本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及嘧啶類衍生物及其用途，更具體的，本發(fā)明涉及一種嘧啶類衍生物及其制備方法，以及其在制備藥物中的用途。

背景技術(shù)：

非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell carcinoma,NSCLC)與“非小細(xì)胞癌”同義。非小細(xì)胞型肺癌，包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌，與小細(xì)胞癌相比其癌細(xì)胞生長分裂較慢，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對較晚。非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80-85％。數(shù)據(jù)顯示，目前我國肺癌發(fā)病率每年增長26.9％，自2000年至2005年間，中國肺癌的發(fā)病人數(shù)估計(jì)增加12萬人。其中，男性肺癌病人從2000年的26萬人增加到2005年的33萬人，同期女性肺癌患者從12萬人增加到17萬人。此外，肺癌也成為全國多地區(qū)的“眾癌之首”。北京市肺癌發(fā)病率自2001年至2010年增長56％。十年間，北京新發(fā)癌癥患者中五分之一為肺癌患者；浙江省腫瘤醫(yī)院發(fā)布的2011年浙江省“癌譜”中，肺癌依然是排名第一的癌癥；廣州地區(qū)與30年前相比，肺癌發(fā)病率增長了7倍。

隨著分子醫(yī)學(xué)進(jìn)展和靶向藥物的不斷涌現(xiàn)，晚期NSCLC的治療已進(jìn)入到個(gè)體化治療的時(shí)代。目前臨床應(yīng)用的個(gè)體化靶向治療主要針對EGFR突變型和ALK(Anaplastic lymphoma kinase，間變性淋巴瘤激酶)融合基因型肺癌，這兩種基因變異型肺癌均具有明確的分子靶點(diǎn)、靶點(diǎn)檢測技術(shù)及上市的靶向藥物，臨床療效得到明顯提高。

間變性淋巴瘤激酶(ALK)是一種受體酪氨酸蛋白激酶，最早是在間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)的一個(gè)亞型中被發(fā)現(xiàn)的，因此定名為間變性淋巴瘤激酶(Anaplastic Lymphoma Kinase，ALK)(Science,1994,263,1281-1284；Oncogene,1994,9,1567-1574)。ALK融合基因是一種強(qiáng)致癌基因，是新發(fā)現(xiàn)的NSCLC驅(qū)動基因，其中棘皮動物微管相關(guān)類蛋白4(EML4-ALK)為最常見類型。ALK的基因異常(易位、點(diǎn)基因突變和基因擴(kuò)增)的結(jié)果，會導(dǎo)致產(chǎn)生與其他基因相融合的異常激酶并且參與癌變。ALK融合基因主要出現(xiàn)在不吸煙或少吸煙的肺腺癌患者。占NSCLC總數(shù)3％～5％的ALK陽性非小胞肺癌是2007年最新發(fā)現(xiàn)的分子亞型。

雖然人們已經(jīng)研究了大量的對蛋白激酶有抑制活性的化合物，且一些蛋白激酶抑制劑如克唑替尼等已經(jīng)上市用于NSCLC的治療，但是會產(chǎn)生耐藥性，存在一定程度的缺陷。EML4-ALK作為一個(gè)新的腫瘤癌癥融合基因的概念已被Pfizer第一代ALK抑制劑Crizotinib驗(yàn)證，基于臨床試驗(yàn)所表現(xiàn)出的約60％的客觀反應(yīng)率和約10個(gè)月的無進(jìn)展生存期的良好效果，導(dǎo)致了FDA的快速審批，于2011年11月成為第一個(gè)用于ALK陽性NSCLC的一線治療藥物。但是治療9到12個(gè)月時(shí)，患者會發(fā)生耐藥。目前認(rèn)為ALK激酶自身次級突變譜是繼發(fā)耐藥的原因之一，常見有L1196M，G1269A，S1206Y，G1202R，1151Tins，L11152R和C1156Y，臨床上被檢出頻率最高的次級突變是L1196M和G1269A。研究發(fā)現(xiàn)約有1/3的Crizotinib耐藥患者產(chǎn)生ALK次級突變，并且約有40％ALK陽性患者在繼續(xù)給予Crizotinib治療時(shí)無明顯進(jìn)展。而且，兩項(xiàng)克唑替尼臨床研究觀察到的最常見的不良反應(yīng)為視力障礙、惡心、腹瀉、嘔吐、水腫和便秘，不良反應(yīng)發(fā)生率≥25％。

作為第二代ALK抑制的LDK378由諾華公司開發(fā)，在早期的臨床試驗(yàn)中對88位以前應(yīng)用Crizotinib治療過的ALK非小細(xì)胞肺癌患者仍然有80％的反應(yīng)率。并且于2013年3月獲得FDA“突破性治療”稱號。研究發(fā)現(xiàn)LDK378抑制Crizotinib耐藥突變，并與2014年4月獲得FDA批準(zhǔn)用于治療對Crizitinib產(chǎn)生耐藥性的ALK陽性非小細(xì)胞肺癌患者，命名為Ceritinib，商品名為Zykadia。研究發(fā)現(xiàn)LDK378抑制Crizotinib耐藥突變，包括L1196M，G1269A，I1171T和S1206Y，但是該藥物沒有抑制G1202R和F1174C，還有一定局限性。同時(shí)Certinib臨床使用劑量大(750mg,P.O qday)。

因而，開發(fā)出更安全、高效的治療癌癥的新型ALK抑制劑藥物具有巨大的社會價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，也是目前各大醫(yī)藥企的研究熱點(diǎn)。通過對化合物結(jié)構(gòu)的修飾設(shè)計(jì)新的化合物結(jié)構(gòu)，改善其耐藥性和成藥性，從而提高生物活性和生物利用度，來尋找一類新的ALK抑制劑，對于臨床上因ALK突變引起的疾病治療具有重要意義。因此，目前的ALK抑制劑仍有待改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一或至少提供一種有用的商業(yè)選擇。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種能夠用于制備治療癌癥的藥物的化合物。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種化合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述化合物為式I所示化合物或式I所示化合物的藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、溶劑化物、代謝產(chǎn)物、或前藥，

其中，R₁為5-6元環(huán)烷基、5-6元雜環(huán)基、5-6元芳基、或5-6元雜芳基，任選地，所述5-6元環(huán)烷基、5-6元雜環(huán)基、5-6元芳基和5-6元雜芳基各自獨(dú)立地被一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、羥基、氰基、硝基、C_1-8烷基、C_2-8鏈烯基、C_2-8鏈炔基、C_3-8環(huán)烷基、3-8元雜環(huán)基、C_5-10芳基、5-10元雜芳基、C_1-6烷氧基、C_3-8環(huán)烷氧基、-S(O)pR₆、-C(O)R₆、-C(O)OR₆、-NR₇R₈或-C(O)NR₈的取代基取代，其中，R₆、R₇、R₈各自獨(dú)立地為氫或C_l-4烷基，p為0、1或2；

R₂為氫、鹵素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、鹵素取代的C_1-6烷基或鹵素取代的C_1-6烷氧基；

R₃為任選被取代的哌嗪基、任選被取代的嗎啉基、任選被取代的哌啶基、任選被取代的環(huán)己胺基、任選被取代的C_1-2烷基或任選被取代的1,2,3,6-四氫吡啶基，所述被取代的C_1-2烷基上的取代基為任選被取代的哌啶基；

R₄為氫或C_1-6烷基；

R₅為氫、氯、羥基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或鹵素取代的C_1-6烷氧基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₁為地被一個(gè)或多個(gè)-S(O)pR₆取代的5-6元雜環(huán)基、5-6元芳基、或5-6元雜芳基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₂為氫、鹵素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或鹵素取代的C_1-6烷氧基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₃為任選被取代的哌嗪基、任選被取代的嗎啉基、任選被取代的哌啶基、任選被取代的甲基或任選被取代的1,2,3,6-四氫吡啶基，所述任選被取代的甲基上的取代基為任選被取代的哌啶基；所述任選被取代的哌嗪基、任選被取代的嗎啉基、任選被取代的哌啶基或任選被取代的1,2,3,6-四氫吡啶基任選地被一個(gè)或多個(gè)選自C_1-6烷基、羥基、C_1-6烷基氨基、C_1-6烷氧基、氧代、C_1-6酰基、嗎啉基、C_1-6烷基嗎啉基、哌嗪基、C_1-6烷基哌嗪基、C_1-6?；哙夯涣u基C_1-6烷基哌嗪基、哌啶基和C_1-6烷基氨基哌啶基的取代基取代。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₄為氫或C_1-6烷基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₅為氯或鹵素取代的C_1-6烷氧基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₆為C_l-4烷基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，p為2。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₁為中的任意一種。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₂為氫、氯、甲基、甲氧基、乙氧基、異丙氧基或二氟甲氧基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₃為下列之一：

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，當(dāng)R₁為時(shí)，R₃可以為下列之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₄為氫或甲基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₅為氯或二氟甲氧基。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，根據(jù)本領(lǐng)域中使用的慣例，在本申請的結(jié)構(gòu)式中，用于描繪化學(xué)鍵，所述化學(xué)鍵為部分或取代基與核心結(jié)構(gòu)或骨架結(jié)構(gòu)相連的點(diǎn)。

由此，在本說明書通篇中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對式I所示化合物中所述R₁～R₅的基團(tuán)及其取代基、以及p進(jìn)行選擇，以提供本發(fā)明的實(shí)施例中所述的、穩(wěn)定的式I所示化合物或其可藥用鹽、水合物、溶劑化物、代謝產(chǎn)物或前藥。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明所述式I所示化合物可以為下列化合物之一，或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、溶劑化物、代謝產(chǎn)物、或前藥：

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，C_1-6選自C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆；C_1-8選自C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇和C₈；C_2-8選自C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇和C₈；C_3-8選自C₃、C₄、C₅、C₆、C₇和C₈；C_5-10選自C₅、C₆、C₇、C₈、C₉和C₁₀。這里所采用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”，是針對那些化合物、材料、組合物和/或劑型而言，它們在可靠的醫(yī)學(xué)判斷的范圍之內(nèi)，適用于與人類和動物的組織接觸使用，而沒有過多的毒性、刺激性、過敏性反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥，與合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱。

術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指本發(fā)明化合物的鹽，由本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的具有特定取代基的化合物與相對無毒的酸或堿制備。當(dāng)本發(fā)明的化合物中含有相對酸性的功能團(tuán)時(shí)，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的堿與這類化合物的中性形式接觸的方式獲得堿加成鹽。藥學(xué)上可接受的堿加成鹽包括鈉、鉀、鈣、銨、有機(jī)氨或鎂鹽或類似的鹽。當(dāng)本發(fā)明的化合物中含有相對堿性的官能團(tuán)時(shí)，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的酸與這類化合物的中性形式接觸的方式獲得酸加成鹽。藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的實(shí)例包括無機(jī)酸鹽，所述無機(jī)酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氫根、磷酸、磷酸一氫根、磷酸二氫根、硫酸、硫酸氫根、氫碘酸、亞磷酸等；以及有機(jī)酸鹽，所述有機(jī)酸包括如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸和甲磺酸等類似的酸；還包括氨基酸(如精氨酸等)的鹽，以及如葡糖醛酸等有機(jī)酸的鹽(參見Berge et al.,"Pharmaceutical Salts",Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19(1977))。本發(fā)明的某些特定的化合物含有堿性和酸性的官能團(tuán)，從而可以被轉(zhuǎn)換成任一堿或酸加成鹽。

優(yōu)選地，以常規(guī)方式使鹽與堿或酸接觸，再分離母體化合物，由此再生化合物的中性形式?；衔锏哪阁w形式與其各種鹽的形式的不同之處在于某些物理性質(zhì)，例如在極性溶劑中的溶解度不同。

本文所用的“藥學(xué)上可接受的鹽”屬于本發(fā)明化合物的衍生物，其中，通過與酸成鹽或與堿成鹽的方式修飾所述母體化合物。藥學(xué)上可接受的鹽的實(shí)例包括但不限于：堿基比如胺的無機(jī)酸或有機(jī)酸鹽、酸根比如羧酸的堿金屬或有機(jī)鹽等等。藥學(xué)上可接受的鹽包括常規(guī)的無毒性的鹽或母體化合物的季銨鹽，例如無毒的無機(jī)酸或有機(jī)酸所形成的鹽。常規(guī)的無毒性的鹽包括但不限于那些衍生自無機(jī)酸和有機(jī)酸的鹽，所述的無機(jī)酸或有機(jī)酸選自2-乙酰氧基苯甲酸、2-羥基乙磺酸、乙酸、抗壞血酸、苯磺酸、苯甲酸、碳酸氫根、碳酸、檸檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富馬酸、葡庚糖、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、氫溴酸、鹽酸、氫碘酸鹽、羥基、羥萘、羥乙磺酸、乳酸、乳糖、十二烷基磺酸、馬來酸、蘋果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、硝酸、草酸、雙羥萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、多聚半乳糖醛、丙酸、水楊酸、硬脂酸、亞乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、對氨基苯磺酸、硫酸、單寧、酒石酸和對甲苯磺酸。

本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽可由含有酸根或堿基的母體化合物通過常規(guī)化學(xué)方法合成。一般情況下，這樣的鹽的制備方法是：在水或有機(jī)溶劑或兩者的混合物中，經(jīng)由游離酸或堿形式的這些化合物與化學(xué)計(jì)量的適當(dāng)?shù)膲A或酸反應(yīng)來制備。一般地，優(yōu)選醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈等非水介質(zhì)。

除了鹽的形式，本發(fā)明所提供的化合物還存在前藥形式。本文所描述的化合物的前藥容易地在生理?xiàng)l件下發(fā)生化學(xué)變化從而轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的化合物?？稍隗w內(nèi)轉(zhuǎn)化以提供生物活性物質(zhì)(即式I所示化合物)的任何化合物是在本發(fā)明的范圍和主旨內(nèi)的前藥。例如，含有羧基的化合物可形成生理上可水解的酯，其通過在體內(nèi)水解以得到式I所示化合物本身而充當(dāng)前藥。所述前藥優(yōu)選口服給藥，這是因?yàn)樗庠谠S多情況下主要在消化酶的影響下發(fā)生。當(dāng)酯本身具有活性或水解發(fā)生在血液中時(shí)，可使用腸胃外給藥。此外，前體藥物可以在體內(nèi)環(huán)境中通過化學(xué)或生化方法被轉(zhuǎn)換到本發(fā)明的化合物。

本發(fā)明的某些化合物可以以非溶劑化形式或者溶劑化形式存在，包括水合物形式。一般而言，溶劑化形式與非溶劑化的形式相當(dāng)，都包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的某些化合物可以以多晶或無定形形式存在。

本發(fā)明的某些化合物可以具有不對稱碳原子(光學(xué)中心)或雙鍵。外消旋體、非對映異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體和單個(gè)的異構(gòu)體都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

本文中消旋體、ambiscalemic and scalemic或者對映體純的化合物的圖示法來自Maehr,J.Chem.Ed.1985,62:114-120。除非另有說明，用楔形鍵和虛線鍵表示一個(gè)立體中心的絕對構(gòu)型。當(dāng)本文所述化合物含有烯屬雙鍵或其它幾何不對稱中心，除非另有規(guī)定，它們包括E、Z幾何異構(gòu)體。同樣地，所有的互變異構(gòu)形式均包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的化合物可以存在特定的幾何或立體異構(gòu)體形式。本發(fā)明設(shè)想所有的這類化合物，包括順式和反式異構(gòu)體、(-)-和(+)-對對映體、(R)-和(S)-對映體、非對映異構(gòu)體、(D)-異構(gòu)體、(L)-異構(gòu)體，及其外消旋混合物和其他混合物，例如對映異構(gòu)體或非對映體富集的混合物，所有這些混合物都屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子。所有這些異構(gòu)體以及它們的混合物，均包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

