgga 780

agcgagcttg cgaagcctct ggcggaagat gctgagggga tcttgtacgc agagatcgat 840

ctggagcaga ttctgctggc gaaggctgga gccgatccgg tcgggcacta ttcgcggcct 900

gacgtgctgt cggtccagtt cgacccgcgc aatcatacgc cagttcatcg catcggcatt 960

gacggtcgct tggatgtgaa tacccgcagt cgcgtggaga atttccgact gcgacaagcg 1020

gctgagcagg agcgtcaggc atccaagcgg ctcggaacga aactctttga acaatccctt 1080

ctggctgaag aaccggtccc agcaaag 1107

<210> 4

<211> 369

<212> PRT

<213> 腈水解酶突變體

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu

1 5 10 15

Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile

20 25 30

Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu

35 40 45

Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu

65 70 75 80

Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys

85 90 95

Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr

100 105 110

Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg

115 120 125

Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly

130 135 140

Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly

145 150 155 160

Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Val Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met

165 170 175

Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Phe

180 185 190

Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr

195 200 205

Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser

210 215 220

Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp

225 230 235 240

Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr

245 250 255

Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu

260 265 270

Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys

275 280 285

Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser

290 295 300

Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile

305 310 315 320

Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg

325 330 335

Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly

340 345 350

Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala

355 360 365

Lys