本發(fā)明屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及6種肽類抗原，可應(yīng)用于制備酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)抗體檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)血漿中天然肺癌相關(guān)抗體(lung cancer-associated antibody,LCAA)濃度。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是威脅整個(gè)人類健康的最主要?dú)⑹种??；诨姻察F霾等環(huán)境污染狀況的持續(xù)存在，中國人群主要癌癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國癌癥平均每年發(fā)病率高達(dá)3/1000以上。腫瘤早期治療手段，如手術(shù)切除或放射線治療已發(fā)展的比較成熟，能夠明顯延長(zhǎng)病人的存活時(shí)間。但是，如何預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和早期診斷腫瘤是有效防治腫瘤的重要途徑。
先前的研究表明，在惡性腫瘤體積發(fā)展到可用現(xiàn)代影像學(xué)技術(shù)檢出之前3-5年，患者血中可出現(xiàn)高濃度的腫瘤相關(guān)抗原自身抗體。因此，檢測(cè)血中腫瘤相關(guān)抗原自身抗體具有預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和早期診斷腫瘤的重要價(jià)值。在國外,已有早期診斷肺癌和乳腺癌的診斷試劑盒市售。例如，由英國諾丁漢Oncimmune有限公司推出的Early CDTTM-Lung診斷試劑盒已在北美和歐洲用于臨床早期診斷肺癌近6年。然而，目前所報(bào)道的抗體檢測(cè)方法敏感度相對(duì)低，特異性差，假陰性比率可高達(dá)60％以上。其中主要原因，是由于每一種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體在患者血中的陽性檢測(cè)率平均在10％左右，即便是多種抗原混合，陽性檢測(cè)率也難以突破50％。
近年來有關(guān)天然抗體研究報(bào)道顯示，人血中50％以上的抗體屬于天然抗體，主要由B1淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,不需要特異性抗原刺激。天然抗體參與機(jī)體的各種生理調(diào)節(jié)和免疫功能穩(wěn)定,并且充當(dāng)固有免疫和特異免疫系統(tǒng)之間的橋梁。特別值得注意的是，某些天然抗體具有免疫監(jiān)視功能，隨時(shí)清除體內(nèi)形成的惡性變細(xì)胞,以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。因此，保持一定水平的天然抗體可以起到防癌作用。據(jù)此推測(cè)，天然抗體缺乏或陰性者發(fā)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)可能明顯高于正常人群。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，健康人體內(nèi)會(huì)自然形成多種腫瘤相關(guān)抗體，例如與肺癌關(guān)相的抗白介素2受體A(Interleukin-2receptor subunit alpha，IL-2Rα或CD25)抗體，抗叉頭蛋白3(Forkhead/winged helix，F(xiàn)OXP3)抗體，抗腫瘤壞死因子A(Tumor necrosis facto alpha,TNFα)抗體，抗轉(zhuǎn)錄因子c-MYC蛋白(transcription factor c-MYC,MYC)抗體，抗膜粘連蛋白I(Annexin A1，ANXA1)抗體和抗細(xì)胞凋亡抑制基因5(Baculoviral IAP repeat-containing 5,BIRC5)抗體等。因此，本發(fā)明的主要目的是提供一組用于檢測(cè)人血漿中天然LCAA濃度的線性抗原多肽和由此制備的試劑盒，以及使用該組抗原多肽或該試劑盒檢測(cè)人血漿中天然LCAA的方法。所述抗原多肽為衍生于CD25、FOXP3、TNFα、MYC、ANXA1和BIRC5六種蛋白的抗原表位。這些抗原表位能夠與針對(duì)人血漿中抗CD25、抗FOXP3、抗TNFα、抗MYC、抗ANXA1和抗BIRC5的天然LCAA發(fā)生特異性結(jié)合。
本發(fā)明所定義的“肺癌相關(guān)抗體(LCAA)”是自然存在于健康人體內(nèi)的抗體或抗體混合物，可能參與包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生。檢測(cè)天然LCAA具有預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和早期診斷腫瘤的重要價(jià)值。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，所述天然LCAA是指能識(shí)別SEQ ID NO:1-6中的一個(gè)或多個(gè)表位序列的天然抗體或天然抗體混合物。
