本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)和生物檢測領(lǐng)域，涉及到一種高穩(wěn)定的納米金探針功能復(fù)合物及其制備。

背景技術(shù)：

目前納米金探針功能復(fù)合物已經(jīng)應(yīng)用于多種領(lǐng)域，如納米金探針復(fù)合物已經(jīng)在多種診斷技術(shù)中作為指示劑使用，但是由于納米金探針復(fù)合物本身能夠檢測的目標(biāo)核酸靈敏度有限，使之在直接檢測真實標(biāo)本時受到限制。為能夠采用納米金探針復(fù)合物作為指示劑檢測真實標(biāo)本，常需要與一些酶擴增方法相偶聯(lián)以增加檢測靈敏度，但由于目前的納米金探針復(fù)合物穩(wěn)定性差，不能耐受酶擴增過程的熱循環(huán)，且會抑制酶擴增反應(yīng)，導(dǎo)致納米金探針復(fù)合物只能在酶擴增反應(yīng)結(jié)束后加入反應(yīng)體系中指示其結(jié)果，這種方式不僅操作復(fù)雜，還增加了酶擴增反應(yīng)產(chǎn)物交叉污染的風(fēng)險，不能滿足真實標(biāo)本的檢測。

因此本領(lǐng)域需要開發(fā)一種能夠與酶擴增反應(yīng)同時存在且不影響其性能的新型納米金探針功能復(fù)合物及其制備方法，使之通過簡單操作就能使納米金與功能分子相連接，并能夠達到耐受酶擴增熱程序和對酶擴增反應(yīng)零抑制的效果，從而有效提高納米金功能復(fù)合物在生物領(lǐng)域的實用性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有納米金探針功能復(fù)合物的上述不足，提供一種新的納米金功能復(fù)合物，該納米金功能復(fù)合物具有很好的穩(wěn)定性，能夠耐受強熱循環(huán)和強機械沖擊；具備強適用性，能夠與各種酶反應(yīng)液共存而不影響反應(yīng)的正常進行。

實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。

一種納米金探針功能復(fù)合物，其由納米金顆粒、連接于納米金顆粒表面的功能核酸探針以及穩(wěn)定劑構(gòu)成，所述穩(wěn)定劑為含有巰基基團的有機分子；穩(wěn)定劑是通過其巰基基團與納米金顆粒連接；

所述功能核酸探針具有以下結(jié)構(gòu)：

HS-(M)m-Q；

HS為巰基基團；M為亞甲基、乙二醇基及其衍生物，m為1-18的整數(shù)；Q為核苷酸序列。

在其中一個實施例中，所述含有巰基基團的有機分子選自半胱氨酸、巰基乙醇、12-巰基十二酸、巰基甲氧基硅烷。

在其中一個實施例中，所述核苷酸序列的長度為10-50個堿基。

在其中一個實施例中，所述m為3-8的整數(shù)。

在其中一個實施例中，所述納米金顆粒的平均尺寸可以為5nm-50nm。

本發(fā)明所述一種耐熱且能夠與核酸擴增酶反應(yīng)共存的納米金探針功能復(fù)合物由納米金顆粒和功能核酸探針、穩(wěn)定劑如巰基甲氧基硅烷在緩沖液中連接構(gòu)成，核酸探針及穩(wěn)定劑均是通過巰基基團與納米金顆粒相連接構(gòu)成納米金探針功能復(fù)合物。