可以通過手性合成或手性試劑或者其他常規(guī)技術(shù)制備光學(xué)活性的(R)-和(S)-異構(gòu)體以及D和L異構(gòu)體。如果想得到本發(fā)明某化合物的一種對映體，可以通過不對稱合成或者具有手性助劑的衍生作用來制備，其中將所得非對映體混合物分離，并且輔助基團(tuán)裂開以提供純的所需對映異構(gòu)體?；蛘?，當(dāng)分子中含有堿性官能團(tuán)(如氨基)或酸性官能團(tuán)(如羧基)時(shí)，與適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)活性的酸或堿形成非對映異構(gòu)體的鹽，然后通過本領(lǐng)域所公知的分步結(jié)晶法或色譜法進(jìn)行非對映異構(gòu)體拆分，然后回收得到純的對映體。此外，對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體的分離通常是通過使用色譜法完成的，所述色譜法采用手性固定相，并任選地與化學(xué)衍生法相結(jié)合(例如由胺生成氨基甲酸鹽)。

本發(fā)明的化合物可以在一個(gè)或多個(gè)構(gòu)成該化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素標(biāo)記化合物，比如氚(³H)，碘-125(¹²⁵I)或C-14(¹⁴C)。本發(fā)明的化合物的所有同位素組成的變換，無論放射性與否，都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

術(shù)語“賦形劑”通常是指配制有效的藥物組合物所需要載體、稀釋劑和/或介質(zhì)。

針對藥物或藥理學(xué)活性劑而言，術(shù)語“有效量”或“治療有效量”是指無毒的但能達(dá)到預(yù)期效果的藥物或藥劑的足夠用量。對于本發(fā)明中的口服劑型，組合物中一種活性物質(zhì)的“有效量”是指與該組合物中另一種活性物質(zhì)聯(lián)用時(shí)為了達(dá)到預(yù)期效果所需要的用量。有效量的確定因人而異，取決于受體的年齡和一般情況，也取決于具體的活性物質(zhì)，個(gè)案中合適的有效量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)試驗(yàn)確定。

術(shù)語“活性成分”、“治療劑”，“活性物質(zhì)”或“活性劑”是指一種化學(xué)實(shí)體，它可以有效地治療目標(biāo)紊亂、疾病或病癥。

術(shù)語“被取代的”是指特定原子上的任意一個(gè)或多個(gè)氫原子被取代基取代，包括重氫和氫的變體，只要特定原子的價(jià)態(tài)是正常的并且取代后的化合物是穩(wěn)定的。當(dāng)取代基為酮基(即＝O)時(shí)，意味著兩個(gè)氫原子被取代。酮取代不會發(fā)生在芳香基上。術(shù)語“任選被取代的”是指可以被取代，也可以不被取代，除非另有規(guī)定，取代基的種類和數(shù)目在化學(xué)上可以實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)上可以是任意的。

當(dāng)任何變量(例如R)在化合物的組成或結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)一次以上時(shí)，其在每一種情況下的定義都是獨(dú)立的。因此，例如，如果一個(gè)基團(tuán)被0-2個(gè)R所取代，則所述基團(tuán)可以任選地至多被兩個(gè)R所取代，并且每種情況下的R都有獨(dú)立的選項(xiàng)。此外，取代基和/或其變體的組合只有在這樣的組合會產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物的情況下才是被允許的。當(dāng)其中一個(gè)變量選自單鍵時(shí)，表示其連接的兩個(gè)基團(tuán)直接相連，比如A-L-Z中L代表單鍵時(shí)表示該結(jié)構(gòu)實(shí)際上是A-Z。

在本發(fā)明的上下文中，所有涉及到的術(shù)語“烷基”或“烷”或“烷基基團(tuán)”在此處可交換使用，其中，所述烷基可以任選地被一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明描述的取代基所取代。一些實(shí)施方案中，烷基基團(tuán)含有1-8個(gè)碳原子；另一些實(shí)施方案中，烷基基團(tuán)含有1-6個(gè)碳原子；另一些實(shí)施方案中，烷基基團(tuán)含有1-4個(gè)碳原子。烷基基團(tuán)的實(shí)例包含，但并不限于：甲基(Me、-CH₃)、乙基(Et、-CH₂CH₃)、正丙基(n-Pr、-CH₂CH₂CH₃)、異丙基(i-Pr、-CH(CH₃)₂)、正丁基(n-Bu、-CH₂CH₂CH₂CH₃)、異丁基(i-Bu、-CH₂CH(CH₃)₂)、仲丁基(s-Bu、-CH(CH₃)CH₂CH₃)、叔丁基(t-Bu、-C(CH₃)₃)、正戊基(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃)、2-戊基(-CH(CH₃)CH₂CH₂CH₃)、3-戊基(-CH(CH₂CH₃)₂)、2-甲基-2-丁基(-C(CH₃)₂CH₂CH₃)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH₃)CH(CH₃)₂)、3-甲基-1-丁基(-CH₂CH₂CH(CH₃)₂)、2-甲基-1-丁基(-CH₂CH(CH₃)CH₂CH₃)、正己基(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃)、2-己基(-CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂CH₃)、3-己基(-CH(CH₂CH₃)(CH₂CH₂CH₃))、2-甲基-2-戊基(-C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH₃)CH(CH₃)CH₂CH₃)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH₃)CH₂CH(CH₃)₂)、3-甲基-3-戊基(-C(CH₃)(CH₂CH₃)₂)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH₂CH₃)CH(CH₃)₂)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH₃)₂CH(CH₃)₂)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH₃)C(CH₃)₃)、正庚基、正辛基等。

術(shù)語“烷氧基”表示烷基基團(tuán)通過氧原子與分子其余部分相連，其中烷基基團(tuán)具有如本發(fā)明所述的含義。除非另外詳細(xì)說明，所述的烷氧基基團(tuán)含有1-6個(gè)碳原子。烷氧基基團(tuán)的實(shí)例包括，但并不限于：甲氧基(MeO、-OCH₃)、乙氧基(EtO、-OCH₂CH₃)、丙氧基(n-PrO、n-丙氧基、-OCH₂CH₂CH₃)、異丙基氧基(i-PrO、i-丙氧基、-OCH(CH₃)₂)、正丁氧基(n-BuO、n-丁氧基、-OCH₂CH₂CH₂CH₃)、1-甲基丙基氧基(s-BuO、s-丁氧基、-OCH(CH₃)CH₂CH₃)、2-甲基-l-丙氧基(i-BuO、i-丁氧基、-OCH₂CH(CH₃)₂)、叔丁基氧基(t-BuO、t-丁氧基、-OC(CH₃)₃)、正戊氧基(n-戊氧基、-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₃)、2-戊氧基(-OCH(CH₃)CH₂CH₂CH₃)、3-戊氧基(-OCH(CH₂CH₃)₂)、2-甲基-2-丁氧基(-OC(CH₃)₂CH₂CH₃)、3-甲基-2-丁氧基(-OCH(CH₃)CH(CH₃)₂)、3-甲基-l-丁氧基(-OCH₂CH₂CH(CH₃)₂)、2-甲基-l-丁氧基(-OCH₂CH(CH₃)CH₂CH₃)、正己氧基(n-己氧基、-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃)等等。

術(shù)語“環(huán)烷基”表示含有3-8個(gè)碳原子的，單價(jià)或多價(jià)的飽和單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)體系。其中，所述環(huán)烷基基團(tuán)可以任選地被一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明描述的取代基所取代。在一些實(shí)施方案中，環(huán)烷基包含3-8個(gè)碳原子。這樣的實(shí)例包括，但并不限于：環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基等。

術(shù)語“鹵素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。

術(shù)語“烷基氨基”包括“N-烷基氨基”和“N,N-二烷基氨基”，其中，氨基基團(tuán)分別獨(dú)立地被一個(gè)或兩個(gè)烷基基團(tuán)所取代。其中，烷基基團(tuán)具有如本發(fā)明所述的含義。合適的烷基氨基基團(tuán)可以是單烷基氨基或二烷基氨基，這樣的實(shí)例包括，但并不限于：N-甲氨基、N-乙氨基、異丙基氨基、丙氨基、叔丁基氨基、正丁氨基、1-甲基丙基氨基、正戊基氨基、正己基氨基、N,N-二甲氨基、N,N-二乙氨基等。

術(shù)語“C_1-6?；笔侵窻-C(＝O)-，其中R為C_1-6烷基，C_1-6烷基具有如本發(fā)明所述的含義。

術(shù)語“烷基嗎啉基”是指被一個(gè)或多個(gè)烷基取代的嗎啉基。

術(shù)語“C_1-6?；哙夯笔侵副灰粋€(gè)或多個(gè)C_1-6?；〈倪哙夯?。

術(shù)語“羥基C_1-6烷基哌嗪基”是指被一個(gè)或多個(gè)羥基取代的C_1-6烷基取代的哌嗪基。

術(shù)語“烷基氨基哌啶基”是指被一個(gè)或多個(gè)烷基取代的氨基取代的哌啶基。

術(shù)語“包含”為開放式表達(dá)，即包括本發(fā)明所指明的內(nèi)容，但并不排除其他方面的內(nèi)容。

本發(fā)明所述的各反應(yīng)步驟所使用的反應(yīng)溶劑沒有特別限制，任何在一定程度上能溶解起始原料并且不抑制反應(yīng)的溶劑均包含在本發(fā)明中。另外，本領(lǐng)域的許多類似改動，等同替換，或等同于本發(fā)明所描述的溶劑，溶劑組合，及溶劑組合的不同比例，均視為本發(fā)明的包含范圍。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種制備式Ι所示化合物的方法。本類化合物的通用合成方法是先合成嘧啶類母體，然后通過一個(gè)碳鏈與含氮類結(jié)構(gòu)連接而成。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提供一種制備式Ι所示化合物的方法，該制備方法包括如下步驟：式4A所示化合物與式5A所示化合物發(fā)生取代反應(yīng)，然后根據(jù)取代基的不同定義或脫保護(hù)基轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的式I化合物，得到式Ι所示化合物。

其中，R₁為5-6元環(huán)烷基、5-6元雜環(huán)基、5-6元芳基、或5-6元雜芳基，任選地，所述5-6元環(huán)烷基、5-6元雜環(huán)基、5-6元芳基和5-6元雜芳基各自獨(dú)立地被一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、羥基、氰基、硝基、C_1-8烷基、C_2-8鏈烯基、C_2-8鏈炔基、C_3-8環(huán)烷基、3-8元雜環(huán)基、C_5-10芳基、5-10元雜芳基、C_1-6烷氧基、C_3-8環(huán)烷氧基、-S(O)pR₆、-C(O)R₆、-C(O)OR₆、-NR₇R₈或-C(O)NR₈的取代基取代，其中，R₆、R₇、R₈各自獨(dú)立地為氫或C_l-4烷基，p為0、1或2；

R₂為氫、鹵素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、鹵素取代的C_1-6烷基或鹵素取代的C_1-6烷氧基；

R₃為任選被取代的哌嗪基、任選被取代的嗎啉基、任選被取代的哌啶基、任選被取代的環(huán)己胺基、任選被取代的C_1-2烷基或任選被取代的1,2,3,6-四氫吡啶基，所述被取代的C_1-2烷基上的取代基為任選被取代的哌啶基；

R₄為氫或C_1-6烷基；

R₅為氫、氯、羥基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或鹵素取代的C_1-6烷氧基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₁為被一個(gè)或多個(gè)-S(O)pR₆取代的5-6元雜環(huán)基、5-6元芳基、或5-6元雜芳基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₂為氫、鹵素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或鹵素取代的C_1-6烷氧基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₃為任選被取代的哌嗪基、任選被取代的嗎啉基、任選被取代的哌啶基、任選被取代的甲基或任選被取代的1,2,3,6-四氫吡啶基，所述任選被取代的甲基上的取代基為任選被取代的哌啶基；所述任選被取代的哌嗪基、任選被取代的嗎啉基、任選被取代的哌啶基或任選被取代的1,2,3,6-四氫吡啶基任選地被一個(gè)或多個(gè)選自C_1-6烷基、羥基、C_1-6烷基氨基、C_1-6烷氧基、氧代、C_1-6?；?、嗎啉基、C_1-6烷基嗎啉基、哌嗪基、C_1-6烷基哌嗪基、C_1-6?；哙夯?；羥基C_1-6烷基哌嗪基、哌啶基和C_1-6烷基氨基哌啶基的取代基取代。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₄為氫或C_1-6烷基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₅為氯或鹵素取代的C_1-6烷氧基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₆為C_l-4烷基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，p為2。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₁為中的任意一種。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₂為氫、氯、甲基、甲氧基、乙氧基、異丙氧基或二氟甲氧基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₃為下列之一：

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，當(dāng)R₁為時(shí)，R₃可以為下列之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₄為氫或甲基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，R₅為氯或二氟甲氧基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明所述式Ι所示化合物，是通過如下的合成路線制備得到的：

其中，R1、R2、R3、R4、R5如本發(fā)明所定義。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，使式II所示化合物與式III所示化合物發(fā)生的反應(yīng)可以是在有機(jī)溶劑中、存在對甲苯磺酸條件下、式II所示化合物與式III所示化合物接觸發(fā)生取代反應(yīng)。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，有機(jī)溶劑可以為正丁醇。由此，可以為式II所示化合物與式III所示化合物提供合適的反應(yīng)條件與環(huán)境，有利于提高目標(biāo)產(chǎn)物的收率和反應(yīng)效率，減少副反應(yīng)發(fā)生。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，式I所示化合物的合成路線為：

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，式I-23所示化合物的合成路線為：

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，式I-90所示化合物的合成路線為：

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，式I-89所示化合物的合成路線為：

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明實(shí)施例的合成方法能夠快速有效地制備式I所示化合物，且合成路線短、環(huán)境友好、目標(biāo)產(chǎn)物的收率和純度較高，原料易得、操作及后處理簡單、適合工業(yè)化生產(chǎn)。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有治療有效劑量的前述化合物。

“藥物組合物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學(xué)上/可藥用鹽或前體藥物與其他化學(xué)組分的混合物，或其他組分例如生理學(xué)/可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進(jìn)對生物體的給藥，利于活性成分的吸收進(jìn)而發(fā)揮生物活性。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，該藥物組合物含有前面所述的式I所示化合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物組合物用于抑制激酶；抑制間變性淋巴瘤激酶；治療或者預(yù)防癌癥；和/或抑制癌細(xì)胞的增殖。所述癌癥為肺癌和間變性大細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，優(yōu)選地，所述肺癌為非小細(xì)胞肺癌。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物組合物進(jìn)一步包括第二藥劑，所述第二藥劑不同于前面所述化合物并且用于抑制激酶、抑制間變性淋巴瘤激酶、治療或者預(yù)防癌癥和/或抑制癌細(xì)胞的增殖。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第二藥劑與前面所述化合物的聯(lián)用，使得所述藥物組合物更加有效地用于抑制激酶、抑制間變性淋巴瘤激酶、治療或者預(yù)防癌癥和/或抑制癌細(xì)胞的增殖。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，藥物組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑、輔劑、媒介物或其組合。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，藥物組合物呈片劑、膠囊、注射劑、粉針劑、粉劑、糖漿、溶液狀、懸浮液或氣霧劑。由此可以顯著提高該藥物組合物的適用性。并且本發(fā)明上述實(shí)施例的藥物組合物可以存在于適宜的固體或液體的載體或稀釋液中和適宜的用于注射或滴注的消毒器具中。