本發(fā)明人利用免疫信息學(xué)方法和表位制圖技術(shù)，分析CD25、FOXP3、TNFα、MYC、ANXA1和BIRC5六種蛋白序列上的人類白細(xì)胞二類抗原(Human leukocyte antigen II,HLA-II)表位，甄別具有高度親和力的氨基酸序列，進(jìn)而設(shè)計(jì)能被絕大多數(shù)人類抗原提呈細(xì)胞識(shí)別的HLA-II限制性表位及線性抗原多肽。
已經(jīng)公認(rèn)，抗原抗體的結(jié)合主要發(fā)生在抗原決定簇與抗體結(jié)合位點(diǎn)之間。因此，兩者在空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)型上越接近完全互補(bǔ)，抗原抗體的結(jié)合就越穩(wěn)定，特異性就越強(qiáng)，結(jié)合效率就越高，因此，目標(biāo)抗體(待檢測(cè)樣品中的抗體)及其結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)是先決因素，抗原決定簇可代表整個(gè)蛋白抗原與抗體結(jié)合狀態(tài)和親和特性。
本發(fā)明根據(jù)CD25、FOXP3、TNFα、MYC、ANXA1和BIRC5六種蛋白的生物學(xué)特性，針對(duì)這六種蛋白的多個(gè)表位進(jìn)行免疫信息學(xué)預(yù)測(cè)和模擬，經(jīng)分析與抗原性相關(guān)的各種參數(shù)，分別設(shè)計(jì)了六種在空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)型上與目標(biāo)抗體完全互補(bǔ)的線性抗原多肽，其氨基酸序列見表1。
表1.檢測(cè)人血漿中天然LCAA的線性抗原多肽序列
經(jīng)固相化學(xué)法合成上述6種抗原多肽，并按比例混合后制備ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，按設(shè)定的流程規(guī)范檢測(cè)健康個(gè)體血漿中天然LCAA濃度。上述6種抗原多肽在實(shí)際應(yīng)用中可制備成簡(jiǎn)單易用的便捷試劑盒，以玻璃、醫(yī)用塑料等非金屬材料真空密封包裝，4℃環(huán)境下可保存6個(gè)月以上。簡(jiǎn)言之，可將6種多肽抗原混合液包被的馬來酰亞胺(Maleimide)活化96孔微量檢測(cè)板在45度(45℃)烤箱中干燥后，用非金屬包裝材料真空密封包裝，制成試劑盒。優(yōu)選6種多肽抗原均為純度>90％的制品。
因此，根據(jù)本發(fā)明之一，提供了一種用于檢測(cè)天然LCAA的組合物，其包括如下6種抗原多肽：
H-DCKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKL-OH；
H-EPDDDPMQRKPTIRRKNLRKLRRKCAVPSSSWL-OH；
H-CQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLV-OH；
H-RIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESV-OH；
H-DWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCD-OH；
H-DVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYSKCD-OH。
在一些實(shí)施方案中，所述6種抗原多肽為高純度制品，優(yōu)選為純度>90％的化學(xué)合成制品。
在一些實(shí)施方案中，所述組合物中6種抗原多肽的比例為1:1:1:1:1:1(濃度比)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種用上述組合物制成的試劑盒。
在一些實(shí)施方案中，在所述試劑盒中，將6種抗原多肽混合液包被的馬來酰亞胺(Maleimide)活化96孔微量檢測(cè)板干燥后，用非金屬醫(yī)用包裝材料真空密封包裝。
在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非金屬醫(yī)用包裝材料為玻璃或醫(yī)用塑料。
在另一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括陽性對(duì)照和/或陰性對(duì)照。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種使用上述組合物或上述試劑盒檢測(cè)樣品中天然LCAA的方法，優(yōu)選該方法為體外的、非診斷目的的檢測(cè)技術(shù)。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將上述組合物中的6種抗原多肽等比混合，然后通過抗原抗體結(jié)合反應(yīng)檢測(cè)待測(cè)樣品中天然LCAA濃度。