本發(fā)明的另一目的是提供上述高穩(wěn)定的納米金探針功能復(fù)合物的制備方法，該制備方法的過程相對簡單，制備方式比較靈活。

實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。

上述納米金探針功能復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：

(S1)先將納米金顆粒與功能核酸探針按1:300-1000混合；

(S2)加入氟表面活性劑，再加入緩沖液和氯化鈉溶液混合均勻，室溫雜交孵育，離心洗滌后重懸于緩沖液；

(S3)加入穩(wěn)定劑，室溫雜交孵育24h，結(jié)束后離心洗滌重懸于無離子水中。

在其中一個實施例中，(S2)中室溫雜交孵育，(S3)室溫雜交孵育20-30h。

在其中一個實施例中，所述氟表面活性劑為FS-10、FS-30、FS-31、FS-3100、FS-50、FSN-100中的至少一種。

在其中一個實施例中，所述緩沖液可以為常規(guī)的磷酸鹽緩沖液、Tris鹽緩沖液、MOPS鹽緩沖液。

在其中一個實施例中，納米金顆粒與功能核酸探針按優(yōu)選1:400-800混合。

所述的高穩(wěn)定耐熱且能夠與核酸擴增酶反應(yīng)共存的新型納米金探針功能復(fù)合物制備方法，先通過納米金顆粒與待連接探針在含有表面活性劑的緩沖液條件下孵育實現(xiàn)納米金與待連接探針快速連接，再通過與含巰基穩(wěn)定劑孵育使納米金與含巰基穩(wěn)定劑相連接，從而制備能夠高穩(wěn)定耐熱且能夠與酶反應(yīng)共存的新型納米金探針功能復(fù)合物。

所述的新型納米金探針復(fù)合物能夠用于閉管核酸擴增產(chǎn)物的檢測，而同時納米金探針功能復(fù)合物的存在不會影響核酸擴增等酶反應(yīng)。

所述的高穩(wěn)定耐熱且能夠與酶反應(yīng)共存的新型納米金探針功能復(fù)合物，在高溫至90℃以上其功能能夠不受影響，且能夠直接應(yīng)用于基于酶反應(yīng)的檢測實驗或其他實驗中而不影響酶反應(yīng)或其他反應(yīng)的正常進行。

本發(fā)明采用的納米金探針有比較成熟的方法合成，成本低；而所述納米金探針功能復(fù)合物具備高穩(wěn)定性，能夠耐受強熱循環(huán)和強機械沖擊；具備強適用性，能夠與各種酶反應(yīng)液共存而不影響反應(yīng)的正常進行。

本發(fā)明所述的高穩(wěn)定的納米金功能復(fù)合物，如納米金探針復(fù)合物進行核酸檢測時，可實現(xiàn)短時間高靈敏度的閉管核酸檢測，能夠有效的避免擴增產(chǎn)物的交叉污染。且本發(fā)明的納米金功能復(fù)合物制備，其過程相對簡單，制備方式相對靈活。

附圖說明

下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，不用于限定有權(quán)利要求所界定的本發(fā)明范圍。

圖1是納米金探針功能復(fù)合物結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是實施例1中制備的納米金探針功能復(fù)合物分別于不同的溫度下孵育穩(wěn)定性結(jié)果。

圖3是實施例2中納米金探針功能復(fù)合物制備中表面活性劑選擇結(jié)果。

圖4是實施例3中納米金探針功能復(fù)合物制備中緩沖液類型選擇結(jié)果。

圖5為實施例4中納米金探針功能復(fù)合物的連接區(qū)M種類(M1和M2)選擇結(jié)果。

圖6為實施例5中納米金探針功能復(fù)合物的連接區(qū)M基本單位個數(shù)選擇結(jié)果。

圖7為實施例6中納米金探針功能復(fù)合物制備中不同長度探針的制備結(jié)果。

圖8是實施例7中本發(fā)明中納米金探針功能復(fù)合物對PCR擴增的影響結(jié)果。

圖9是實施例8中關(guān)于所述納米金探針功能復(fù)合物經(jīng)歷PCR熱循環(huán)前后對其穩(wěn)定性的影響，經(jīng)歷PCR熱循環(huán)前后，所述納米金探針功能復(fù)合物穩(wěn)定性未受到影響。

圖10是實施例9關(guān)于所述納米金探針功能復(fù)合物用于指示核酸侵入信號反應(yīng)結(jié)果，與核酸侵入信號反應(yīng)同時存在而不會影響核酸侵入信號反應(yīng)的正常進行，所述的納米金探針功能復(fù)合物能夠與核酸侵入信號反應(yīng)共存。

圖11是實施例10關(guān)于所述納米金探針功能復(fù)合物用于指示聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酸侵入信號反應(yīng)結(jié)果。

