本發(fā)明屬于生物體外診斷試劑技術領域，具體涉及一種便于提取魚卵或仔魚DNA的固定液。本發(fā)明還涉及該固定液的制備和固定方法。
背景技術：
高質(zhì)量總DNA提取是研究DNA分子在生命代謝的基礎，提取魚卵或仔魚DNA是在魚類產(chǎn)卵季節(jié)，捕獲魚卵或仔魚之后常用的分子生物學試驗。魚卵和仔魚樣本的固定保存是高質(zhì)量DNA提取的保證之一。DNA是屬于堿穩(wěn)定性的物質(zhì)，基本組成成分中的堿基，是DNA所特有的，魚卵或仔魚處在個體生長發(fā)育初期階段，DNA含量較少，若固定保存方法不當，會很難提取到DNA。常規(guī)保存魚卵或仔魚的方法使用固定液為無水乙醇，需要冷藏保存，保藏條件要求高。無水乙醇呈若酸性，在酸性條件下，DNA的 嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵不穩(wěn)定，當在冷藏措施不足時，例如樣本長期置常溫下保存時，容易被水解，很難提取高質(zhì)量DNA，不利于長期保存。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種便于提取魚卵或仔魚DNA在室內(nèi)常溫保存一年以上的固定液。
本發(fā)明通過以下技術方案解決上述技術問題，
一種便于提取魚卵或仔魚DNA的固定液，其特征在于，
包括無水乙醇和可溶性強堿溶液；
各組份的體積份數(shù)的組成為：
無水乙醇450-500份；
可溶性強堿溶液3-5份。
為了獲得更好的技術效果，各組份的體積份數(shù)的組成為：乙醇500份、可溶性強堿溶液3~4份；
為了獲得更好的技術效果，所述無水乙醇的質(zhì)量濃度不低于99.5%；
為了獲得更好的技術效果，所述可溶性強堿溶液的質(zhì)量濃度為1~3%；
為了獲得更好的技術效果，所述可溶性強堿溶液為氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液之一或二者組合；
為了獲得更好的技術效果，所述固定液pH值為7.5-8.0。
本發(fā)明還提供該固定液的制備方法和固定方法，
一種便于提取魚卵或仔魚DNA的固定液的制備方法，其步驟為，
（1）配制質(zhì)量濃度1-3%的可溶性強堿溶液10ml；
（2）準備無水乙醇500ml；
（3）取配制好的質(zhì)量濃度1-3%可溶性強堿溶液3~5ml加入到450-500ml的無水乙醇中，攪拌均勻，得到混合液；
（4）將上述混合液密封，靜置15分鐘，得到便于提取魚卵或仔魚DNA的固定液。
一種便于提取單個魚卵或仔魚DNA的固定液的固定方法，其步驟為，
（1）用小鑷子或常規(guī)滴管將單個魚卵或仔魚放入5ml的EP管中；
（2）換一根干凈無水的常規(guī)滴管吸取已經(jīng)配制完畢的上述固定液；
（3）用常規(guī)滴管取上述固定液4ml，加入含有上述魚卵或仔魚的EP管中，將魚卵或魚苗完全覆蓋；
（4）用封口膜將上述已經(jīng)固定完畢的EP管密封；
（5）將上述已經(jīng)密封完畢的樣本靜置24小時；
（6）更換一次上述已經(jīng)靜置完畢EP管中的上述固定液；
（7）再次用封口膜將上述EP管密封，放常溫下保存。
本發(fā)明提供一種固定液用于保存魚卵或仔魚，尤其是適合保存單個魚卵。使用本發(fā)明固定液在室內(nèi)常溫保存時間達一年后，采取常規(guī)提取單個魚卵或仔魚DNA方法時，仍可提取到DNA。在長期野外采樣過程，沒有冷藏措施情況下，本發(fā)明解決了采取常規(guī)總DNA提取方法在魚卵或仔魚等基因組DNA含量較少樣品，樣本無法長期保存的問題。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以下實施例是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實施例。
實施例1
一種便于提取魚卵或仔魚DNA的固定液，
包括無水乙醇和氫氧化鈉溶液；所述無水乙醇的質(zhì)量濃度99.5%以上；所述氫氧化鈉溶液的質(zhì)量濃度為3%；
各組份的體積份數(shù)的組成為：
無水乙醇500份；
氫氧化鈉溶液3份；
所述固定液pH值為7.5-8.0。
作為優(yōu)選方案之一，各組份的體積份數(shù)的組成為：乙醇450份、氫氧化鉀溶液5份；所述氫氧化鉀溶液的質(zhì)量濃度為1%；
作為優(yōu)選方案之一，各組份的體積份數(shù)的組成為：乙醇475份、氫氧化鈉和氫氧化鉀混合溶液4份；所述氫氧化鉀溶液的質(zhì)量濃度為1.5%；所述氫氧化鈉溶液的質(zhì)量濃度為1.5%；所述氫氧化鉀溶液和所述氫氧化鈉溶液按質(zhì)量比1:1混合。