本發(fā)明的藥物組合物的各種劑型可按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)制備方法制備。本發(fā)明的化合物和藥物組合物可對哺乳動物臨床使用，包括人和動物，可以通過口、鼻、皮膚、肺或者胃腸道等的途徑給藥。不管采用何種服用方法，個(gè)人的最佳劑量應(yīng)依據(jù)具體的治療方案而定。通常情況下是從小劑量開始，逐漸增加劑量一直到找到最適合的劑量。最優(yōu)選的給藥途徑為口服。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了前面所述的化合物、前面所述的方法制備得到的化合物或前面所述的藥物組合物在制備藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述藥物用于下列至少之一：用作激酶抑制劑，抑制間變性淋巴瘤激酶、治療或者預(yù)防癌癥和抑制癌細(xì)胞的增殖。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，本發(fā)明所述式I所示化合物對ALK及ALKL1196M酶有明顯的抑制作用，并且對Karpas299細(xì)胞具有明顯的增殖抑制活性。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，本發(fā)明所述式I所示化合物對Ba/F3EML4-ALK細(xì)胞具有明顯的增殖抑制活性。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，在動力學(xué)溶解度測試中，本發(fā)明所述化合物具有良好的水溶性質(zhì)，且優(yōu)于陽性對照樣(本發(fā)明所述的對照樣為克唑替尼和LDK378)。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，在體外代謝穩(wěn)定性測試中，本發(fā)明所述化合物顯示出了良好的代謝穩(wěn)定性，為進(jìn)一步的臨床前研究提供了重要依據(jù)。

根據(jù)本發(fā)明的具體示例，在Caco-2實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明所述化合物相對于對照樣大大提高了透膜性，從而改善了化合物在腸道中的吸收性質(zhì)，并能提高藥物的生物利用度。

本發(fā)明所述化合物可用作ALK抑制劑，用于制備成抑制間變性淋巴瘤激酶的抗癌癥治療藥物。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，本發(fā)明所述的式I所示化合物在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用，其中所述癌癥為肺癌和間變性大細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，優(yōu)選地，所述癌癥為非小細(xì)胞肺癌。

因此，本發(fā)明所述藥物能夠有效作為ALK抑制劑，用于治療一種或一種以上與ALK活性有關(guān)的腫瘤疾病，所述腫瘤疾病包括但不限于肺癌。本發(fā)明所述的作為ALK抑制劑的嘧啶衍生物(式I所示化合物)，其作為ALK抑制劑，具有良好的臨床應(yīng)用和醫(yī)藥用途。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明的實(shí)施例提供了式I所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、溶劑化物、代謝物或前藥，制備式Ι所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、溶劑化物或前藥的方法和中間體、藥物組合物、以及本發(fā)明的化合物和藥物組合物在制備藥物中的用途。

實(shí)施例1式I-17所示化合物的制備流程

1、式3A-1所示化合物的制備

將式1A-1所示化合物(0.5g，2.92mmol)，式2A-1所示化合物(0.5g,2.52mmol)和碳酸鉀(807mg，5.84mmol)溶入無水DMF(10mL)中，加熱升溫到80℃，攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢，加入乙酸乙酯100毫升萃取，用飽和食鹽水洗三次，分液，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，所得式3A-1所示化合物粗品(0.8g，產(chǎn)率78.4％)無需純化，可直接用于下一步反應(yīng)。

2、式4A-1所示化合物的制備

式3A-1所示化合物(0.8g，2.28mmol)溶于THF/MeOH(v/v＝1:1,共20ml)和10ml飽和氯化銨水溶液，攪拌10min，分批加入鋅粉(1.6g)，室溫?cái)嚢?小時(shí)。TLC顯示反應(yīng)完全，過濾，濾液減壓濃縮，所得粗品經(jīng)柱層析分離得式4A-1所示化合物(600mg，產(chǎn)率82.3％)。

LCMS:t＝0.079min，292.3(M+H⁺)。

3、式I-17所示化合物的制備

將式4A-1所示化合物(42mg，0.131mmol)，式5A-1所示化合物(45mg，0.131mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(23mg，0.132mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法分離得到白色固體產(chǎn)物(30mg，產(chǎn)率41.1％)，即為式I-17所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ8.51(d,J＝8.3Hz,1H),8.08(s,1H),7.87(d,J＝8.0Hz,1H),7.63(dd,J＝16.9,8.0Hz,2H),7.31(t,J＝7.7Hz,2H),6.67(d,J＝2.2Hz,1H),6.51(dd,J＝8.7,2.1Hz,1H),3.84(s,3H),3.78-3.65(m,4H),3.20(m,2H),2.73(dd,J＝22.8,11.1Hz,2H),2.30-2.14(m,2H),2.13-2.07(m,2H),1.85–1.52(m,4H),1.22(dd,J＝12.8,6.5Hz,12H).

LCMS:t＝0.730min,629.3(M),630.3(M+1).

實(shí)施例2式I-12所示化合物的制備流程

將式4A-1所示化合物(41.85mg，0.131mmol)，式5A-2所示化合物(45.48mg，0.131mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(23mg，0.132mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(35mg，產(chǎn)率42.4％)，即為式I-12所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ9.11(d,J＝8.6Hz,1H),8.34(dd,J＝4.4,1.3Hz,1H),8.10(s,1H),7.49(dd,J＝12.8,6.5Hz,2H),6.68(d,J＝2.4Hz,1H),6.56(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),3.86–3.79(m,3H),3.79–3.72(m,2H),3.72–3.62(m,2H),3.46(d,J＝7.2Hz,1H),2.94(d,J＝11.0Hz,2H),2.72(t,J＝11.5Hz,2H),2.37(d,J＝11.4Hz,2H),2.04(d,J＝12.2Hz,2H),1.94(t,J＝10.9Hz,2H),1.66(ddd,J＝24.2,12.2,3.8Hz,3H),1.30(t,J＝4.8Hz,6H),1.16(d,J＝6.3Hz,6H).

LCMS:t＝0.718min,630.3(M).

實(shí)施例3式I-4所示化合物的制備流程

1、式3A-2所示化合物的制備

將式1A-1所示化合物(0.5g，2.92mmol)，式2A-2所示化合物(254.5mg,2.92.mmol)和碳酸鉀(1.21g，8.77mmol)溶入無水DMF(10mL)中，加熱升溫到80℃，攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢，加入乙酸乙酯100毫升萃取，用飽和食鹽水洗三次，分液，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，所得式3A-2所示化合物粗品(566mg，產(chǎn)率81.3％)無需純化，可直接用于下一步反應(yīng)。

2、式4A-1所示化合物的制備

式3A-2所示化合物(0.54g，2.28mmol)溶于THF/MeOH(v/v＝1:1,共20ml)和10ml飽和氯化銨水溶液，攪拌10min，分批加入鋅粉(1.6g),室溫?cái)嚢?小時(shí)。TLC顯示反應(yīng)完全，過濾，濾液減壓濃縮，所得粗品經(jīng)柱層析得式4A-2所示化合物(420mg，產(chǎn)率88.97％)。

3、式I-4所示化合物的制備

將式4A-2所示化合物(30mgmg，0.144mmol)，式5A-2所示化合物(50mg，0.144mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(24mg，0.145mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(27mg，產(chǎn)率36.1％)，即為式I-4所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ9.10(d,J＝8.6Hz,1H),8.34(dd,J＝4.4,1.3Hz,1H),8.10(s,1H),7.55–7.45(m,2H),6.67(s,1H),6.55(d,J＝7.3Hz,1H),3.85(dd,J＝8.7,3.9Hz,4H),3.83–3.74(m,4H),3.16(s,4H),1.30(d,J＝6.9Hz,6H).

LCMS:t＝0.927min,518.15(M),519.2(M+1)

實(shí)施例4式I-1所示化合物的制備流程

將式4A-2所示化合物(30mg，0.144mmol)，式5A-3所示化合物(50.7mg，0.144mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(24.8mg，0.144mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(25mg，產(chǎn)率33.1％)，即為式I-1所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ8.10(s,1H),8.06(s,1H),7.81(d,J＝5.5Hz,1H),7.54(d,J＝8.6Hz,1H),6.67(d,J＝2.4Hz,1H),6.56(dd,J＝8.7,2.2Hz,1H),3.86(dd,J＝13.1,8.4Hz,4H),3.82(s,3H),3.36(dt,J＝13.6,6.8Hz,1H),3.20–3.08(m,4H),1.30(t,J＝7.8Hz,6H).

LCMS:t＝0.799min,523.1(M),524.2(M+1)

實(shí)施例5式I-5所示化合物的制備流程

1、式3A-3所示化合物的制備

將式1A-1所示化合物(0.5g，2.92mmol)，式2A-3所示化合物(0.30g,2.92mmol)和碳酸鉀(1.21g，8.77mmol)溶入無水DMF(10mL)中，加熱升溫到80℃，攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢，加入乙酸乙酯100毫升萃取，用飽和食鹽水洗三次，分液，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，所得式3A-3所示化合物粗品(0.61g，產(chǎn)率83.3％)無需純化，可直接用于下一步反應(yīng)。

2、式4A-3所示化合物的制備

式3A-3所示化合物(0.57g，2.28mmol)溶于THF/MeOH(v/v＝1:1,共20ml)和10ml飽和氯化銨水溶液，攪拌10min，分批加入鋅粉(1.6g),室溫?cái)嚢?小時(shí)。TLC顯示反應(yīng)完全，過濾，濾液減壓濃縮，所得粗品經(jīng)柱層析得式4A-3所示化合物(406mg，產(chǎn)率80.8％)。

3、式I-4所示化合物的制備

將式4A-3所示化合物(30mg，0.135mmol)，式5A-2所示化合物(47mg，0.135mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(23.3mg，0.135mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(59mg，產(chǎn)率81.8％)，即為式I-5所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ9.09(d,J＝8.2Hz,1H),8.33(dd,J＝4.3,1.2Hz,1H),8.09(s,1H),7.54(d,J＝8.7Hz,1H),7.48(dd,J＝8.7,4.3Hz,1H),6.67(d,J＝2.2Hz,1H),6.54(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),3.89–3.73(m,4H),3.27(dd,J＝9.3,4.9Hz,4H),2.89–2.73(m,4H),2.49(s,3H),1.30(d,J＝6.9Hz,6H).

LCMS:t＝0.662min,532.3(M),534.3(M+1).

實(shí)施例6式I-13所示化合物的制備流程

將式4A-3所示化合物(30mg，0.135mmol)，式5A-1所示化合物(47mg，0.135mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(23.3mg，0.135mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(56mg，產(chǎn)率77.8％)，即為式I-13所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ8.49(d,J＝8.4Hz,1H),8.07(s,1H),7.86(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.67(d,J＝8.7Hz,1H),7.60(dd,J＝11.5,4.3Hz,1H),7.30(t,J＝7.6Hz,1H),6.67(s,1H),6.49(dd,J＝8.7,2.1Hz,1H),3.84(s,3H),3.29–3.20(m,4H),2.97–2.80(m,4H),2.55(s,3H),1.23(d,J＝6.8Hz,6H).

LCMS:t＝0.685min,531.3(M),532.3(M+1)

實(shí)施例7式I-2所示化合物的制備流程

將式4A-3所示化合物(30mg，0.135mmol)，式5A-3所示化合物(48mg，0.135mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(23mg，0.132mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(25mg，產(chǎn)率34.3％)，即為式I-2所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ8.11(s,1H),8.05(s,1H),7.81(d,J＝5.5Hz,1H),7.57(d,J＝8.6Hz,1H),6.68(d,J＝2.3Hz,1H),6.57(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),3.83(s,3H),3.42–3.34(m,1H),3.29(s,4H),2.89(s,4H),2.55(s,3H),1.30(d,J＝6.7Hz,6H).

LCMS:t＝0.690min,537.2(M),538.2(M+1).

實(shí)施例8式I-8所示化合物的制備流程

1、式3A-4所示化合物的制備

將式1A-1所示化合物(0.5g，2.92mmol)，式2A-4所示化合物(0.497,2.92mmol)和碳酸鉀(1.21g，8.77mmol)溶入無水DMF(10mL)中，加熱升溫到80℃，攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢，加入乙酸乙酯100毫升萃取，用飽和食鹽水洗三次，分液，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，所得式3A-4所示化合物粗品(0.756g，產(chǎn)率80.5％)無需純化，可直接用于下一步反應(yīng)。

2、式4A-4所示化合物的制備

式3A-4所示化合物(0.73g，2.28mmol)溶于THF/MeOH(v/v＝1:1,共20ml)和10ml飽和氯化銨水溶液，攪拌10min，分批加入鋅粉(1.6g),室溫?cái)嚢?小時(shí)。TLC顯示反應(yīng)完全，過濾，濾液減壓濃縮，所得粗品經(jīng)柱層析得式4A-4所示化合物(536mg，產(chǎn)率80.98％)。

3、式I-4所示化合物的制備

將式4A-4所示化合物(40mg，0.137mmol)，式5A-3所示化合物(48mg，0.137mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(24mg，0.137mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(25mg，產(chǎn)率30％)，即為式I-8所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ8.20(s,1H),8.04(d,J＝4.9Hz,2H),7.48(d,J＝8.3Hz,1H),7.14(s,1H),6.99(d,J＝8.2Hz,1H),4.11(d,J＝13.3Hz,2H),3.97(t,J＝12.4Hz,2H),3.94–3.81(m,5H),3.60(d,J＝11.9Hz,3H),3.45(dt,J＝13.6,6.8Hz,1H),3.28–3.21(m,2H),2.43(d,J＝12.7Hz,2H),2.17(d,J＝11.8Hz,2H),1.30(dd,J＝15.3,5.5Hz,6H).

LCMS:t＝0.693min,607.3(M),608.3(M+1),609.3(M+2).

實(shí)施例9式I-7所示化合物的制備流程

將式4A-4所示化合物(40mg，0.137mmol)，式5A-2所示化合物(47mg，0.137mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(24mg，0.137mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(23mg，產(chǎn)率27.8％)，即為式I-7所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ9.11(d,J＝8.0Hz,1H),8.34(dd,J＝4.4,1.4Hz,1H),8.10(s,1H),7.49(dd,J＝12.8,6.5Hz,2H),6.68(d,J＝2.5Hz,1H),6.56(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),3.88–3.80(m,4H),3.75(dd,J＝13.4,9.0Hz,6H),2.83–2.60(m,6H),2.42(t,J＝11.4Hz,1H),2.07(d,J＝12.2Hz,2H),1.66(ddd,J＝24.2,12.4,4.0Hz,2H),1.29(t,J＝7.0Hz,6H).

LCMS:t＝0.682min,602.2(M),603.2(M+1).

實(shí)施例10式I-6所示化合物的制備流程

1、式3A-5所示化合物的制備

將式1A-1所示化合物(0.5g，2.92mmol)，式2A-5所示化合物(0.375,2.92mmol)和碳酸鉀(1.21g，8.77mmol)溶入無水DMF(10mL)中，加熱升溫到80℃，攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢，加入乙酸乙酯100毫升萃取，用飽和食鹽水洗三次，分液，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，所得式3A-5所示化合物粗品(0.684g，產(chǎn)率83.8％)無需純化，可直接用于下一步反應(yīng)。

2、式4A-5所示化合物的制備

式3A-5所示化合物(0.64g，2.28mmol)溶于THF/MeOH(v/v＝1:1,共20ml)和10ml飽和氯化銨水溶液，攪拌10min，分批加入鋅粉(1.6g)，室溫?cái)嚢?小時(shí)。TLC顯示反應(yīng)完全，過濾，濾液減壓濃縮，所得粗品經(jīng)柱層析得式4A-5所示化合物(450mg，產(chǎn)率78.7％)。

3、式I-6所示化合物的制備

將式4A-5所示化合物(50mg，0.200mmol)，式5A-2所示化合物(70mg，0.200mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(35mg，0.200mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(78mg，產(chǎn)率69.4％)，即為式I-6所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ9.11(d,J＝6.9Hz,1H),8.36–8.31(m,1H),8.09(d,J＝3.6Hz,1H),7.58–7.45(m,2H),6.67(t,J＝2.8Hz,1H),6.57–6.50(m,1H),3.92–3.76(m,6H),3.40–3.31(m,1H),2.90(s,6H),2.79(m,2H),2.18(m,2H),1.87(m,2H),1.29(t,J＝6.6Hz,6H).