具體實施方式

本實施例涉及一種高穩(wěn)定的納米金探針功能復(fù)合物，其有納米金顆粒、連接于納米金顆粒表面的功能核酸探針以及穩(wěn)定劑構(gòu)成，所述穩(wěn)定劑為含有巰基基團的有機分子，穩(wěn)定劑是通過其巰基基團與納米金顆粒連接；

所述功能核酸探針具有以下結(jié)構(gòu)：

a：HS-(M)m-Q，

其中，HS為巰基基團；(M)m為連接區(qū)；

(I)功能核酸探針(a)結(jié)構(gòu)中M可以為亞甲基、乙二醇基及其衍生物；

(II)功能核酸探針(a)結(jié)構(gòu)中(M)m，m為選自1-18的整數(shù)；m更優(yōu)選為3-8的整數(shù)；

(III)功能核酸探針(a)結(jié)構(gòu)中Q，可以為不同堿基組成和長度的核苷酸序列。該核苷酸序列的長度對于高穩(wěn)定納米金探針功能復(fù)合物而言并無限制，根據(jù)具體的檢測需求，適應(yīng)設(shè)計即可。通常其長度為10-50個堿基。

所述納米金顆粒市面上能夠購買得到的合格產(chǎn)品即可，通常，其平均尺寸可以為5nm-50nm。

如圖1所示，本發(fā)明其中一個實施例所述的高穩(wěn)定納米金探針功能復(fù)合物包括有：含有巰基基團、連接區(qū)、核酸探針，核酸探針通過巰基基團與納米金顆粒相連接；含巰基穩(wěn)定劑同樣通過巰基基團與納米金顆粒相連接。

本實施例所述的新型納米金探針功能復(fù)合物由納米金顆粒和功能核酸探針、穩(wěn)定劑如巰基甲氧基硅烷在氟表面活性劑、緩沖液中制備得到，核酸探針及穩(wěn)定劑均是通過巰基基團與納米金顆粒相連接構(gòu)成納米金探針功能復(fù)合物。

本實施例還涉及所述高穩(wěn)定納米金探針功能復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：

(S1)先將納米金顆粒與功能核酸探針按1:300-1000混合；

(S2)加入氟表面活性劑，再加入緩沖液和氯化鈉溶液混合均勻，室溫雜交孵育2-10h，離心洗滌后重懸于緩沖液；其中，所述氟表面活性劑為FS-10、FS-30、FS-31、FS-3100、FS-50、FSN-100中的至少一種；所述緩沖液可以為常規(guī)的磷酸鹽緩沖液、Tris鹽緩沖液、MOPS鹽緩沖液；

(S3)加入穩(wěn)定劑，室溫雜交孵育20-30h，結(jié)束后離心洗滌重懸于無離子水中。

除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。

為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對本發(fā)明進行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。

以下實施例中所用到的FS-10、FS-30、FS-31、FS-3100、FS-50、FSN-100購自于杜邦。

實施例1

首先將納米金顆粒與含巰基探針(探針1序列：SH-(CH₂)₆-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM，SEQ ID NO.1)以一定比例混合(如以1:400)，加入含巰基表面活性劑如FSN-100，并加入pH 6.0的磷酸鉀緩沖液和氯化鈉溶液混合均勻，室溫雜交孵育3h，離心洗滌后重懸于磷酸鉀緩沖液，加入含巰基穩(wěn)定劑如巰基甲氧基硅烷，室溫雜交孵育24h，結(jié)束后離心洗滌重懸于無離子水中備用。制備結(jié)束的納米金探針復(fù)合物分別于Tris緩沖液條件下孵育在60℃、80℃、90℃、95℃條件下40分鐘后，計算納米金顆粒表面尚存留的核酸百分?jǐn)?shù)(納米金顆粒表面核酸總數(shù)采用DTT洗脫計算，為100％)。

圖2為將制備的納米金探針功能復(fù)合物分別于不同的溫度下孵育穩(wěn)定性結(jié)果，結(jié)果顯示，本方法制備的納米金探針能夠在高溫條件下保持絕大多數(shù)探針不脫落，顯示了本發(fā)明所述方法制備的納米金探針復(fù)合物具備高穩(wěn)定性。