實施例2
一種便于提取魚卵或仔魚DNA固定液的制備方法，其步驟為，
（1）配制質(zhì)量濃度2%的氫氧化鈉溶液10ml；
（2）準備質(zhì)量濃度99.5%以上的無水乙醇500ml；
（3）取配制好的質(zhì)量濃度2%的氫氧化鈉溶液3~5ml加入到無水乙醇中，攪拌均勻，得到混合液；
（4）將上述混合液密封，靜置15分鐘，得到本發(fā)明實施例1所述便于提取單個魚卵或仔魚DNA的固定液。
實施例3
一種便于提取魚卵或仔魚DNA固定液的固定方法，其步驟為，
（1）用小鑷子或常規(guī)滴管將單個草魚魚卵放入5ml的EP管中；
（2）換一根干凈無水的常規(guī)滴管吸取已經(jīng)配制完備的固定液；
（3）用常規(guī)滴管固定液將加入上述含有單個草魚魚卵的EP管中；
（4）用封口膜將上述已經(jīng)固定完畢的EP管密封；
（5）將上述已經(jīng)密封完畢的樣本靜置24小時；
（6）更換一次上述已經(jīng)靜置完畢EP管中的固定液；
（7）再次用封口膜將上述EP管密封，放常溫下保存。
實施例4
將本發(fā)明方法（試驗組1）與現(xiàn)有的兩種不同固定方法（對比組1、對比組2）做對比實驗，選同一批次魚卵分別用3種不同的方法進行固定保存，固定時間依次為0個月、3個月、6個月、9個月、12個月、18個月、24個月時，取不同固定方法的魚卵提取魚卵總DNA并電泳檢測DNA提取效果，方法如下：沖洗去除固定液后，加入DNA提取緩沖液和細胞裂解緩沖液，將單個魚卵或仔魚剪碎后再加入蛋白酶K和RNA酶，溫育消化。用高濃度NaCl溶液沉淀蛋白質(zhì)，加入異丙醇沉淀DNA，用質(zhì)量百分數(shù)70%的乙醇洗滌沉淀去除鹽離子，12000r/min離心5min，棄去上清，敞蓋待乙醇揮發(fā)后加入超純水或TE溶液溶解。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測比較魚卵總DNA效果，結果見表1，百分比數(shù)字表示DNA電泳檢出率。
實驗說明：試驗組1用本發(fā)明固定液按實施例3所述方法處理固定，放室溫（20℃）下保存；對比組1用無水乙醇替換本發(fā)明固定液按實施例3所述方法處理固定單個魚卵或仔魚后，放入-20℃環(huán)境中冷藏保存；對比組2用無水乙醇替換本發(fā)明固定液按實施例3所述方法處理固定單個魚卵或仔魚后，放入室溫（20℃）下保存。
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實施例5
將本發(fā)明方法（試驗組2）與現(xiàn)有固定方法（對比組3）做對比實驗，模擬同樣在高溫下保存效果，選同一批次魚卵分別用2種不同的方法固定保存，然后同時放入溫度為35℃的烘箱下保存15天，依次在保存時間為1天、3天、7天、10天、15天分別提取魚卵總DNA并電泳檢測DNA提取效果，方法如下：沖洗去除固定液后，加入DNA提取緩沖液和細胞裂解緩沖液，將魚卵或仔魚剪碎后再加入蛋白酶K和RNA酶，溫育消化。用高濃度NaCl溶液沉淀蛋白質(zhì)，加入異丙醇沉淀DNA，用70%乙醇洗滌沉淀去除鹽離子，12000 r/min離心5min，棄去上清，敞蓋待乙醇揮發(fā)后加入超純水或TE溶液溶解。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測比較魚卵總DNA效果，結果見表2，百分比數(shù)字表示DNA電泳檢出率。
實驗說明：試驗組2用本發(fā)明固定液按實施例3所述方法處理固定，放入溫度為35℃的烘箱下保存15天；對比組3用無水乙醇替換本發(fā)明固定液按實施例3所述方法處理固定單個魚卵或仔魚后，放入溫度為35℃的烘箱下保存15天。
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此外，需要說明的是，本說明書中所描述的具體實施例，其配比、工藝所取名稱等可以不同。凡依本發(fā)明專利構思所述的構造、特征及原理所做的等效或簡單變化，均包括于本發(fā)明專利的保護范圍內(nèi)。本發(fā)明所屬技術領域的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離本發(fā)明的結構或者超越本權利要求書所定義的范圍，均應屬于本發(fā)明的保護范圍。
雖然本發(fā)明已以實施例公開如上，但并非用以限定本發(fā)明的保護范圍，任何熟悉該項技術的技術人員，在不脫離本發(fā)明的構思和范圍內(nèi)所作的更動與潤飾，均應屬于本發(fā)明的保護范圍。