本發(fā)明涉及一種抗原表位多肽、還涉及針對(duì)該抗原表位多肽的抗體及其用途，特別的，本發(fā)明涉及一種新發(fā)現(xiàn)的人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)I型受體激動(dòng)性抗原表位多肽，還涉及由該抗原表位多肽刺激Balb/c鼠所產(chǎn)生的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體I型受體特異性抗體，還涉及該抗體在提高腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用中的用途。本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤已成為當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類健康并致死亡的主要疾病。近年，腫瘤生物治療取得了較大進(jìn)展，尤其是抗腫瘤單克隆抗體藥物成功應(yīng)用于臨床，取得顯著效果。TRAIL是腫瘤壞死因子超家族新成員。區(qū)別于其他超家族成員，如TNF-α和FasL對(duì)正常細(xì)胞有毒性作用限制了作為抗腫瘤藥物在臨床中應(yīng)用，TRAIL表現(xiàn)為選擇性誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL特異受體的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡而無(wú)系統(tǒng)性細(xì)胞毒作用，使之成為腫瘤治療研究熱點(diǎn)。大量研究表明TRAIL具有很強(qiáng)的殺傷腫瘤能力，是最有應(yīng)用前景的抗腫瘤治療的候補(bǔ)藥物之一，現(xiàn)已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)研究。但由于對(duì)TRAIL耐受或敏感性低的腫瘤類型的存在，因而阻滯TRAIL作為抗腫瘤藥物在臨床推廣應(yīng)用。TRAIL可與它的五個(gè)受體(死亡受體DR4或DR5以及誘騙受體DcR1、DcR2和OPG)結(jié)合。在一些腫瘤細(xì)胞中，誘騙受體DcR1、DcR2或OPG可能與死亡受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TRAIL而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的耐藥。因此，研究者研制針對(duì)選擇性死亡受體DR4或DR5特異性單抗，試圖代替TRAIL發(fā)揮殺腫瘤效果。單抗僅結(jié)合其相應(yīng)的唯一受體，具有高度的特異性。死亡受體的單抗對(duì)特異殺傷腫瘤細(xì)胞效應(yīng)顯示出巨大潛力。臨床前試驗(yàn)表明單抗與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同效應(yīng)，可以提高腫瘤治療的效果。目前，多種針對(duì)TRAIL激動(dòng)性受體的抗體已處在臨床實(shí)驗(yàn)階段，它們有的可以直接代替TRAIL與激動(dòng)性受體結(jié)合殺傷腫瘤細(xì)胞，有的自身不能殺傷腫瘤細(xì)胞，但是可以提高TRAIL殺傷腫瘤細(xì)胞，如AMG655。2012年，MarieP.Piechocki應(yīng)用DR5DNA疫苗免疫小鼠，成功從免疫后小鼠血清中分離出抗DR5的抗體，這些抗體可以在體內(nèi)、體外殺傷腫瘤細(xì)胞，但是經(jīng)同種疫苗免疫后的不同小鼠產(chǎn)生的抗體所具有的殺傷活性不盡相同，這極有可能是因?yàn)獒槍?duì)DR5的DNA疫苗產(chǎn)生了多種抗體，從而影響了其活性。因此篩選激動(dòng)性DR4或DR5抗原表位以代替或提高TRAIL殺傷活性為研制疫苗提供有力支持。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種新發(fā)現(xiàn)的人TRAILI型受體激動(dòng)性抗原表位多肽，該抗原表位多肽具有免疫原性，由該抗原表位多肽刺激Balb/c鼠所產(chǎn)生的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體I型受體特異性抗體具有提高腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體殺傷腫瘤細(xì)胞作用的用途。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：本發(fā)明的一種人TRAILI型受體激動(dòng)性抗原表位多肽，其特征在于所述的抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。編碼所述的人TRAILI型受體激動(dòng)性抗原表位多肽的核苷酸序列也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了抗本發(fā)明所述的人TRAILI型受體激動(dòng)性抗原表位多肽的抗體。