實施例2

首先將納米金顆粒與含巰基探針(探針1序列：SH-(CH₂)₆-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM，SEQ ID NO.1)以一定比例混合(如以1:400)，加入表面活性劑如FSN-100，表面活性劑分別選擇FS-30、FS-31、FS-3100、FS-50、FSN-100進行比較，并加入磷酸鉀緩沖液和氯化鈉溶液混合均勻，室溫雜交孵育3h，離心洗滌后重懸于磷酸鉀緩沖液，加入含巰基穩(wěn)定劑如巰基甲氧基硅烷，室溫雜交孵育24h，結(jié)束后離心洗滌重懸于無離子水中備用。制備結(jié)束的納米金探針復(fù)合物分別采用DTT處理計算修飾探針數(shù)。

圖3為納米金探針功能復(fù)合物制備中表面活性劑選擇結(jié)果，結(jié)果顯示，本方法采用不同表面活性劑制備的納米金探針復(fù)合物修飾的探針數(shù)基本一致，不存在顯著性差異。

實施例3

首先將納米金顆粒與含巰基探針(探針1序列：SH-(CH₂)₆-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM，SEQ ID NO.1)以一定比例混合(如以1:400)，加入表面活性劑如FSN-100，并加入磷酸鉀緩沖液和氯化鈉溶液混合均勻，室溫雜交孵育3h，離心洗滌后重懸于緩沖液，加入含巰基穩(wěn)定劑如巰基甲氧基硅烷，室溫雜交孵育24h，結(jié)束后離心洗滌重懸于無離子水中備用。緩沖液分別選擇磷酸鉀緩沖液、Tris緩沖液、MOPS緩沖液。制備結(jié)束的納米金探針復(fù)合物分別采用DTT處理計算修飾探針數(shù)。

圖4為納米金探針功能復(fù)合物制備中緩沖液類型選擇結(jié)果，結(jié)果顯示，本方法采用不同緩沖液類型制備的納米金探針復(fù)合物修飾的探針數(shù)基本一致，不存在顯著性差異。

實施例4

分別取不同的含巰基探針，連接區(qū)M種類分別為亞甲基(M1)、乙二醇基(M2)，分別將納米金與含巰基探針(探針1序列：SH-(CH₂)₆-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM；探針2序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₆-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM)以一定比例混合(如以1:400)，加入表面活性劑如FSN-100，并加入磷酸鉀緩沖液和氯化鈉溶液混合均勻，室溫雜交孵育3h，離心洗滌后重懸于緩沖液，加入含巰基穩(wěn)定劑如巰基甲氧基硅烷，室溫雜交孵育24h，結(jié)束后離心洗滌重懸于無離子水中備用。制備結(jié)束的納米金探針復(fù)合物分別采用DTT處理計算修飾探針數(shù)。

圖5為納米金探針功能復(fù)合物連接區(qū)M種類(M1和M2)選擇結(jié)果，結(jié)果顯示，本方法采用不同連接區(qū)M種類制備的納米金探針復(fù)合物基本一致，不存在顯著性差異。

實施例5

分別取不同的含巰基探針，連接區(qū)M分別為3、6、12、18個乙二醇基基團，分別將納米金與含巰基探針(探針1序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₃-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM；探針2序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₆-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM；探針3序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₁₂-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM；探針4序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₁₈-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM)以一定比例混合(如以1:400)，加入表面活性劑如FSN-100，并加入磷酸鉀緩沖液和氯化鈉溶液混合均勻，室溫雜交孵育3h，離心洗滌后重懸于緩沖液，加入含巰基穩(wěn)定劑如巰基甲氧基硅烷，室溫雜交孵育24h，結(jié)束后離心洗滌重懸于無離子水中備用。制備結(jié)束的納米金探針復(fù)合物分別采用DTT處理計算修飾探針數(shù)。