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述“通過抗原抗體結(jié)合反應(yīng)檢測(cè)個(gè)體血漿中天然LCAA濃度”是通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)方法實(shí)現(xiàn)的。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定為夾心法ELISA。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將上述組合物中的4種抗原多肽等比混合后，包被馬來酰亞胺(Maleimide)活化的96孔微量檢測(cè)板，放置4度過夜孵育，洗板，再對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)分析。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)包括分步加樣分析，所述分步加樣分析包括將待測(cè)樣品設(shè)雙復(fù)孔，同時(shí)設(shè)2個(gè)陰性對(duì)照孔和2個(gè)陽性對(duì)照孔，用分析液將血漿稀釋，并稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體，洗板，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及過氧化物酶混合液，室溫避光20～30分鐘，每孔添加50μl終止液10％硫酸溶液(12％H2SO4)，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度(OD)值，檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm，參考波長(zhǎng)為630nm。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述樣品為人血漿，更優(yōu)選為個(gè)體血漿。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，個(gè)體血漿為來自健康個(gè)體的血漿。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法的具體操作步驟為：
1.操作前，每種抗原用67％乙酸溶解為5毫克/毫升(mg/ml)儲(chǔ)存液,然后等體積混合并放置-20℃(誤差在±2℃范圍內(nèi))冰箱中保存。
2.操作開始時(shí)，首先將表1中所列6種抗原多肽的混合液用包被液稀釋為10～50微克/毫升(μg/ml)的工作液，該包被液為含0.15M氯化鈉和10mM EDTA的0.1M磷酸鹽緩沖液，pH為7.0～7.4之間。
3.用工作液包被馬來酰亞胺(Maleimide)活化的96孔微量檢測(cè)板(Thermo Scientific,美國)，4℃過夜孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液為含0.15M氯化鈉和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸鹽緩沖液，pH為7.0～7.4之間。
4.然后按一下步驟分步加樣和分析：
a)待測(cè)血漿樣品設(shè)雙復(fù)孔，另設(shè)2個(gè)陰性對(duì)照孔(NC，參照物為不含抗CD25抗體、抗FOXP3抗體、抗TNFα抗體、抗MYC抗體、抗ANXA1抗體和抗BIRC5抗體的陰性對(duì)照液，如牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司提供)，藉此可反映表1所述的6種多肽抗原在天然LCAA陰性反應(yīng)體系中的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)值)和2個(gè)陽性對(duì)照孔(PC，參照物為抗人CD25抗體、抗人FOXP3抗體、抗人TNFα抗體、抗人MYC抗體、抗人ANXA1抗體和抗人BIRC5抗體的等比混合物，藉此可反映表1所述的6種多肽抗原在天然LCAA陽性反應(yīng)體系中的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)值。
b)用分析液將待測(cè)血漿樣品1:200稀釋，所述分析液與抗原包被液相同，即含0.15M氯化鈉和10mM EDTA的0.1M磷酸鹽緩沖液，pH為7.0～7.4之間，每孔加100μl,25℃孵育1-2小時(shí)，然后洗板3遍。
c)用分析液(即含0.15M氯化鈉和10mM EDTA的0.1M磷酸鹽緩沖液，酸堿度為7.0～7.4之間)稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體(用以驗(yàn)證血漿中被檢測(cè)的物質(zhì)是否是特異性抗體)，抗體稀釋比例為1:10000～1:50000，每孔加100μl，25℃孵育1-2小時(shí)。
d)用洗液(即含0.15M氯化鈉和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸鹽緩沖液，pH值為7.0～7.4之間)洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及過氧化物酶混合液，室溫避光20～30分鐘。