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的抗體是通過(guò)以下方法制備得到：將經(jīng)權(quán)利要求1所述的人TRAILI型受體激動(dòng)性抗原表位多肽免疫的Balb/c鼠的外周血以8000rpm離心5min以去除包括紅細(xì)胞在內(nèi)的雜質(zhì)，而后采用ProteinA/GSepharose進(jìn)行純化，獲得人TRAILI型受體激動(dòng)性抗原表位多肽的抗體?？贵w活性檢測(cè)試驗(yàn)表明，單獨(dú)加入本發(fā)明所述的抗體不能有效的誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，而抗體+TRAIL能夠有效地的誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，且起作用強(qiáng)于單獨(dú)使用TRAIL，由此說(shuō)明P7抗原所產(chǎn)生的抗體可以有效的提高TRAIL殺傷HeLa細(xì)胞的能力因此，更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的抗體在制備輔助TRAIL抗腫瘤的藥物中的用途。以及所述的抗原表位多肽在制備廣譜抗腫瘤疫苗中的用途。附圖說(shuō)明圖1為抗體特異性檢測(cè)結(jié)果；圖2為抗體活性檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例一、人TRAILI型受體胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域劃分與合成1、人TRAILI型受體胞外肽段的劃分將人TRAILI型受體胞外區(qū)以20個(gè)氨基酸為一組，分成11組，表1所示，以進(jìn)行多肽的篩選。表1：TRAILI型受體胞外區(qū)肽段的劃分肽段名稱氨基酸序列P1ASGTEAAAATPSKVWGSSAGP2RIEPRGGGRGALPTSMGQHGP3PSARARAGRAPGPRPAREASP4PRLRVHKTFKFVVVGVLLQVP5VPSSAATIKLHDQSIGTQQWP6EHSPLGELCPPGSHRSEHPGP7ACNRCTEGVGYTNASNNLFAP8CLPCTACKSDEEERSPCTTTP9RNTACQCKPGTFRNDNSAEMP10CRKCSRGCPRGMVKVKDCTPP11WSDIECVHKESGNGHN2、抗原肽的合成及偶聯(lián)11組TRAILI型受體抗原肽由強(qiáng)耀生物科技有限公司進(jìn)行合成，并分別與KLH(血藍(lán)蛋白)和BSA(牛血清白蛋白)進(jìn)行偶聯(lián)。實(shí)施例二、抗人TRAILI型受體激動(dòng)性表位的篩選1、動(dòng)物免疫：使用實(shí)施例一合成的與KLH偶聯(lián)的多肽為免疫原(KLH為陰性對(duì)照)，與弗氏完全佐劑乳化后免疫Balb/c鼠，2周后用實(shí)施例一的多肽與弗氏不完全佐劑進(jìn)行第二次免疫，三次免疫后，取小鼠血清進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，效價(jià)達(dá)到16000以上的小鼠，直接腹腔注射上述多肽加強(qiáng)免疫，3天后將小鼠處死，分離外周血。結(jié)果顯示P7組抗原肽刺激的小鼠產(chǎn)生了特異性抗體。2、抗體的純化：將P7抗原肽(ACNRCTEGVGYTNASNNLFA，SEQIDNO.1所示)刺激后的小鼠外周血以8000rpm離心5min以去除紅細(xì)胞等雜質(zhì)，而后采用ProteinA/GSepharose純化抗體。3、抗體特異性的檢測(cè)：1×105HeLa細(xì)胞經(jīng)0.25％胰酶消化，PBS洗滌，加入稀釋的免疫血清，并以KLH免疫的小鼠血清為陰性對(duì)照，冰上孵育30min，PBS洗滌后，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，PBS洗滌后，流式檢測(cè)與細(xì)胞表面受體結(jié)合情況。結(jié)果表明經(jīng)P7抗原肽刺激產(chǎn)生的抗體可以與HeLa細(xì)胞表面的TRAIL受體I結(jié)合，且與陽(yáng)性對(duì)照抗體無(wú)明顯差異，結(jié)果如圖1。4抗體活性的檢測(cè)：將HeLa細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種96孔板，分別設(shè)置陰性對(duì)照組、TRAIL組、抗體組、抗體+TRAIL組，TRAIL濃度為1μg/ml,抗體濃度為1:10稀釋度，24小時(shí)候MTT法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示單獨(dú)加入抗體組不能有效的誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，而抗體+TRAIL組能夠有效地的誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，且起作用強(qiáng)于TRAIL組，由此說(shuō)明P7抗原所產(chǎn)生的抗體可以有效的提高TRAIL殺傷Hela細(xì)胞的能力，結(jié)果如圖2。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3