LCMS:t＝0.807min,559.2(M),560.2(M+1)

實(shí)施例11式I-14所示化合物的制備流程

將式4A-5所示化合物(50mg，0.200mmol)，式5A-1所示化合物(69mg，0.200mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(35mg，0.200mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(58mg，產(chǎn)率51.7％)，即為式I-14所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ8.52(d,J＝8.4Hz,1H),8.08(s,1H),7.87(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.66(d,J＝8.7Hz,1H),7.62(t,J＝7.2Hz,1H),7.31(t,J＝7.2Hz,1H),6.68(s,1H),6.51(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),3.82-3.79(m,5H),3.27–3.17(m,1H),2.85(s,6H),2.78-2.72(m,3H),2.16-2.11(m,2H),1.84-1.79(m,2H),1.24(d,J＝6.8Hz,6H).

LCMS:t＝0.692min,559.3(M).

實(shí)施例12式I-3所示化合物的制備流程

將式4A-5所示化合物(30mg，0.120mmol)，式5A-3所示化合物(42mg，0.120mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(21mg，0.121mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(20mg，產(chǎn)率29.4％)，即為式I-3所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ8.31(s,1H),8.22(d,J＝10.3Hz,1H),8.04(d,J＝4.8Hz,1H),7.59–7.41(m,1H),7.19(s,1H),7.03(d,J＝7.7Hz,1H),4.00–3.86(m,5H),3.74–3.54(m,1H),3.44(m,3H),2.95(s,6H),2.53–2.29(m,2H),2.18(m,2H),1.31(t,J＝10.4Hz,6H).

LCMS:t＝0.689min,565.3(M),566.3(M+1).

實(shí)施例13式I-9所示化合物的制備流程

1、式3A-6所示化合物的制備

將式1A-1所示化合物(0.5g，2.92mmol)，式2A-6所示化合物(0.295g,2.92mmol)和碳酸鉀(1.21g，8.77mmol)溶入無水DMF(10mL)中，加熱升溫到80℃，攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢，加入乙酸乙酯100毫升萃取，用飽和食鹽水洗三次，分液，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，所得式3A-6所示化合物粗品(0.6g，產(chǎn)率81.4％)無需純化，可直接用于下一步反應(yīng)。

2、式4A-6所示化合物的制備

式3A-6所示化合物(0.58g，2.28mmol)溶于THF/MeOH(v/v＝1:1,共20ml)和10ml飽和氯化銨水溶液，攪拌10min，分批加入鋅粉(1.6g)室溫?cái)嚢?小時(shí)。TLC顯示反應(yīng)完全，過濾，濾液減壓濃縮，所得粗品經(jīng)柱層析得式4A-6所示化合物(411mg，產(chǎn)率80.4％)。

3、式I-9所示化合物的制備

將式4A-6所示化合物(30mg，0.135mmol)，式5A-2所示化合物(47mg，0.135mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(24mg，0.135mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(41mg，產(chǎn)率57％)，即為式I-9所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ8.65(dd,J＝5.4,4.3Hz,2H),8.32(s,1H),7.82–7.68(m,2H),7.47(d,J＝2.4Hz,1H),7.21(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),4.12(m,1H),4.04–3.91(m,4H),3.84(m,2H),3.65(m,2H),2.39–2.23(m,2H),2.12–2.03(m,2H),1.36–1.22(m,6H).

LCMS:t＝0.679min,533.2(M),534.3(M+1).

實(shí)施例14式I-16所示化合物的制備流程

將式4A-6所示化合物(30mg，0.135mmol)，式5A-3所示化合物(47mg，0.135mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(24mg，0.135mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(28mg，產(chǎn)率38.5％)，即為式I-16所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ8.10(s,1H),8.05(s,1H),7.80(d,J＝5.5Hz,1H),7.51(d,J＝8.7Hz,1H),6.69(d,J＝2.5Hz,1H),6.59(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),3.82(s,3H),3.80–3.72(m,1H),3.64–3.50(m,2H),3.35(dd,J＝13.6,6.8Hz,1H),2.98–2.83(m,2H),2.05–1.91(m,2H),1.75–1.58(m,2H),1.31(d,J＝6.8Hz,6H).

LCMS:t＝0.734min,538.2(M),539.2(M+1)

實(shí)施例15式I-10所示化合物的制備流程

1、式3A-7所示化合物的制備

將式1A-1所示化合物(0.5g，2.92mmol)，式2A-7所示化合物(0.53,2.92mmol)和碳酸鉀(1.21g，8.77mmol)溶入無水DMF(10mL)中，加熱升溫到80℃，攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢，加入乙酸乙酯100毫升萃取，用飽和食鹽水洗三次，分液，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，所得式3A-7所示化合物粗品(0.826g，產(chǎn)率84.5％)無需純化，可直接用于下一步反應(yīng)。

2、式4A-7所示化合物的制備

式3A-7所示化合物(0.76g，2.28mmol)溶于THF/MeOH(v/v＝1:1,共20ml)和10ml飽和氯化銨水溶液，攪拌10min，分批加入鋅粉(1.6g)室溫?cái)嚢?小時(shí)。TLC顯示反應(yīng)完全，過濾，濾液減壓濃縮，所得粗品經(jīng)柱層析得式4A-7所示化合物(566mg，產(chǎn)率81.8％)。

3、式I-10所示化合物的制備

將式4A-7所示化合物(40mg，0.131mmol)，式5A-2所示化合物(45.6mg，0.131mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(23mg，0.132mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(30mg，產(chǎn)率37.11％)，即為式I-10所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ9.10(d,J＝8.3Hz,1H),8.33(d,J＝4.3Hz,1H),8.09(d,J＝2.3Hz,1H),7.57–7.41(m,2H),6.66(d,J＝2.3Hz,1H),6.54(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),3.92–3.62(m,6H),3.21–2.81(m,7H),2.73(dd,J＝24.5,12.5Hz,3H),2.65(s,3H),2.04(d,J＝11.9Hz,2H),1.71(dt,J＝11.7,8.6Hz,2H),1.29(t,J＝6.8Hz,6H).

LCMS:t＝0.665min,615.3(M),616.2(M+1)

實(shí)施例16式I-11所示化合物的制備流程

將式4A-7所示化合物(40mg，0.131mmol)，式5A-3所示化合物(46mg，0.131mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(23mg，0.132mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(18mg，產(chǎn)率22％)，即為式I-11所示化合物。

實(shí)施例17式I-15所示化合物的制備流程

1、式3A-8所示化合物的制備

將式1A-1所示化合物(0.5g，2.92mmol)，式2A-8所示化合物(0.617,2.92mmol)和碳酸鉀(1.21g，8.77mmol)溶入無水DMF(10mL)中，加熱升溫到80℃，攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢，加入乙酸乙酯100毫升萃取，用飽和食鹽水洗三次，分液，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，所得式3A-8所示化合物粗品(0.856g，產(chǎn)率80.8％)無需純化，可直接用于下一步反應(yīng)。

2、式4A-8所示化合物的制備

式3A-8所示化合物(0.83g，2.28mmol)溶于THF/MeOH(v/v＝1:1,共20ml)和10ml飽和氯化銨水溶液，攪拌10min，分批加入鋅粉(1.6g)，室溫?cái)嚢?小時(shí)。TLC顯示反應(yīng)完全，過濾，濾液減壓濃縮，所得粗品經(jīng)柱層析得式4A-8所示化合物(650mg，產(chǎn)率85.4％)。

3、式I-15所示化合物的制備

將式4A-8所示化合物(40mg，0.120mmol)，式5A-2所示化合物(42mg，0.120mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(21mg，0.120mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(20mg，產(chǎn)率25.8％)，即為式I-15所示化合物。

實(shí)施例18式I-18所示化合物的制備流程

將式4A-8所示化合物(40mg，0.120mmol)，式5A-3所示化合物(42mg，0.120mmol)溶于正丁醇(2mL)中,攪拌下加入對甲苯磺酸(21mg，0.120mmol)，加熱升溫至100℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)，TLC檢測顯示反應(yīng)完畢，減壓濃縮，所得粗品用柱層析法純化分離得到類白色固體產(chǎn)物(16mg，產(chǎn)率20.5％)，即為式I-18所示化合物。

實(shí)施例19 5-氯-N²-(4-(4-(異丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯基)-N⁴-(2-(異丙基磺?；?吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(式I-23所示化合物)的制備

制備路線：

將2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-4-胺(183mg,0.527mmol)和4-(4-異丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯胺(131mg,0.527mmol)溶于n-BuOH(2.5ml)，并向其中加入對甲苯磺酸(91mg,0.527mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，粗品經(jīng)柱層析分離純化得黃色固體159mg，產(chǎn)率53.8％，即為式I-23所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ10.06(s,1H),9.18(d,J＝8.4Hz,1H),8.36(s,1H),8.14(s,1H),7.88(d,J＝8.0Hz,1H),7.43(s,1H),7.19(s,1H),6.56(s,1H),6.50(d,J＝8.0Hz,1H),3.86(s,4H),3.23(s,4H),2.76(s,5H),1.37(d,J＝6.4Hz,6H),1.14(d,J＝4.4Hz,6H).

LCMS:t＝3.17min,560.1(M+H+).

其中，本實(shí)施例中所述4-(4-異丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯胺(式1所示化合物)

其合成路線及制備方法如下：

第一步：4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的制備

將化合物4-氟-2-甲氧基-1硝基苯(3g,17.53mmol)溶于10毫升DMF,在攪拌下加入叔丁基哌嗪-1-羧酸酯(3.59g,19.28mmol)和碳酸銫(17.14g,52.6mmol)，加熱至80℃反應(yīng)過夜。監(jiān)測反應(yīng)完后，冷卻至室溫，加入100mL水稀釋并用DCM/i-PrOH(3:1)萃取(50mL×3)，合并的有機(jī)相經(jīng)飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后，過濾蒸除溶劑后得到黃色油狀的產(chǎn)品5.4g，產(chǎn)率91％。

LCMS:t＝3.88min,282.0(M-55).

第二步：1-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌嗪的制備

將化合物4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(5.4g,16.01mmol)溶于二氯甲烷(15mL)。在室溫?cái)嚢柘侣尤肴宜?5mL)，反應(yīng)在室溫?cái)嚢柽^夜，旋干溶劑得到黑色油狀產(chǎn)品3.8g，產(chǎn)率100％。

第三步：1-異丙基-4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌嗪的制備

將化合物1-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌嗪三氟乙酸鹽(3.8g,16mmol)溶于15毫升DMF后，在攪拌下依次加入碳酸鉀(6.64g,48.0mmol)和異丙基溴(4.53ml,32.0mmol)。加熱至80℃攪拌4小時(shí)。TLC監(jiān)測完畢后，冷卻至室溫，加水稀釋并用EtOAc萃取。有機(jī)相經(jīng)水洗，無水硫酸鈉干燥后，過濾旋干，經(jīng)柱層析純化分離得到綠色油狀產(chǎn)品4.2g，產(chǎn)率52％。

LCMS:t＝1.57min,280.1(M+H⁺).

第四步：4-(4-異丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯胺的制備

將化合物1-異丙基-4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌嗪(4.2g,11.73mmol)溶在50毫升甲醇中，氮?dú)庵脫Q后，加入鈀碳(125mg)。氫氣置換，在氫氣氛圍室溫?cái)嚢柽^夜。TLC監(jiān)測完畢后，過濾除去碳鈀，母液減壓濃縮得到黑色油狀的產(chǎn)品0.4g，產(chǎn)率13％。

LCMS:t＝0.43min,250.1(M+H⁺).

實(shí)施例20：5-氯-N²-(4-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)-2-異丙氧苯基-N⁴-(2-(異丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(式I-91所示化合物)的制備

制備路線：

將2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-4-胺(150mg,0.43mmol)和1-(4-胺基-3-異丙氧苯基)-N,N-二甲基氨基哌啶-4-胺(式9所示化合物)(120mg,0.43mmol)溶于正丁醇(1.5mL)，并向反應(yīng)液中加入對甲苯磺酸(74mg,0.43mmol)，升溫至115攝氏度，攪拌反應(yīng)5小時(shí)。TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，減壓蒸除溶劑后，將粗品溶于二氯己烷，經(jīng)飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得粗品，經(jīng)柱層析分離純化得到淺綠色的固體產(chǎn)物100mg，產(chǎn)率39.4％，即為式I-91所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：δ10.04(s,1H),9.17(d,J＝8.8Hz,1H),8.38(d,J＝4.4Hz,1H),8.15(s,1H),7.96(d,J＝8.8Hz,1H),7.45(dd,J＝8.8,4.4Hz,1H),7.31(s,1H),6.53(s,1H),6.46(d,J＝9.2Hz,1H),4.75-4.44(m,2H),3.69(d,J＝12.0Hz,3H),3.15(s,2H),2.78(s,6H),2.26(d,J＝9.6Hz,2H),2.00-1.86(m,2H),1.37(t,J＝5.6Hz,12H).

LCMS：t＝3.39min，588.2(M+H⁺),294.7(M/2+H⁺).

其中，本實(shí)施例中所述1-(4-氨基-3-異丙氧基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(式9所示化合物)

其合成路線及制備方法如下：

第一步：2-異丙氧基-4-氟-1-硝基苯的制備

將化合物2,4-二氟-1-硝基苯(5.0g,31.43mmol)溶于異丙醇(60mL)并加入碳酸銫(30.64g,94.29mmol)，加熱至80℃攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，加水稀釋并用DCM萃取，合并的有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾旋干，經(jīng)層析柱分離純化得到白色固體產(chǎn)品5.2g，產(chǎn)率83％.

第二步：1-(3-異丙氧基-4-硝基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺的制備

將化合物4-氟-2-異丙氧基-1-硝基苯(5g,25.1mmol)溶于DMF(60mL)，加入N,N-二甲基派啶-4-胺鹽酸鹽(3.54g,27.61mmol)和碳酸鉀(10.41g,75.31mmol)，加熱至82℃攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，反應(yīng)冷卻至室溫，用水稀釋，乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到白色的產(chǎn)品6.2g，產(chǎn)率80％。

LCMS:t＝2.476min,308.1(M+H⁺).

第三步：1-(4-氨基-3-異丙氧基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺的制備

將化合物1-(3-異丙氧基-4-硝基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(1.7g,5.53mmol)溶于15毫升甲醇并加入鈀碳(580mg)。氫氣置換，氫氣氛圍下室溫?cái)嚢柽^夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，過濾，蒸除甲醇得到黑色油狀產(chǎn)品1.45g，產(chǎn)率90％。

LCMS:t＝0.43min,278.1(M+H⁺).

實(shí)施例21：5-氯-N²-(4-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)-2-乙氧苯基-N⁴-(2-(異丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(式I-92所示化合物)的制備

制備路線：

將2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-4-胺(150mg,0.43mmol)和1-(4-氨基-3-乙氧基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(式8所示化合物)(114mg,0.43mmol)溶于正丁醇(1.5mL)，并向反應(yīng)液中加入對甲苯磺酸(74mg,0.43mmol)，升溫至115攝氏度，攪拌反應(yīng)5小時(shí)。TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，減壓蒸除溶劑后，將粗品溶于二氯己烷，經(jīng)飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得粗品，粗品經(jīng)柱層析分離純化得到淺綠色的固體90mg，產(chǎn)率36.3％，即為式I-92所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ9.08(d,J＝8.4Hz,1H),8.34(d,J＝4.1Hz,1H),8.10(s,1H),7.69(d,J＝8.1Hz,1H),7.49(dd,J＝8.6,4.3Hz,1H),7.22(d,J＝8.0Hz,1H),6.66(d,J＝2.2Hz,1H),4.05(dd,J＝13.9,6.9Hz,2H),3.81(dd,J＝13.5,6.8Hz,2H),3.22(m,1H),2.84(s,6H),2.78(m,2H),2.17(m,2H),1.83(m,2H),1.38–1.27(m,6H).

LCMS：t＝3.37min，574.1(M+H⁺).