圖6為納米金探針功能復(fù)合物連接區(qū)M數(shù)目的選擇結(jié)果，結(jié)果顯示，本方法采用不同連接區(qū)M不同數(shù)目乙二醇基基團的納米金探針復(fù)合物基本一致，不存在顯著性差異。圖中橫坐標(biāo)3、6、12、18分別為乙二醇基的個數(shù)。

實施例6

分別制備長度為15bp、25bp、35bp、45bp的含巰基探針，分別為探針a(探針2序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₃-AGC TGA AAT AAT GAT-FAM，SEQ ID NO.2)、探針b(探針3序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₃-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM，SEQ ID NO.3)、探針c(探針4序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₃-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT TAT TGG AAT TG-FAM，SEQ ID NO.4)、探針d(探針5序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₃-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT TAT TGG AAT TGA TGG AAT TGT-FAM，SEQ ID NO.5)。將納米金與含巰基探針以1:400比例混，加入FS-50表面活性劑，并加入磷酸鉀緩沖液和氯化鈉溶液混合均勻，室溫雜交孵育3h，離心洗滌后重懸于緩沖液，加入含巰基穩(wěn)定劑如巰基甲氧基硅烷，室溫雜交孵育24h，結(jié)束后離心洗滌重懸于無離子水中備用。制備結(jié)束的納米金探針復(fù)合物分別于Tris緩沖液條件下孵育在90℃條件下40分鐘后，計算納米金顆粒表面尚存留的核酸百分?jǐn)?shù)(納米金顆粒表面核酸總數(shù)采用DTT洗脫計算，為100％)。

圖7為納米金探針功能復(fù)合物制備中不同長度探針的制備結(jié)果，結(jié)果顯示，本方法采用不同長度探針均可制備成功納米金探針復(fù)合物。圖中a，b，c，d組分別對應(yīng)探針a，探針b，探針c，探針d。

實施例7

該反應(yīng)體系組成為10mM Tris緩沖液(pH 8.5)，1μM引物1(序列為：5’-TGC ATG GTA TTC TTT CTC TTC CGC ACC-3’，SEQ ID NO.6)，1μM引物2(序列為：5’-GGA ACG TAC TGG TGA AAA CAC CGC-3’，SEQ ID NO.7)，加入納米金探針功能復(fù)合物(探針序列：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAA AAA A-(CH₂O-CH₂O)₃-SH，SEQ ID NO.8)，0.5U Taq DNA聚合酶，0.2mM dNTP，向該體系中分別加入100pM、20pM、4pM、0.8pM、0.16pM及0pM的待測核酸(序列為：5’-GGA ACG TAC TGG TGA AAA CAC CGC AGC ATG TCA AGA TCA CAG ATT TTG GGC GGG CCA AAC TGC TGG GTG CGG AAG AGA AAG AAT ACC ATG CA -3’，SEQ ID NO.9)，與不加入納米金探針功能復(fù)合物的反應(yīng)進行對比，各管反應(yīng)總體積均為20μL，反應(yīng)程序為：94℃，2min；94℃，10s，72℃，40s，30循環(huán)；72℃，10min；10℃，2min。

反應(yīng)結(jié)束后進行電泳，結(jié)果示于圖8中。圖8的結(jié)果顯示本發(fā)明所述的納米金探針功能復(fù)合物不會影響PCR擴增反應(yīng)的正常發(fā)生。

實施例8

該反應(yīng)體系組成為10mM Tris緩沖液(pH 8.5)中加入兩種修飾的納米金探針功能復(fù)合物(探針序列1：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAA AAA A-(CH₂O-CH₂O)₆-SH，SEQ ID NO.8；探針序列2：SH-(CH₂O-CH₂O)₆-AAA AAA AAA AAT GAT TAT CAA TAT T，SEQ ID NO.10)各4μL，0.2μM雜交探針(序列為：5’-GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATC GTG ATG AAC CAT-3’，SEQ ID NO.11，各管反應(yīng)總體積均為20μL，反應(yīng)程序為：94℃，2min；94℃，10s，72℃，40s，30循環(huán)；72℃，10min；94℃，5s；55℃，30min；4℃，2min。