e)每孔加50μl終止液10％硫酸溶液(10％H2SO4)，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度(OD)值，檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm，參考波長(zhǎng)為630nm。檢測(cè)過程在加入終止液后10分鐘內(nèi)完成，由此定量分析個(gè)體血漿中天然LCAA水平。
在一些實(shí)施方案中，在進(jìn)行群體隨機(jī)抽樣分析時(shí)，可針對(duì)每一個(gè)體檢測(cè)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用陽性樣品比值(Positive sample ratio，PSR)判定血漿中天然LCAA的相對(duì)水平。PSR計(jì)算方法如下：
PSR＝[待測(cè)樣品OD值–ODNC值]/[陽性標(biāo)準(zhǔn)品OD值–ODNC值]，NC為各樣本的陰性對(duì)照。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供上述組合物或試劑盒在體外的、非診斷目的檢測(cè)樣品中天然LCAA中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，還提供上述組合物在制備用于檢測(cè)樣品中天然LCAA的試劑中的應(yīng)用。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述樣品為人血漿，更優(yōu)選為個(gè)體血漿。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，個(gè)體血漿為來自健康個(gè)體的血漿。
基于以上方案，本發(fā)明提供了精度高、操作簡(jiǎn)易、成本適中的天然LCAA檢測(cè)技術(shù)，并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提供了對(duì)天然LCAA的半定量(或相對(duì)定量)的分析和應(yīng)用方案，進(jìn)而為發(fā)展基于健康人血漿天然LCAA的全新早期診斷腫瘤和早期實(shí)施治療策略奠定重要基礎(chǔ)。
本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便的人血漿天然LCAA檢測(cè)手段，可用于輔助定性、定量檢測(cè)天然LCAA水平，輔助量化測(cè)定不同群體(例如健康人群)和不同個(gè)體的血漿天然LCAA水平。天然LCAA水平較低或者陰性個(gè)體可能具有較高的腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，具有預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和早期診斷腫瘤的重要價(jià)值。用本發(fā)明產(chǎn)品檢測(cè)出的血漿天然LCAA陰性個(gè)體，可能具有較高的腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，可以對(duì)其進(jìn)行臨床隨訪和追蹤，達(dá)到早期發(fā)現(xiàn)腫瘤和早期實(shí)施治療的目的。本發(fā)明的天然LCAA檢測(cè)方法可用于群體普查，檢測(cè)獲得該項(xiàng)指標(biāo)的分布狀態(tài)及平均值，由此可為探究腫瘤發(fā)生過程中的呈現(xiàn)機(jī)制((如腫瘤免疫“逃逸”機(jī)制及免疫監(jiān)視機(jī)制等)提供關(guān)聯(lián)指標(biāo)。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的說明書中闡述，并且部分地從說明書中變得顯而易見，或者通過實(shí)施本發(fā)明而了解。本發(fā)明的主要目的和其它優(yōu)點(diǎn)可通過在說明書、權(quán)利要求書中所特別指出的方案來實(shí)現(xiàn)和獲得。
附圖說明
圖1是肺癌患者血漿中天然LCAA IgG水平的ROC曲線圖。
實(shí)施例
1、樣本收集
收集61份早期非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞癌(I期和II期鱗狀上皮肺癌和腺上皮肺癌)患者手術(shù)治療前的血漿樣品及108例健康人血漿樣品用于檢測(cè)血漿天然LCAA。操作前所有血漿樣品均在負(fù)80度(-80℃)條件下保存，經(jīng)核實(shí)保存時(shí)間未超過兩年，沒有反復(fù)凍融(次數(shù)不超過3次)。
2、樣本檢測(cè)
在4℃環(huán)境下解凍血漿樣品，本實(shí)驗(yàn)所采用的6條肽抗原(見表1)系由英國SEVERN BIOTECH有限公司合成，純度為95％，具體進(jìn)行如下操作步驟：
(1)操作前，每種抗原用67％乙酸溶解為5.7mg/ml儲(chǔ)存液,然后等體積混合并放置-20℃冰箱中保存。