其中，本實(shí)施例中所述1-(4-氨基-3-乙氧基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(式8所示化合物)

其合成路線及制備方法如下：

第一步：2-乙氧基-4-氟-1-硝基苯的制備

將化合物2,4-二氟-1-硝基苯(5.0g,31.44mmol)溶于乙醇(70mL)，加入碳酸銫(30.66g,94.34mmol)，加熱攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，溶劑旋干，加水稀釋，用乙酸乙酯萃取，合并的有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾旋干，經(jīng)層析柱分離純化得到白色固體產(chǎn)品5.5g，產(chǎn)率95％。

第二步：1-(3-乙氧基-4-硝基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺的制備

將化合物4-氟-2-乙氧基-1-硝基苯(5g,27mmol)溶于DMF(60mL)，加入N,N-二甲基派啶-4-胺鹽酸鹽(3.81g,29.7mmol)和碳酸鉀(11.2g,781.01mmol)，加熱82℃攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)結(jié)束后，加水稀釋，用乙酸乙酯萃取兩次。合并的有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥后，過濾蒸除溶劑得到白色的產(chǎn)品6.2g，產(chǎn)率78％。

LCMS:t＝2.602min,294.1(M+H⁺).

第三步：1-(4-氨基-3-乙氧基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺的制備

將化合物1-(3-乙氧基-4-硝基苯)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(2.22g,7.57mmol)溶于15毫升甲醇，加入鈀碳(300mg)。氫氣置換三次，氫氣氛圍室溫?cái)嚢柽^夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，過濾除去碳鈀，母液減壓濃縮得到黑色油狀產(chǎn)品1.54g，產(chǎn)率75％。

LCMS:t＝0.430min,264.1(M+H⁺).

實(shí)施例22：5-氯-N²-(2-異丙氧基-5-甲基-4-(1，2，3，6-四氫哌啶-4-基)苯基)-N⁴-(2-異丙磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(式I-90所示化合物)的制備

制備路線：

第一步：4-(4-((5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-5-異丙氧基-2-甲基苯)-3,6-二氫哌啶-1(2H)-羰酸叔丁酯的制備

將2，5-二氯-N-(2-異丙磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-4-胺(0.37g,1.07mmol)，4-(4-氨基-5-異丙氧基-2-甲基苯基)-3，6-二氫哌啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(0.41g,1.17mmol)，碳酸銫(1.04g,3.20mmol)，Pd₂(dba)₃(49.0mg,0.053mmol)，Xantphos(62.0mg,0.107mmol)置于10毫升的微波管里，加入3毫升的1,4-二氧六環(huán)，氮?dú)庵脫Q三次，在130攝氏度微波反應(yīng)40分鐘。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，反應(yīng)液用水稀釋，乙酸乙酯萃取兩次，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮，得到粗品經(jīng)柱層析分離純化(PE：EtOAc＝3:1)得到白色的固體產(chǎn)物260mg，產(chǎn)率37％。

LCMS:t＝7.97min,657.2(M+H⁺).

第二步：5-氯-N²-(2-異丙氧基-5-甲基-4-(1，2，3，6-四氫哌啶-4-基)苯基)-N⁴-(2-(異丙氧磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺的制備

將4-(4-((5-氯-4-((2-異丙磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2基)氨基)-5-異丙氧基-2甲基苯基)-3，6-二氫哌啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(260mg,0.396mmol)加入鹽酸乙酸乙酯(4M)，室溫過夜。LCMS監(jiān)測反應(yīng)完成后，減壓濃縮，得到粗品用乙酸乙酯打漿得到淺黃色的固體產(chǎn)物100mg，產(chǎn)率43％，即為式I-90所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：δ10.77(s,2H),10.09(s,1H),9.56(s,1H),8.98(s,1H),8.48(s,1H),8.15(s,1H),7.58(s,1H),7.41(s,1H),6.73(s,1H),5.65(s,1H),4.58(s,1H),4.11-3.78(m,3H),3.50(s,2H),2.75(s,2H),2.19(s,3H),1.52-1.25(m,12H).

LCMS：t＝3.44min，557.1(M+H⁺).

其中，本實(shí)施例中所述4-(4-氨基-5-異丙氧基-2-甲基苯基)-3，6-二氫哌啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(式6所示化合物)

其合成路線及制備方法如下：

第一步：4-(5-異丙氧基-2-甲基-4-硝基苯)-3,6-二氫哌啶-1(2H)-羧酸叔丁酯的制備

將化合物1-氯-5-異丙氧基-2-甲基-4-硝基苯(1g,4.35mmol)，N-Boc-1,2,5,6-四氫吡啶-4-硼酸頻哪醇酯(1.481g,4.79mmol)，碳酸鉀(1.805g,13.06mmol)，PdCl₂₍dppf).CH₂Cl₂(356mg,0.43mmol)加入50毫升的單口瓶里，加入10毫升的1,4-二氧六環(huán)。氮?dú)庵脫Q，在氮?dú)夥諊?，加熱?20℃攪拌過夜。冷卻至室溫，加水稀釋，用乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥后，過濾，蒸除溶劑得到油狀的產(chǎn)品0.81g，產(chǎn)率49％。

LCMS:t＝4.83min,321.1(M-55).

第二步：4-(4-氨基-5-異丙氧基-2-甲基)-3,6-二氫哌啶-1(2H)-羧酸叔丁酯的制備

將化合物4-(5-異丙氧基-2-甲基-4-硝基苯基)-3,6-二氫哌啶-1(2氫)-羧酸叔丁酯(0.81g,2.152mmol)溶于15毫升甲醇中，并加入氯化銨(1.151g,21.52mmol)。在室溫下分批加入鋅粉(1.40，21.538mmol)，加熱至回流，攪拌過夜。冷卻至室溫，過濾，旋干。粗品用二氯甲烷溶解，用飽和的碳酸氫鈉洗，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到固體產(chǎn)品0.26g，產(chǎn)率97％。

LCMS:t＝3.97min,347.1(M+H⁺).

實(shí)施例23：5-氯-N⁴-(2-異丙磺酰)吡啶-3-基)-N²-(2-甲氧基-5-甲基-4-(1,2,3,6-四氫哌啶-4-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(式I-89所示化合物)的制備

制備路線：

第一步：4-(4-((5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-5-甲氧基-2-甲基苯基)-3,6-二氫哌啶-1(2H)-羰酸叔丁酯的制備

將化合物4-(4-氨基-5-甲氧基-2-甲基苯基)-3,6-二氫哌啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(0.726g,2.281mmol)，2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-4-胺(0.72g,2.074mmol)，碳酸銫(2.027g,6.22mmol)，Pd₂(dba)₃(0.095g,0.104mmol)，Xantphos(0.120g,0.207mmol)置于10毫升的微波管里，加入10毫升1,4-二氧六環(huán)。氮?dú)庵脫Q，微波加熱130℃反應(yīng)40分鐘。冷卻至室溫后，反應(yīng)加入EtOAc稀釋，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮，所得到的粗品經(jīng)柱層析分離純化得到白色固體產(chǎn)200mg，產(chǎn)率14％。

第二步：5-氯-N⁴-(2-(異丙基磺酰)吡啶-3-基)-N²-(2-甲氧基-5-甲基-4-(1,2,3,6-四氫哌啶-4-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺的制備

將化合物4-(4-((5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-5-甲氧基-2-甲基苯基)-3,6-二氫哌啶-1(2H)-羰酸叔丁酯(0.2g,0.318mmol)溶于1毫升EtOAc，在室溫下慢慢加入4毫升的HCl/EtOAc(4M)，攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)溶劑濃縮，用乙酸乙酯打漿，再經(jīng)過HPLC制備分離得到淺黃色固體產(chǎn)品100mg，產(chǎn)率51.6％，即為(式I-89所示化合物。

¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ9.11(d,J＝8.5Hz,1H),8.38(d,J＝4.3Hz,1H),8.16(s,1H),7.75(s,1H),7.58(dd,J＝8.7,4.4Hz,1H),6.75(s,1H),5.65(s,1H),3.90–3.77(m,6H),3.46(t,J＝6.0Hz,2H),2.63(d,J＝1.8Hz,2H),2.18(s,3H),1.31(d,J＝6.9Hz,6H).

LCMS：t＝3.29min，531.1(M+H⁺),265.2(M/2+H⁺).

其中，本實(shí)施例中所述4-(4-氨基-5-甲氧基-2-甲基苯基)-3,6-二氫哌啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(式7所示化合物)

其合成路線及制備方法如下：

第一步：1-氯-5-甲氧基-2-甲基-4-硝基苯的制備

將化合物1,5-二氯-2-甲基硝基苯(2g,9.71mmol)溶于甲醇(20mL)并加入碳酸銫(9.49g,29.12mmol)。反應(yīng)在室溫反應(yīng)3小時(shí)。TLC監(jiān)測反應(yīng)結(jié)束后，加水(80mL)稀釋，DCM(100mL×2)萃取，合并的有機(jī)相用飽和食鹽(50mL)水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾蒸除溶劑得到白色固體產(chǎn)品1.76g，產(chǎn)率90％。

第二步：4-(5-甲氧基-2-甲基-4-硝基苯基)-3,6-二氫哌啶-1(2H)-羧酸叔丁酯的制備

將化合物1-氯-5-甲氧基-2-甲基-4-硝基苯(3.5g,17.36mmol),N-Boc-1,2,5,6-四氫吡啶-4-硼酸頻哪醇酯(5.90g,19.10mmol)，碳酸鉀(7.20g,52.1mmol)，Pd(Ph₃P)₄(1.003g,0.868mmol)加入100毫升的單口瓶里，加入20毫升1，4-二氧六環(huán)。氮?dú)庵脫Q，在氮?dú)夥諊訜?20℃攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，溶劑旋干，加水稀釋，用EtOAc萃取。有機(jī)相用飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾旋干，經(jīng)柱層析分離得到白色固體產(chǎn)品3g，產(chǎn)率49％。

LCMS:t＝4.507min,293.0(M-55).

第三步：4-(4-氨基-5-甲氧基-2-甲基苯基)-3,6-二氫哌啶-1(2H)-羧酸叔丁酯的制備

將化合物4-(5-甲氧基-2-甲基-4-硝基苯基)-3,6-二氫哌啶-1(2H)-羰酸叔丁酯(0.8g,2.296mmol)溶于10毫升甲醇，在室溫下加入氯化銨(0.614g,11.48mmol)并分批加入鋅粉(0.751g,11.48mmol)，加熱回流2小時(shí)。TLC監(jiān)測反應(yīng)結(jié)束，冷卻到室溫，旋干溶劑，所得到的粗品用EtOAc溶解，用碳酸氫鈉溶液洗，無水硫酸鈉干燥，過濾旋干得到白色固體產(chǎn)品0.72g，產(chǎn)率98.6％。

LCMS:t＝3.489min,319.1(M+H⁺).

實(shí)施例24：5-氯-N²-(2-(二氟甲氧基)-4-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)苯基)-N⁴-(2-(異丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(式I-100所示化合物)的制備

制備路線：

將2，5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-4-胺(150mg,0.432mmol)和1-(4-氨基-3-(二氟甲氧基)苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(式3所示化合物)(123mg,0.432mmol)溶于正丁醇(1.5mL)，并向反應(yīng)液中加入對甲苯磺酸(74mg,0.432mmol)，升溫至115攝氏度，攪拌反應(yīng)5小時(shí)。TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，減壓蒸除溶劑后，將粗品溶于二氯己烷，經(jīng)飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得粗品，粗品經(jīng)柱層析分離純化得棕紅色的固體110mg，產(chǎn)率43％，即為式I-100所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl3)：δ10.11(s,1H),9.11(d,J＝8.8Hz,1H),8.37(dd,J＝4.4,1.3Hz,1H),8.15(s,1H),7.86(d,J＝8.8Hz,1H),7.41(dd,J＝8.8,4.4Hz,1H),6.95(s,1H),6.78(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),6.75(s,1H),6.50(t,J＝73.6Hz,1H),3.90(dq,J＝13.6,7.2Hz,1H),3.67(t,J＝12.4Hz,2H),2.75(dd,J＝1.8,12.2Hz,2H),2.42(s,6H),2.03(d,J＝12.8Hz,2H),1.76-1.66(m,2H),1.38(d,J＝6.8Hz,6H).

LCMS:t＝3.50min,596.2(M+H⁺).

其中，本實(shí)施例中所述1-(4-氨基-3-(二氟甲氧基)苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(式3所示化合物)

其合成路線及制備方法如下：

第一步：4-氯-2-(二氟甲氧基)-1-硝基苯的制備

將化合物2-氟-2-硝基苯酚(4g,25.5mmol)溶于DMF(50ml)/水(10ml)，加入2-氯-2，2-二氟乙酸鈉(11.65g,46mmol)和碳酸鉀(10.56g,76mmol)。氮?dú)庵脫Q，在氮?dú)夥諊?，加熱?00℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，反應(yīng)冷卻至室溫，加水稀釋并用乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾旋干，經(jīng)層析柱(石油醚)得到黃色的油狀產(chǎn)品2.5g，產(chǎn)率47％。

第二步：1-(3-(二氟甲氧基)-4-硝基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺的制備

將化合物2-(二氟甲氧基)-4-氯-1-硝基苯(2.5g,12.07mmol)溶于DMF(20ml)，攪拌下加入N,N-二甲基哌啶-4-胺鹽酸鹽(2.428g,12.07mmol)和碳酸鉀(5.00g,36.2mmol)。混合物加熱80℃攪拌反應(yīng)過夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，反應(yīng)冷卻至室溫，加水稀釋并用乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后，過濾濃縮，經(jīng)層析柱(DCM:MeOH＝30:1)得到黃色油狀的產(chǎn)品1.4g，產(chǎn)率34％。

LCMS:t＝2.68min,316.0(M+H⁺).

第三步：1-(4-氨基-3-(二氟甲氧基)苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺的制備

將化合物1-(3-(二氟甲氧基)-4-硝基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(0.7g,2.220mmol)溶于甲醇(10ml)，攪拌下加入氯化銨(1.188g,22.20mmol)，分批加入鋅粉(1.451g,22.20mmol)后，加熱回流3小時(shí)。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，過濾濃縮，所得到的粗品加DCM溶解，用碳酸氫鈉溶液洗，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到棕色的油狀的產(chǎn)品0.5g，產(chǎn)率77％，即為本實(shí)施例所述中間體3。

LCMS:t＝0.48min,286.1(M+H⁺).

實(shí)施例25：5-氯-N²-(4-(1-異丙基-1,2,3,6-四氫吡啶-4-基)-2-甲氧基-5-甲基苯基)-N⁴-(2-(異丙基磺酰基)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(式I-80所示化合物)的制備

制備路線：

將2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-4-胺(183mg,0.527mmol)和4-(1-異丙基-1,2,3,6-四氫吡啶-4-基)-2-甲氧基-5-甲基苯胺(137mg,0.527mmol)溶于n-BuOH(2.5ml)，并向其中加入對甲苯磺酸(91mg,0.527mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，粗品再經(jīng)柱層析分離(DCM/MeOH(v/v＝40:1～20:1))得黃色固體186mg，產(chǎn)率61.8％，即為式I-80所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ10.08(s,1H),9.18(d,J＝8.3Hz,1H),8.37(d,J＝3.4Hz,1H),8.18(s,1H),7.96(s,1H),7.53–7.42(m,2H),6.76(s,1H),5.59(s,1H),3.99–3.86(m,2H),3.83(s,3H),3.74-3.69(m3H),3.34(s,3H),2.17(s,3H),1.47(d,J＝6.6Hz,6H),1.38(d,J＝6.9Hz,6H).

LCMS:t＝3.42min,571.1(M+H+).

實(shí)施例26:5-氯-N²-(4-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)-2-異丙氧基苯基)-N⁴-(2-(異丙基磺?；?噻吩-3-基)嘧啶-2,4-二胺(式I-82所示化合物)的制備

制備路線：

將2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)噻吩-3-基)嘧啶-4-胺(186mg,0.528mmol)和中間體9(147mg,0.530mmol)溶于n-BuOH(2.5ml)，并向其中加入對甲苯磺酸(91mg,0.528mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，粗品再經(jīng)柱層析分離(DCM/MeOH(v/v＝40:1～20:1))得黃色固體220mg，產(chǎn)率70.2％.