反應(yīng)結(jié)果示于圖9。圖9的結(jié)果顯示，所述的納米金探針功能復(fù)合物經(jīng)歷PCR熱循環(huán)前后所述納米金探針功能復(fù)合物穩(wěn)定性未受到影響。

實施例9

該反應(yīng)體系組成為10mM Tris緩沖液(pH 8.5)，0.2μM上游探針(序列為：5’-CTC TGC CAC CAG CTC CCA -3’，SEQ ID NO.12)，0.2μM下游探針(野生型探針序列為：5’-CGC GCC GAG GCG AAC TTG GGC GAG-3’，SEQ ID NO.13)，0.2μM雜交探針(序列為：5’-GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATC GTG ATG AAC CAT-3’，SEQ ID NO.11)，加入納米金探針功能復(fù)合物(探針序列1：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAA AAA A-(CH₂O-CH₂O)₆-SH，SEQ ID NO.8；探針序列2：SH-(CH₂O-CH₂O)₆-AAA AAA AAA AAT GAT TAT CAA TAT T，SEQ ID NO.10)，0.5U Taq DNA聚合酶，0.2mM dNTP，向該體系中分別加入100pM、20pM、4pM、0.8pM、0.16pM及0pM的待測核酸(序列為：5’-GGA ACG TAC TGG TGA AAA CAC CGC AGC ATG TCA AGA TCA CAG ATT TTG GGC GGG CCA AAC TGC TGG GTG CGG AAG AGA AAG AAT ACC ATG CA-3’，SEQ ID NO.6)，各管反應(yīng)總體積均為20μL，反應(yīng)程序為：94℃，1min；63℃，40min；55℃，30min；4℃，2min。

反應(yīng)結(jié)果示于圖10。圖10的結(jié)果顯示，與核酸侵入信號反應(yīng)同時存在而不會影響核酸侵入信號反應(yīng)的正常進行，即所述的納米金探針功能復(fù)合物能夠與核酸侵入信號反應(yīng)共存。

實施例10

該反應(yīng)體系組成為10mM Tris緩沖液(pH 8.5)，1μM引物1(序列為：5’-TGC ATG GTA TTC TTT CTC TTC CGC ACC-3’，SEQ ID NO.6)，1μM引物2(序列為：5’-GGA ACG TAC TGG TGA AAA CAC CGC-3’，SEQ ID NO.7)，0.2μM上游探針(序列為：5’-CTC TGC CAC CAG CTC CCA-3’，SEQ ID NO.12)，0.2μM下游探針(野生型探針序列為：5’-CGC GCC GAG GCG AAC TTG GGC GAG-3’，SEQ ID NO.13)，0.2μM雜交探針(序列為：5’-GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATC GTG ATG AAC CAT-3’，SEQ ID NO.11)，加入納米金探針功能復(fù)合物(探針序列1：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAA AAA A-(CH₂O-CH₂O)₆-SH，SEQ ID NO.8；探針序列2：SH-(CH₂O-CH₂O)₆-AAA AAA AAA AAT GAT TAT CAA TAT T，SEQ ID NO.10)，0.5U Taq DNA聚合酶，0.2mM dNTP，向該體系中分別加入5fM、500aM、50aM、5aM、2.5aM、500zM、50zM及0zM的待測核酸(序列為：5’-GGA ACG TAC TGG TGA AAA CAC CGC AGC ATG TCA AGA TCA CAG ATT TTG GGC GGG CCA AAC TGC TGG GTG CGG AAG AGA AAG AAT ACC ATG CA-3’，SEQ ID NO.9)，各管反應(yīng)總體積均為20μL，反應(yīng)程序為：94℃，2min；94℃，10s，72℃，40s，36循環(huán)；94℃，5s；63℃，40min；55℃，30min；4℃，2min。

反應(yīng)結(jié)果示于圖11。圖11的結(jié)果顯示，與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酸侵入信號反應(yīng)同時存在而不會影響聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酸侵入信號反應(yīng)的正常進行，即本發(fā)明中的納米金探針功能復(fù)合物能夠與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酸侵入信號反應(yīng)共存。

以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。