(2)操作開始時(shí)，首先將6種抗原混合液用包被液稀釋為30微克/ml，該包被液為含0.15M氯化鈉和10mM EDTA的0.1M磷酸鹽緩沖液，測(cè)得酸堿度(pH值)為7.2。
(3)然后包被馬來酰亞胺(Maleimide)活化的96孔檢測(cè)板(Thermo Scientific,美國)，4℃過夜16.5小時(shí)孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液為含0.15M氯化鈉和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸鹽緩沖液，測(cè)得酸堿度pH值為7.2。
(4)然后分步加樣分析如下：
a)待測(cè)血漿樣本設(shè)雙復(fù)孔，另設(shè)2個(gè)陰性對(duì)照孔(NC，參照物為牛血清白蛋白，由Sigma-Aldrich公司提供)和2個(gè)陽性對(duì)照孔(PC，參照物為抗人CD25抗體、抗人FOXP3抗體、抗人TNFα抗體、抗人MYC抗體、抗人ANXA1抗體和抗人BIRC5抗體的等比混合物，由Sigma-Aldrich公司提供)。
b)用分析液將血漿1:200稀釋，所述分析液與抗原包被液相同，為含0.15M氯化鈉和10mM EDTA的0.1M磷酸鹽緩沖液，測(cè)得酸堿度(pH)為7.2，每孔加100μl，25℃孵育1.5小時(shí)。
c)以前述洗液(即含0.15M氯化鈉和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸鹽緩沖液，測(cè)得酸堿度為7.2)洗板3遍后，用分析液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG(由Sigma-Aldrich公司提供)，抗體工作濃度為1:30000，每孔加100μl，25℃孵育1.5小時(shí)。
d)以前述洗液(即含0.15M氯化鈉和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸鹽緩沖液，測(cè)酸堿度PH值為7.2)洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及過氧化物酶混合液(由Life Technologies公司提供)，室溫避光25分鐘。
e)每孔加50μl終止液12％硫酸溶液(12％H2SO4)，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度(OD)值，檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm，參考波長(zhǎng)為630nm，加入終止液后10分鐘內(nèi)檢測(cè)完畢，后續(xù)步驟將依據(jù)此結(jié)果針對(duì)每一個(gè)體進(jìn)行天然LCAA IgG的定量對(duì)比分析。
3.數(shù)據(jù)分析
針對(duì)前述檢測(cè)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)，采用陽性樣品比值(Positive sample ratio，PSR)判定血漿中天然LCAA IgG水平，PSR計(jì)算公式為：PSR＝[待測(cè)樣品OD值–ODNC值]/[陽性標(biāo)準(zhǔn)品OD值–ODNC值]，NC為各樣本的陰性對(duì)照。本方法的閾值是以健康對(duì)照組第5個(gè)百分位數(shù)的PSR值確定，低于該閾值的抗體水平被認(rèn)為是天然LCAA IgG水平呈陰性。本實(shí)施例隨機(jī)抽取的108份健康人血漿樣品中，其LCAA IgG濃度平均值為PSR＝0.67，變異系數(shù)為49％，用第5個(gè)百分位數(shù)確定的LCAA IgG血漿水平陰性閾值為0.12。
應(yīng)用接收者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線圖分析數(shù)據(jù)。在該曲線圖中，天然LCAA IgG水平呈陰性的血漿被定義為陽性樣品。ROC曲線是根據(jù)一系列不同的二分類方式確定分界值或決定閾，即以病人血漿樣品中真陽性率(靈敏度)為縱坐標(biāo)，以健康人血漿樣品中假陽性率(1-特異性)為橫坐標(biāo)繪制曲線。ROC曲線下的面積(AUC)值在1.0和0.5之間。在AUC>0.5的情況下，AUC越接近于1，說明診斷準(zhǔn)確度越好。ROC曲線將靈敏度與特異性以圖示方法結(jié)合在一起，可準(zhǔn)確反映某分析方法特異性和敏感性的關(guān)系，是試驗(yàn)準(zhǔn)確性的綜合代表。采用Analyse-it for Microsoft Excel軟件對(duì)前述檢測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬制ROC曲線，計(jì)算AUC值，判定靈敏度和特異性。
如圖1所示，肺癌患者血漿中天然LCAA IgG水平的ROC曲線下面積(AUC)為0.79(95％可信區(qū)間為0.67-0.90)，靈敏度為34.6％，特異性為97.1％。
以上所述僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)所想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。