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.40(s,1H),8.27(d,J＝5.2Hz,1H),8.11(s,1H),7.99(d,J＝8.4Hz,1H),7.78(d,J＝8.0Hz,1H),7.64(d,J＝5.6Hz,1H),7.18(d,J＝7.6Hz,1H),6.55(s,1H),6.52(d,J＝9.2Hz,1H),4.56(dt,J＝11.6,6.0Hz,1H),3.66(d,J＝12.0Hz,2H),3.32(dt,J＝13.6,6.8Hz,1H),2.73(t,J＝11.2Hz,3H),2.58(s,6H),2.17–2.01(m,2H),1.90–1.73(m,2H),1.37(t,J＝6.8Hz,12H).

LCMS:t＝3.38min,593.1(M+H+).

實(shí)施例27:5-氯-N⁴-(2-(異丙基磺?；?吡啶-3-基)-N²-(2-甲氧基-4-(1-甲基-1,2,3,6-四氫吡啶-4-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(式I-84所示化合物)的制備

制備路線：

將2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-4-胺(183mg,0.527mmol)和2-甲氧基-4-(1-甲基-1,2,3,6-四氫哌啶-4-基)苯胺(式4所示化合物)(115mg,0.527mmol)溶于n-BuOH(2.5ml)，并向其中加入對甲苯磺酸(91mg,0.527mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，粗品再經(jīng)柱層析分離(DCM/MeOH(v/v＝40:1～20:1))得黃色固體115mg，產(chǎn)率41.2％，即為式I-84所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ10.06(s,1H),9.17(d,J＝8.8Hz,1H),9.11(dd,J＝18.8,6.0Hz,1H),8.52-8.45(m,1H),8.39(d,J＝4.4Hz,1H),8.28–8.19(m,1H),8.08(d,J＝8.8Hz,1H),7.48(d,J＝3.6Hz,1H),6.97–6.90(m,1H),6.03(s,1H),3.91(s,3H),3.13(d,J＝2.8Hz,2H),2.69(t,J＝5.6Hz,3H),2.60(s,2H),2.42(s,3H),1.39(t,J＝6.2Hz,6H).

LCMS:t＝3.25min,529.1(M+H+).

其中，本實(shí)施例中所述2-甲氧基-4-(1-甲基-1,2,3,6-四氫哌啶-4-基)苯胺(式4所示化合物)

其合成路線及制備方法如下：

第一步：4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)-3,6-二氫哌啶-1(2H)-羧酸叔丁酯的制備

將化合物4-溴-2-甲氧基-1-硝基苯(1.5g,6.46mmol)，N-Boc-1,2,5,6-四氫吡啶-4-硼酸頻哪醇酯(2.199g,7.11mmol)，碳酸鉀(2.68g,19.39mmol)，Pd(Ph₃P)₄(0.374g,0.323mmol)置于100毫升的單口燒瓶里，往里加入1，4-二氧六環(huán)。氮?dú)庵脫Q，在氮?dú)夥諊訜嶂?0℃攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，旋干溶劑，加水稀釋并用二氯甲烷萃取。有機(jī)相用無水硫酸鈉，過濾用無水硫酸鈉干燥，經(jīng)柱層析分離純化得到白色固體產(chǎn)品1.72g，產(chǎn)率65％。

LCMS:t＝4.30min,279.0(M-55).

第二步：4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)-1,2,3,6-四氫哌啶三氟乙酸鹽的制備

將化合物4-(3-甲氧在-4-硝基苯基)-5,6-二氫哌啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(1.72g,5.14mmol)溶在10毫升二氯甲烷里。在室溫下滴入TFA(4mL)，攪拌過夜，反應(yīng)完畢后旋去三氟乙酸得到油狀的產(chǎn)品1.79g，產(chǎn)率100％。

第三步：4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)-1-甲基-1,2,3,6-四氫哌啶的制備

將化合物4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)-1,2,3,6-四氫哌啶三氟乙酸鹽(0.6g,1.723mmol)溶于10毫升的甲醇中，加入多聚甲醛(0.155g,5.17mmol)，在室溫?cái)嚢璋雮€(gè)小時(shí)。分批加入氰基硼氫化鈉(0.325g,5.17mmol)，室溫下攪拌反應(yīng)過夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)結(jié)束后，加入50mL水并用EtOAc萃取(30mL×2)，合并有機(jī)相后用無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸除溶劑，所得粗品經(jīng)柱層析得油狀產(chǎn)物0.2g，產(chǎn)率47％。

LCMS:t＝1.57min,249.0(M+H⁺).

第四步：2-甲氧基-4-(1-甲基-1,2,3,6-四氫哌啶-4-基)苯胺的制備

將化合物4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)-1-甲基-1,2,3,6-四氫哌啶(0.2g,0.806mmol)溶在15毫升甲醇里，并加入氯化銨(0.215g,4.03mmol)。在室溫?cái)嚢柘路峙尤脘\粉(0.263g,4.03mmol)，加熱回流過夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，減壓過濾，旋干溶劑。所得的粗品用DCM溶解，并用碳酸氫鈉水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到固狀產(chǎn)品157mg，產(chǎn)率90％。

LCMS:t＝0.45min,219.0(M+H⁺).

實(shí)施例28:5-氯-N²-(4-(1-異丙基-1,2,3,6-四氫吡啶-4-基)-2-甲氧基苯基)-N⁴-(2-(異丙基磺酰基)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(式I-85所示化合物)的制備

制備路線：

將2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-4-胺(183mg,0.527mmol)和4-(1-異丙基-1,2,3,6-四氫哌啶-4-基)-2-甲氧基苯胺(式11所示化合物)(130mg,0.527mmol)溶于n-BuOH(2.5ml)，并向其中加入對甲苯磺酸(91mg,0.527mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，粗品經(jīng)柱層析分離純化得黃色固體52mg，產(chǎn)率17.7％，即為式I-85所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ10.06(s,1H),9.12(s,1H),8.41(s,1H),8.16(d,J＝21.2Hz,1H),7.54(s,1H),6.91(s,1H),5.97(s,1H),5.29-5.16(m,1H),3.91(s,3H),3.72-3.58(m,3H),3.25-3.02(m,5H),1.36(t,J＝39.6Hz,12H).

LCMS:t＝3.43min,557.2(M+H+).

其中，本實(shí)施例中所述4-(1-異丙基-1,2,3,6-四氫哌啶-4-基)-2-甲氧基苯胺(式11所示化合物)

其合成路線及制備方法如下：

第一步：1-異丙基-4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)-1,2,3,6-四氫哌啶的制備

將化合物4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)-1,2,3,6-四氫哌啶三氟乙酸鹽(1.2g,3.45mmol)溶于15毫升DMF中，依次加入碳酸鉀(1.905g,13.78mmol)和異丙基溴(0.642ml,6.89mmol)。加熱至80℃攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢后，加水稀釋并用EtOAc萃取。有機(jī)相用飽和食鹽水水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾旋干后，經(jīng)柱層析分離純化得到油狀產(chǎn)品0.3g，產(chǎn)率27％。

LCMS:t＝2.40min,277.0(M+H⁺).

第二步：4-(1-異丙基-1,2,3,6-四氫哌啶-4-基)-2-甲氧基苯胺的制備

將化合物1-異丙基-4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)-1,2,3,6-四氫哌啶(0.3g,1.086mmol)溶在甲醇(15ml)，加入氯化銨(0.410g,7.67mmol)，在室溫下分批加入鋅粉(15.21g,233mmol)。加熱回流3小時(shí)。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成。反應(yīng)冷卻至室溫，過濾，旋干。粗品用DCM溶解，碳酸氫鈉溶水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到黃色油狀的產(chǎn)品0.26g，產(chǎn)率97％。

LCMS:t＝0.55min,247.1(M+H⁺).

實(shí)施例29:5-氯-N²-(4-(1-異丙基-1,2,3,6-四氫吡啶-4-基)-2-甲氧基苯基)-N⁴-(2-(異丙基磺?；?噻吩-3-基)嘧啶-2,4-二胺(式I-86所示化合物)的制備

制備路線：

將2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰基)噻吩-3-基)嘧啶-4-胺(185mg,0.525mmol)和式11所示化合物(130mg,0.528mmol)溶于n-BuOH(2.5ml)，并向其中加入對甲苯磺酸(91mg,0.528mmol)，加熱至

120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，粗品經(jīng)柱層析分離純化得黃色固體65mg，產(chǎn)率22％，即為式I-86所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.42(s,1H),8.15(s,1H),7.73(s,1H),7.57(s,1H),7.07–6.83(m,1H),5.97(s,1H),3.90(s,3H),3.76(s,2H),3.58(s,1H),3.33-3.30(m,3H),2.04(s,1H),1.70(s,1H),1.58–1.27(m,6H).

LCMS:t＝3.63min,562.1(M+H+).

實(shí)施例30:5-氯-N²-(4-(4-(異丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-5-甲基苯基)-N⁴-(2-(異丙基磺?；?吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(式I-88所示化合物)的制備

制備路線：

將2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰基)吡啶-3-基)嘧啶-4-胺(183mg,0.527mmol)和4-(4-異丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-5-甲基苯胺(式10所示化合物)(139mg,0.527mmol)溶于n-BuOH(2.5ml)，并向其中加入對甲苯磺酸(91mg,0.527mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，粗品經(jīng)柱層析分離純化得黃色固體171mg，產(chǎn)率56.5％，即為式I-88所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ10.07(s,1H),9.20(d,J＝8.4Hz,1H),8.36(d,J＝4.0Hz,1H),8.16(s,1H),7.88(s,1H),7.44(dd,J＝8.4,4.4Hz,1H),7.30(s,1H),6.70(s,1H),3.96–3.87(m,1H),3.85(s,3H),3.04(s,4H),2.82(s,5H),2.20(s,3H),1.38(d,J＝6.8Hz,6H),1.20(s,6H).

LCMS:t＝3.39min,574.1(M+H+).

其中，本實(shí)施例中所述4-(4-異丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-5-甲基苯胺(式10所示化合物)

其合成路線及制備方法如下：

第一步：4-(5-甲氧基-2-甲基-4-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的制備

將化合物1-氯-5-甲氧基-2-甲基-4-硝基苯(2g,9.92mmol)，N-Boc哌嗪(2.032g,10.91mmol)，碳酸銫(9.70g,29.8mmol)，Pd₂(dba)₃(0.454g,0.496mmol)，Xantphos(0.574g,0.992mmol)一起加入100毫升的單口瓶里，加入20毫升的1,4-二氧六環(huán)。氮?dú)庵脫Q，在氮?dú)夥諊訜嶂?00℃攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，加入100mL水并用EtOAc(50mL×2)萃取，合并的有機(jī)相經(jīng)飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸除溶劑，經(jīng)柱層析分離純化得到黃色固體產(chǎn)品2g，產(chǎn)率57％。

LCMS:t＝4.361min,296.0(M-55).

第二步：1-(5-甲氧基-2-甲基-4-硝基苯基)哌嗪的制備

將化合物4-(5-甲氧基-2-甲基-4-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(2g,5.69mmol)溶于10毫升的二氯甲烷。室溫下滴加TFA(4mL)，攪拌4個(gè)小時(shí)。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，旋干得到黑色油狀產(chǎn)品1.9g，產(chǎn)率100％。

第三步：1-異丙基-4-(5-甲氧基-2-甲基-4-硝基苯基)哌嗪的的制備

將化合物1-(5-甲氧基-2-甲基-4-硝基苯基)哌嗪(1.9g,5.69mmol)溶于20毫升DMF，依次加入碳酸鉀(2.36g,17.05mmol)和異丙基溴(1.4g,11.37mmol)。加熱至80℃攪拌3小時(shí)。TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢后，加水稀釋并用EtOAc萃取。有機(jī)相經(jīng)飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾旋干后，經(jīng)柱層析分離得到黃色油狀產(chǎn)品0.68g，產(chǎn)率41％。

LCMS:t＝2.676min,294.1(M+H⁺).

第四步：4-(4-異丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-5-甲基苯胺的制備

將化合物1-異丙基-(5-甲氧基-2-甲基-4-硝基苯基)哌嗪(0.68g,2.32mmol)溶在10毫升甲醇中，加入鈀碳(100mg)。氫氣置換，在氫氣氛圍室溫?cái)嚢柽^夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，過濾除去碳鈀，母液減壓濃縮得到產(chǎn)品0.4g，產(chǎn)率65％。

LCMS:t＝4.36min,296.1(M-55).

實(shí)施例31:5-氯-N²-(2-二氟甲氧基)-4-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)苯基)-N⁴-(2-(異丙基磺?；?苯基)嘧啶-2,4-二胺(式I-95所示化合物)的制備

制備路線：

將2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺?；?苯基)嘧啶-4-胺(180mg,0.520mmol)和式3所示化合物(150mg,0.526mmol)溶于n-BuOH(2.5ml)，并向其中加入對甲苯磺酸(90mg,0.523mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，粗品經(jīng)柱層析分離純化得黃色固體115mg，產(chǎn)率37.2％，即為式I-95所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.60(s,1H),8.53(d,J＝8.4Hz,1H),8.12(s,1H),8.00(d,J＝8.8Hz,1H),7.90(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),7.58(t,J＝7.2Hz,1H),7.28–7.20(m,1H),7.00(s,1H),6.73(s,1H),6.48(t,J＝73.6Hz,2H),3.65(d,J＝12.8Hz,2H),3.25-3.19(m,1H),2.99–2.85(m,1H),2.72(dd,J＝24.4,13.2Hz,2H),2.50(s,6H),2.10-2.03(m,2H),1.80-1.72(m,2H),1.29(t,J＝6.8Hz,6H).

LCMS:t＝3.75min,595.14(M+H+).

實(shí)施例32:5-氯-N²-(4-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)-2-甲氧基-5-甲基苯基)-N⁴-(2-(異丙基磺?；?吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(式I-98所示化合物)的制備

制備路線：

將2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰基)吡啶-3-基)嘧啶-4-胺(183mg,0.527mmol)和1-(4-氨基-5-甲氧基-2-甲基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(式2所示化合物)(139mg,0.527mmol)溶于n-BuOH(2.5ml)，并向其中加入對甲苯磺酸(91mg,0.527mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，粗品經(jīng)柱層析分離純化得白色固體50mg，產(chǎn)率16.5％，即為式I-98所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ10.08(s,1H),9.19(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),8.37(dd,J＝4.4,1.2Hz,1H),8.16(s,1H),7.91(s,1H),7.55–7.43(m,1H),7.32(s,1H),6.60(s,1H),3.95-3.91(m,1H),3.86(s,3H),3.23(t,J＝12.2Hz,2H),3.16(t,J＝12.0Hz,1H),2.79(s,6H),2.74(t,J＝11.2Hz,2H),2.28(t,J＝12.0Hz,2H),2.18(s,3H),1.97-1.94(m,2H),1.39(d,J＝6.8Hz,6H).

LCMS:t＝3.52min,574.3(M+H+).

其中，本實(shí)施例中所述1-(4-氨基-5-甲氧基-2-甲基苯基)-N，N-二甲基哌啶-4-胺(式2所示化合物)

其合成路線及制備方法如下：

第一步：1-(5-甲氧基-2-甲基-4-硝基苯基)-N，N-二甲基哌啶-4-胺的制備

將化合物1-氯-5-甲氧基-2-甲基-4-硝基苯(2g,9.92mmol)，N，N-二甲基哌啶鹽酸鹽(2.195g,10.91mmol)，碳酸銫(16.16g,49.6mmol)，Pd₂(dba)₃(0.454g,0.496mmol)，Xantphos(0.574g,0.992mmol)置于10毫升的微波管，加入DMF(20ml)。往液下鼓氮?dú)?分鐘，微波下在130度攪拌反應(yīng)40分鐘。TLC監(jiān)測完畢后，反應(yīng)冷卻至室溫，往反應(yīng)混合物加水稀釋，用乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用飽和食鹽水，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮，經(jīng)柱層析(DCM：MeOH 20:1)得到棕色的固體產(chǎn)品0.45g，產(chǎn)率15.46％。

LCMS:t＝2.69min,294.1(M+H⁺).

第二步：1-(4-氨基-5-甲氧基-2-甲基苯基)-N，N-二甲基哌啶-4-胺的制備

將化合物1-(5-甲氧基-2-甲基-4-硝基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(0.45g,1.534mmol)和氯化銨(0.410g,7.67mmol)置于100毫升的單口燒瓶中，加入10毫升甲醇，室溫?cái)嚢柘路峙尤脘\粉(0.501g,7.67mmol)。加熱回流3小時(shí)。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，減壓過濾，母液旋干，加入DCM溶解，用碳酸氫鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到白色的產(chǎn)品0.38g，產(chǎn)率80％。

LCMS:t＝0.43min,264.1(M+H⁺).

實(shí)施例33:5-氯-N²-(2-(二氟甲氧基)-4-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)-5-甲基苯基)-N⁴-(2-(異丙基磺酰基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(式I-102所示化合物)的制備

制備路線：

將2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)苯基)嘧啶-4-胺(183mg,0.529mmol)和1-(4-氨基-5-(二氟甲氧基)-2-甲基苯基)-N,N-二甲基吡啶-4-胺(158mg,0.529mmol)溶于n-BuOH(2.5ml)，并向其中加入對甲苯磺酸(91mg,0.529mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，粗品經(jīng)柱層析分離純化得黃色固體81mg，產(chǎn)率25.2％，即為式I-102所示化合物。

實(shí)施例34：式I-103所示化合物的制備

將式a所示化合物(200mg,0.529mmol)和式b所示化合物(140mg,0.529mmol)溶于n-BuOH(2.5ml)，并向其中加入對甲苯磺酸(91mg,0.529mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，再經(jīng)柱層析分離(DCM/MeOH(v/v＝40:1～20:1))得淺黃色固體產(chǎn)物136mg，收率42.5％，即為式I-103所示化合物。

實(shí)施例35：式I-107所示化合物的制備

將式c所示化合物(150mg,0.43mmol)和式b所示化合物(114mg,0.43mmol)溶于正丁醇(1.5mL),并向反應(yīng)液中加入對甲苯磺酸(74.40mg,0.43mmol)，升溫至115攝氏度，攪拌反應(yīng)5小時(shí)。TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，減壓蒸除溶劑后，將粗品溶于二氯己烷，經(jīng)飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得粗品，粗品經(jīng)柱層析分離純化得到淺綠色的固體101mg，產(chǎn)率41％，即為式I-107所示化合物。

實(shí)施例36：式I-109所示化合物的制備

合成路線及制備方法：

將式d所示化合物(137mg,0.397mmol)和式b所示化合物(105mg,0.397mmol)溶于正丁醇(1.5mL)，并向反應(yīng)液中加入對甲苯磺酸(68mg,397mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，再經(jīng)柱層析分離(DCM/MeOH(v/v＝40:1～20:1))得淺綠色的固體81mg，產(chǎn)率35.6％，即為式I-109所示化合物。

實(shí)施例37：5-(二氟甲氧基)-N²-(4-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)-2-甲氧基苯基)-N⁴-(2-(異丙基磺?；?苯基)嘧啶-2,4-二胺(式I-111所示化合物)的制備

合成路線及制備方法：

將2-氯-5-(2-氟甲氧基)-N-(2-(異丙基磺?；?苯基)嘧啶-4-胺(式12所示化合物)(200mg,0.529mmol)和1-(4-胺基-3-甲氧基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(式5所示化合物)(132mg,0.529mmol)溶于n-BuOH(2.5ml)，并向其中加入對甲苯磺酸(91mg,0.529mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，再經(jīng)柱層析分離(DCM/MeOH(v/v＝40:1～20:1))得淺黃色固體產(chǎn)物121mg，收率38.3％，即為式I-111所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.56(s,1H),8.70(d,J＝8.4Hz,1H),8.07-8.04(m,2H),7.87(dd,J＝7.9,1.2Hz,1H),7.60(t,J＝7.3Hz,1H),7.29(s,1H),7.21(t,J＝7.6Hz,1H),6.62(d,J＝144Hz,1H),6.60–6.54(m,1H),6.50(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),3.87(s,3H),3.65(d,J＝12.3Hz,2H),3.22(dt,J＝13.6,6.8Hz,1H),2.71(dd,J＝12.0,10.4Hz,2H),2.36(d,J＝12.8Hz,7H),1.99(d,J＝12.3Hz,2H),1.72(tt,J＝12.0,6.1Hz,2H),1.29(d,J＝6.8Hz,6H).

LCMS:t＝3.08min,591.2(M+H⁺).

其中，本實(shí)施例中所述1-(4-胺基-3-甲氧基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(式5所示化合物)

其合成路線及制備方法如下：

第一步：1-(3-甲氧基-4-硝基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺的制備

將化合物4-氟-2-甲氧基-1-硝基苯(5g,29.2mmol),N,N-二甲基哌啶-4-胺鹽酸鹽(5.88g,29.2mmol)和碳酸鉀(12.11g,88mmol)加入100毫升的單口瓶里，加入60毫升DMF。加熱至80℃攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，加水稀釋，用乙酸乙酯萃取兩次。合并的有機(jī)層經(jīng)飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥后，濃縮溶劑得到棕色油狀產(chǎn)品5g，產(chǎn)率80％。

LCMS:t＝0.48min,280.1(M+H⁺).

第二步：1-(4-氨基-3-甲氧基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺的制備

將化合物1-(3-甲氧基-4-硝基苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(6.5g,23.27mmol)溶在甲醇(10ml)，并加入氯化銨(0.410g,7.67mmol)，在室溫?cái)嚢柘路峙尤脘\粉(15.21g,233mmol)。加熱回流3個(gè)小時(shí)。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，過濾，旋干，用DCM溶解，飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到棕色油狀的產(chǎn)品，即為式5所示化合物，得量5g，產(chǎn)率86％。

¹H NMR(400MHz,dmso)：δ6.47(d,J＝8.4Hz,1H),6.45(d,J＝2.4Hz,1H),6.26(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),4.17(s,2H),3.70(s,3H),3.38(d,J＝12.4Hz,4H),2.16(s,6H),2.08(s,1H),1.78(d,J＝12.4Hz,2H),1.45(dd,J＝11.6,3.6Hz,2H).

LCMS:t＝0.43min,250.1(M+H⁺).

其中，本實(shí)施例中所述2-氯-5-(2-氟甲氧基)-N-(2-(異丙基磺?；?苯基)嘧啶-4-胺(式12所示化合物)

其合成路線及制備方法如下：

第一步:2-氯-N-(2-(異丙基磺酰基)苯基)-5-甲氧基嘧啶-4-胺的制備

將2-異丙基磺?；桨?2g,10.04mmol)溶于無水DMF(25ml)，冰水浴冷卻到0℃，并在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向反應(yīng)體系中分批加入NaH(1.806g,60.2mmol,80％)，繼續(xù)在0℃下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，向反應(yīng)體系中滴加2，4-二氯-5-甲氧基嘧啶(10.78g,60.2mmol)的DMF溶液(10mL)。反應(yīng)體系自然升溫至室溫條件下繼續(xù)攪拌反應(yīng)10小時(shí)，冰水浴冷卻，滴加冰水淬滅反應(yīng)，并用乙酸乙酯萃取，用水及飽和食鹽水洗滌后，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得粗產(chǎn)品，經(jīng)柱層析分離純化(PE/EA＝10:1～5:1)后得白色固體產(chǎn)物3.18g，收率90％。

LCMS:t＝3.85min,342.0(M+H⁺).

第二步：2-氯-4-((2-(異丙基磺酰基)苯基)氨基)嘧啶-5-酚的制備

將2-氯-4-((2-(異丙基磺?；?苯基)-5-甲氧基嘧啶-4-胺(2.5g,7.31mmol)溶于無水二氯甲烷(25mL)中，冰水浴冷卻到0℃，向反應(yīng)體系中滴加三溴化硼(2.78ml,29.3mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液。滴加完畢后，反應(yīng)液繼續(xù)攪拌反應(yīng)5小時(shí)，用冰水淬滅反應(yīng)，經(jīng)飽和碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥后，過濾濃縮得粗產(chǎn)品，經(jīng)柱層析分離純化后PE/EA(V/V＝5:1～3:1)得白色固體2.06g，收率77％。

LCMS:t＝3.60min，328.0(M+H⁺).

第三步：2-氯-5-(二氟甲氧基)-N-(2-(異丙基磺?；?苯基)嘧啶-4-胺的制備

將2-氯-4-((2-(異丙基磺酰基)苯基)氨基)嘧啶-5-酚(500mg,1.342mmol)溶于混合溶劑DMF/H₂O(5mL/1.5mL)中，并向其中加入2-氯-2,2-二氟醋酸鈉(614mg,4.03mmol)及K₂CO₃(557mg,4.03mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱至120℃攪拌反應(yīng)15小時(shí)，反應(yīng)完畢，冷卻到室溫，用乙酸乙酯(50mL)稀釋，經(jīng)水及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得粗產(chǎn)品，經(jīng)柱層析分離PE/EA(V/V＝5:1～2:1)得白色固體產(chǎn)物235mg，收率45％。

LCMS:t＝4.00min，378.0(M+H⁺).

實(shí)施例38：5-(二氟甲氧基)-N²-(4-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)-2-甲氧基-5-甲基苯基)-N⁴-(2-(異丙基磺?；?苯基)嘧啶-2,4-二胺(式I-112所示化合物)的制備

合成路線及制備方法：

將中間體12(200mg,529mmol)和1-(4-氨基-5-甲氧基-2-甲基苯基)-N，N-二甲基哌啶-4-胺(式2所示化合物)(139mg,529mmol)溶于n-BuOH(2.5ml)，并向其中加入對甲苯磺酸(91mg,529mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，再經(jīng)柱層析分離(DCM/MeOH(v/v＝40:1～20:1))得灰白色固體64mg，產(chǎn)率20％，即為式I-112所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.56(s,1H),8.67(d,J＝8.4Hz,1H),8.06(d,J＝12.8Hz,2H),7.87(d,J＝7.2Hz,1H),7.60(t,J＝7.2Hz,1H),7.38(s,1H),7.21(t,J＝7.6Hz,1H),6.58(d,J＝144Hz,1H),6.58(s,2H),3.85(s,3H),3.23-3.20(m,3H),2.82–2.59(m,8H),2.21(d,J＝11.2Hz,2H),2.17(s,3H),1.90(dd,J＝21.2,9.2Hz,3H),1.28(d,J＝6.8Hz,6H).

LCMS:t＝3.05min,605.2(M+H⁺).

實(shí)施例39：5-(二氟甲氧基)-N²-(4-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)-2-異丙氧基苯基)-N⁴-(2-(異丙基磺?；?苯基)嘧啶-2,4-二胺(式I-113所示化合物)的制備

合成路線及制備方法：

將中間體12(150mg,397mmol)和1-(4-胺基-3-異丙氧苯基)-N,N-二甲基氨基哌啶-4-胺(式9所示化合物)(110mg,397mmol)溶于正丁醇(1.5mL)，并向反應(yīng)液中加入對甲苯磺酸(68mg,397mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，再經(jīng)柱層析分離(DCM/MeOH(v/v＝40:1～20:1))得淺綠色的固體54mg，產(chǎn)率22％，即為式I-113所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：δ9.57(s,1H),8.70(d,J＝8.4Hz,1H),8.11(d,J＝8.8Hz,1H),8.07(s,1H),7.87(d,J＝8.0Hz,1H),7.60(s,1H),7.38(s,1H),7.22(t,J＝7.6Hz,1H),6.67(d,J＝72.2Hz,1H),6.54(s,1H),6.48(d,J＝8.8Hz,1H),4.75-4.40(m,2H),3.66(d,J＝12.0Hz,2H),3.21(d,J＝6.8Hz,1H),2.73(t,J＝12.0Hz,2H),2.65(s,6H),2.18(d,J＝12.0Hz,2H),1.87(d,J＝9.6Hz,2H),1.37(d,J＝8.0Hz,6H),1.29(d,J＝6.8Hz,6H).

LCMS:t＝3.94min,619.0(M+H⁺).

實(shí)施例40：5-氯-N²-(2-(二氟甲氧基)-4-(4-(二甲基胺基)哌啶-1-基)苯基)-N⁴-(2-(異丙氧基磺?；?苯基)嘧啶-2,4-二胺(式I-114所示化合物)的制備

合成路線及制備方法：

將中間體12(150mg,397mmol)和1-(4-氨基-3-(二氟甲氧基)苯基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(式3所示化合物)(113mg,397mmol)溶于正丁醇(1.5mL)，并向反應(yīng)液中加入對甲苯磺酸(68mg,397mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，再經(jīng)柱層析分離(DCM/MeOH(v/v＝40:1～20:1))得白色的固體64mg，產(chǎn)率25.7％，即為式I-114所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.63(s,1H),8.63(d,J＝8.4Hz,1H),8.07(s,1H),8.03(d,J＝9.2Hz,1H),7.86(d,J＝8.0Hz,1H),7.57(t,J＝8.0Hz,1H),7.21(t,J＝7.6Hz,1H),7.01(s,1H),6.77(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),6.73(s,1H),6.58-6.31(m,2H),6.54(d,J＝37.6Hz,1H),6.35(d,J＝39.2Hz,1H),3.67(d,J＝12.4Hz,2H),3.20(dd,J＝13.6,6.8Hz,1H),2.73(t,J＝11.6Hz,2H),2.42(s,6H),2.03(d,J＝11.6Hz,2H),1.71(dd,J＝20.8,11.6Hz,2H),1.29(d,J＝6.8Hz,6H).

LCMS:t＝3.62min,627.2(M+H⁺).

實(shí)施例41：5-(二氟甲氧基)-N²-(4-(4-異丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-5-甲基苯基)-N⁴-(2-(異丙基磺?；?苯基)嘧啶-2,4-二胺(式I-115所示化合物)的制備

合成路線及制備方法：

將式12所示化合物(150mg,397mmol)和4-(4-異丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-5-甲基苯胺(式10所示化合物)(105mg,397mmol)溶于n-BuOH(2.5ml)，并向其中加入對甲苯磺酸(68mg,397mmol)，加熱至120℃，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。LCMS檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)混合液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋(25mL)，經(jīng)水洗及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得粗產(chǎn)品，再經(jīng)柱層析分離(DCM/MeOH(v/v＝40:1～20:1))得白色固體42mg，產(chǎn)率17.5％，即為式I-115所示化合物。

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.57(s,1H),8.68(d,J＝8.0Hz,1H),8.10(s,2H),7.89(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.69–7.59(m,1H),7.43(s,1H),7.24–7.13(m,1H),6.80–6.37(m,3H),3.88(s,3H),3.57-2.75(m,10H),2.19(s,3H),1.30(d,J＝6.8Hz,6H).

LCMS:t＝3.42min,605.3(M+H+).

實(shí)施例42：

在該實(shí)施例中，按照與上述實(shí)施例36類似的制備過程，合成了式I-110所示化合物。

實(shí)施例43：式I所示化合物對ALK激酶抑制活性的測定

采用以下方法來測定本發(fā)明的化合物在體外對ALK激酶的抑制活性，該抑制活性采用IC50這一指標(biāo)來表示，IC50即ALK激酶的活性被抑制50％時(shí)的化合物的濃度。

簡寫及定義

mg 毫克

mL 毫升

μg 微克

μl 微升

mM 毫摩爾每升

EDTA 乙二胺四乙酸

DMSO 二甲亞砜

SD 標(biāo)準(zhǔn)偏差

SOP 標(biāo)準(zhǔn)操作程序

實(shí)驗(yàn)材料：

ALK(Carna,Cat.No 08-105,Lot.No.08CBS-0112)

ALK L1196M(Carna,Cat.No 08-529,Lot.No.11CBS-1134)

Peptide FAM-P22(GL Biochem,Cat.No.112393,Lot.No.P080401-XY112393)

ATP(Sigma,Cat.No.A7699-1G,CAS No.987-65-5)

DMSO(Sigma,Cat.No.D2650,Lot.No.474382)

EDTA(Sigma,Cat.No.E5134,CAS No.60-00-4)

96孔板(Corning,Cat.No.3365,Lot.No.22008026)

384孔板(Corning,Cat.No.3573,Lot.No.12608008)

Staurosporine(Sigma,Cat.No.S4400-1MG,Lot.No.046K4080)

實(shí)驗(yàn)方法：

1.配制1倍的激酶緩沖液和終止液

1)1倍激酶緩沖液

50mM HEPES,pH 7.5

0.0015％Brij-35

10mM MgCl₂

2mM DTT

2)終止液

100mM HEPES,pH 7.5

0.015％Brij-35

0.2％Coating Reagent#3

50mM EDTA

2.化合物配制

1)將化合物稀釋50倍最終所需的最高抑制濃度的100％DMSO溶液。轉(zhuǎn)移100μL這個(gè)化合物稀釋液在96孔板中。例如，如果需要最高的抑制劑濃度為1μM，在這一步就制備50μM的DMSO溶液。

2)將化合物按3倍序列稀釋成10個(gè)濃度。

3)添加100μl 100％DMSO到2個(gè)空的沒有化合物控制和無酶控制的相同的96孔板中。標(biāo)記源板。

4)中間板的制備

從源板中轉(zhuǎn)移10μL化合物到一個(gè)新的96孔板中作為中間板。

添加90μL1倍激酶緩沖液到每一個(gè)中間板的孔中。

混合化合物到中間板中并且振蕩10分鐘。

3.準(zhǔn)備試驗(yàn)板

從96孔中間板中每一個(gè)孔中轉(zhuǎn)移5μl到384孔板中作為重復(fù)。例如，96孔板中的A1轉(zhuǎn)移到384孔板中的A1和A2。96孔板中的A2轉(zhuǎn)移到384孔板的A3和A4。

4.激酶反應(yīng)

1)配制2.5倍酶溶液

將激酶加入1倍激酶緩沖液，形成2.5倍酶溶液。

2)配制2.5倍的底物溶液

將FAM標(biāo)記的多肽和ATP加入1倍激酶緩沖液，形成2.5倍底物溶液。

3)試驗(yàn)板已含有5μl化合物的10％的DMSO溶液。

4)轉(zhuǎn)移2.5倍酶溶液到試驗(yàn)板。

5)室溫下孵育10分鐘

6)轉(zhuǎn)移2.5倍肽溶液到試驗(yàn)板。

7)激酶的反應(yīng)和停止

28℃下孵育20分鐘。加入25μl停止液終止反應(yīng)。

5.Caliper讀取數(shù)據(jù)

Caliper上讀取轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)。

6.曲線擬合

1)從Caliper上復(fù)制轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)。

2)把轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化成抑制率數(shù)據(jù)。其中max是指DMSO對照的轉(zhuǎn)化率，min是指無酶活對照的轉(zhuǎn)化率。

Percent inhibition＝(max-conversion)/(max-min)*100.

3)將數(shù)據(jù)導(dǎo)入MS Excel并使用XLFit excel add-in version 4.3.1進(jìn)行曲線擬合。

使用的公式是:

Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))

本發(fā)明所述化合物的生化學(xué)活性通過以上試驗(yàn)進(jìn)行測定，本發(fā)明所述化合物測得的IC50值實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表1。

其中，對ALK抑制活性指定為“A”的化合物提供的IC50≤1nM；活性指定為“B”的化合物提供的IC50為1-10nM；活性指定為“C”的化合物提供的IC50為IC50≥10nM。對ALK L1196M抑制活性指定為“a’”的化合物提供的IC50≤1nM；活性指定為“b”的化合物提供的IC50為1-10nM；活性指定為“c”的化合物提供的IC50為IC50≥10nM。

表1

由此，上述測試結(jié)果表明：本發(fā)明式I所示化合物對ALK及ALKL1196M酶活性均有明顯的抑制作用。結(jié)果顯示，本發(fā)明所述式I所示化合物均具有良好的ALK激酶抑制活性，本發(fā)明所述化合物可用作ALK抑制劑，用于治療一種或一種以上與ALK活性有關(guān)的腫瘤疾病，用于制備成抑制間變性淋巴瘤激酶的抗腫瘤治療藥物。

實(shí)施例44：式I所示化合物對Karpas299細(xì)胞增殖抑制活性的測定

1實(shí)驗(yàn)原理

ATP的含量直接反應(yīng)了細(xì)胞的數(shù)量及細(xì)胞狀態(tài)，通過對ATP進(jìn)行定量測定來檢測培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目?；罴?xì)胞檢測試劑盒采用螢光素酶作檢測物，試劑盒中使用UltraGlow螢光素酶生成的穩(wěn)定輝光型信號，發(fā)光過程中螢光素酶需要ATP的參與，有代謝活性細(xì)胞的呼吸作用和其他生命活動過程可以產(chǎn)生ATP。向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入CellTiter-Glo^TM試劑，測量發(fā)光值，光信號和體系中ATP量成正比，而ATP又和活細(xì)胞數(shù)正相關(guān)，從而可以檢測出細(xì)胞的增殖情況。檢測板使用PE公司的Envision進(jìn)行分析。

2材料

細(xì)胞培養(yǎng)：RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、抗生素(Penicillin-Streptomycin)

細(xì)胞系：Karpas299

檢測試劑：活細(xì)胞檢測試劑盒CellTiter-Glo

其他主要耗材及試劑：化合物稀釋板，中間板，檢測板，DMSO

3實(shí)驗(yàn)步驟

3.1制備細(xì)胞板

將Karpas299細(xì)胞種于黑色384孔板中，每孔45μl細(xì)胞懸液，包含2500個(gè)細(xì)胞每孔。細(xì)胞板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

3.2準(zhǔn)備化合物

1)將待測化合物溶解成10mM DMSO溶液，并放置于氮?dú)夤裰羞M(jìn)行長期保存。

2)取10μl 10mM待測化合物貯存溶液，稀釋成為2.5mM的工作溶液，用ECHO進(jìn)行3倍稀釋至第10個(gè)濃度，即從5μM稀釋至0.25nM，設(shè)置雙復(fù)孔實(shí)驗(yàn)。

3.3化合物處理細(xì)胞

向中間板中加入49μl培養(yǎng)基，再按照對應(yīng)位置，每孔轉(zhuǎn)移1μl梯度稀釋的化合物至中間板，混勻后轉(zhuǎn)移5μl每孔到細(xì)胞板中。細(xì)胞板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。

3.4檢測

向細(xì)胞板中加入每孔25μl的Promega CellTiter-Glo試劑，室溫孵育10分鐘使發(fā)光信號穩(wěn)定。采用PerkinElmer Envision多標(biāo)記分析儀讀數(shù)。

表2顯示了本發(fā)明化合物對Karpas299細(xì)胞增殖抑制活性。其中，在對Karpas299細(xì)胞增殖抑制活性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，活性指定為“D”的化合物提供的IC50≤50nM；活性指定為“E”的化合物提供的IC50為50-100nM；活性指定為“F”的化合物提供的IC50為IC50≥100nM。

表2

由此，上述測試結(jié)果表明：本發(fā)明式I所示化合物對ALK酶具有明顯的抑制活性，并且對Karpas 299細(xì)胞具有明顯的增殖抑制活性。

實(shí)施例45：式I所示化合物對Ba/F3EML4-ALK細(xì)胞增殖抑制活性的測定

1、試劑和耗材

1)細(xì)胞培養(yǎng)：RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、抗生素(Penicillin-Streptomycin),IL-3,嘌呤霉素

2)細(xì)胞系：Ba/F3EML4-ALK

3)檢測試劑：活細(xì)胞檢測試劑盒CellTiter-Glo

4)其他主要耗材及試劑：化合物稀釋板，中間板，檢測板，DMSO

2、實(shí)驗(yàn)原理

ATP的含量直接反應(yīng)了細(xì)胞的數(shù)量及細(xì)胞狀態(tài)，通過對ATP進(jìn)行定量測定來檢測培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目。活細(xì)胞檢測試劑盒采用螢光素酶作檢測物，試劑盒中使用UltraGlow螢光素酶生成的穩(wěn)定輝光型信號，發(fā)光過程中螢光素酶需要ATP的參與，有代謝活性細(xì)胞的呼吸作用和其他生命活動過程可以產(chǎn)生ATP。向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入CellTiter-Glo^TM試劑，測量發(fā)光值，光信號和體系中ATP量成正比，而ATP又和活細(xì)胞數(shù)正相關(guān)，從而可以檢測出細(xì)胞的增殖情況。檢測板使用PE公司的Envision進(jìn)行分析。

3、實(shí)驗(yàn)方法

1)制備細(xì)胞板

將Ba/F3EML4-ALK細(xì)胞分別種于384孔板中，每孔包含300個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

2)準(zhǔn)備化合物

用BRAVO進(jìn)行3倍稀釋，10個(gè)化合物濃度，設(shè)置雙復(fù)孔實(shí)驗(yàn)。

3)化合物處理細(xì)胞

將化合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞板中，化合物起始濃度為5μM。細(xì)胞板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。

4、檢測

向細(xì)胞板中加入Promega CellTiter-Glo試劑，室溫孵育10分鐘使發(fā)光信號穩(wěn)定。采用PerkinElmer Envision多標(biāo)記分析儀讀數(shù)。

表3顯示了本發(fā)明化合物的測試結(jié)果。其中，活性指定為“d”的化合物提供的IC50≤20nM；活性指定為“e”的化合物提供的IC50為20-100nM；活性指定為“f”的化合物提供的IC50為IC50≥100nM。

表3

試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所述化合物對Ba/F3EML4-ALK細(xì)胞具有明顯的增殖抑制活性。

實(shí)施例45動力學(xué)溶解度測試：

動力學(xué)溶解度的測試在藥物發(fā)現(xiàn)階段通常用于藥物的高通量篩選。在動力學(xué)分析中，一個(gè)良好的溶解度應(yīng)該有助于產(chǎn)生可靠的在體外和體內(nèi)的數(shù)據(jù)。由于動力學(xué)溶解度是pH依賴性，水相的pH值總是指定的，通常是測量在pH值為7.4(體液的生理pH值)。

測試方法：稱量定量化合物樣品溶解在純DMSO中，終濃度為10mM，將受試化合物與對照化合物(10mM DMSO母液，每孔10μL)加入含有每孔490μL緩沖液的96孔板中。渦旋2分鐘后，樣品板在振蕩器上室溫下(22±2℃)孵育24小時(shí)。然后轉(zhuǎn)移200μL樣品到MultiScreen過濾板(聚碳酸酯膜)，以微孔真空歧管(millipore vacuum manifold)過濾并收集濾液。以HPLC-UV測定濾液中化合物的濃度。3個(gè)不同濃度的UV標(biāo)準(zhǔn)品溶液與溶解度測試樣品先后進(jìn)樣。每個(gè)樣品進(jìn)針2次，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，求平均值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明所述化合物具有良好的水溶性質(zhì)，且優(yōu)于對照樣(其中對照樣為克唑替尼和色瑞替尼(LDK378))。

實(shí)施例46體外代謝穩(wěn)定性測試：

體外代謝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)評定化合物在一相代謝中的清除率，并能預(yù)測其在肝細(xì)胞和體內(nèi)的固有清除率。我們通過體外代謝穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)評價(jià)了本發(fā)明所述部分化合物在人和大鼠肝微粒體的代謝穩(wěn)定性。其中對照樣為克唑替尼和色瑞替尼(LDK378)。

材料和方法：

1.待測化合物；

2.緩沖液，100nM的磷酸鉀緩沖液，PH 7.4；10mM MgCl₂；

化合物稀釋：

1)中間液：將5μL待測化合物或?qū)φ諛拥膬Υ嫒芤?10mM)用45μL DMSO和450μL 1:1甲醇/水(Conc.:100μM,45％甲醇)進(jìn)行稀釋；

2)工作液：將50μL中間液用450μL 100mM的磷酸鉀緩沖液(Conc.:10μM,4.5％甲醇)稀釋。

停止液：冷的乙腈(CAN)包含100ng/mL甲苯磺丁脲(Tolbutamide)和100ng/mL拉貝洛爾(Labetalol)作為內(nèi)標(biāo)(IS)

實(shí)驗(yàn)操作：

1.使用液體工作站將工作液(10μM)以每孔10μL體積分到相應(yīng)反應(yīng)板上。

2.使用液體工作站將肝微粒體溶液(0.625mg/mL)以每孔80μL體積分到相應(yīng)反應(yīng)板。(微粒體終濃度為0.5mg/mL)

3.在37℃下預(yù)熱化合物與微粒體的混合液10分鐘。

4.在不含有輔助因子的60分鐘反應(yīng)板中，每孔添加10μL濃度為100mM的磷酸緩沖液，并開始計(jì)時(shí)60分鐘。

5.在其他反應(yīng)板中，每孔添加10μL NADPH輔助因子溶液(組分終濃度為1mM NADP,1mM氯化鎂,6.5mM異檸檬酸和1unit/mL異檸檬酸脫氫酶)，啟動反應(yīng)并計(jì)時(shí)。對于0分鐘反應(yīng)板，先加入乙腈終止液終止反應(yīng)后再加入微粒體溶液和NADPH溶液。

6.在5、10、20、30和60分鐘，分別添加入300μL乙腈終止液(含100ng/mL甲苯磺丁脲)，終止反應(yīng)。

7.充分搖板后，在4000rpm下離心20分鐘。

8.轉(zhuǎn)移100μL上清液與300μL純水混勻。

9.使用LC-MS/MS分析樣品。

使用一級動力學(xué)方程計(jì)算半衰期，清除率和固有清除率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明所述化合物顯示出了良好的代謝穩(wěn)定性，為進(jìn)一步的臨床前研究提供了重要依據(jù)。

實(shí)施例47Caco-2實(shí)驗(yàn)：

Caco-2細(xì)胞是一種廣泛用于研究小腸吸收的體外模型，它是一種人的結(jié)腸癌細(xì)胞。單層Caco-2細(xì)胞模型已廣泛地應(yīng)用于評估在小腸吸收過程中的被動和主動轉(zhuǎn)運(yùn)過程。GF120918A為一個(gè)強(qiáng)外排轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑，這些外排轉(zhuǎn)運(yùn)體包含P糖蛋白(P-gp)和乳腺癌抗性蛋白(BCRP)等。發(fā)明人通過此實(shí)驗(yàn)評估了本發(fā)明所述部分化合物的透膜性，從而預(yù)估了化合物在小腸中吸收的性質(zhì)。

其中對照樣為克唑替尼和色瑞替尼(LDK378)。

實(shí)驗(yàn)操作：實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)條件如下：1.測試濃度:2μM(DMSO≤1％)；2.重復(fù)：n＝2；3.方向:雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，包括A→B和B→A兩個(gè)方向；4.孵育時(shí)間：單個(gè)時(shí)間點(diǎn)，2小時(shí)；5.轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液：HBSS，pH7.4；6.孵育條件:37℃,5％CO₂。7.孵育結(jié)束后，取給藥孔和接收孔內(nèi)的樣品溶液立即與含有內(nèi)標(biāo)的冷乙腈溶液混合。8.采用LC/MS/MS方法分析待測化合物在所有樣品(包括起始給藥液，給藥孔上清液，接收液)中的濃度。并計(jì)算表觀滲透系數(shù)，外排比等參數(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明所述化合物相對于對照樣大大提高了透膜性，從而改善了化合物在腸道中的吸收性質(zhì)，并能提高藥物的生物利用度。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。