本申請(qǐng)要求2015年8月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第62/206,741號(hào)和2016年2月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第62/293,203號(hào)的優(yōu)先權(quán)，這些申請(qǐng)以引用的方式整體并入本文。

背景

諸如通過(guò)光刻法來(lái)合成原位合成陣列上的寡核苷酸探針可產(chǎn)生伴隨在完全所需或預(yù)定長(zhǎng)度下合成的探針序列(“全長(zhǎng)”探針)的不完全或截短探針序列的群體。這類截短探針序列的存在可對(duì)于陣列性能具有不利影響，尤其在需要對(duì)于自由探針末端進(jìn)行酶尋址的陣列中，諸如聚合酶延伸反應(yīng)或連接反應(yīng)。

相比之下，固定于珠粒陣列(例如，Illumina)和其他成點(diǎn)陣列上的寡核苷酸探針通常經(jīng)由胺或合成連接至探針的5’末端的其他官能團(tuán)來(lái)連接至其底物。以這種方式，僅全長(zhǎng)序列得以固定，并且截短或與暴露自由3’末端相關(guān)聯(lián)的其他缺陷得以減少或?qū)嶋H上消除。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

可能需要在合成后從原位合成陣列，諸如通過(guò)光刻法來(lái)制造的陣列上的探針之中選擇性地移除截短探針序列。本公開(kāi)提供完成截短序列的這種選擇性去除的方法，同時(shí)使探針序列的定向倒轉(zhuǎn)以使得從3’-末端合成的探針序列轉(zhuǎn)化成經(jīng)由其5’-末端來(lái)連接至底物的探針序列。

具體地說(shuō)，本公開(kāi)包括原位合成陣列的探針倒轉(zhuǎn)方法，其可使用通用接頭和可購(gòu)得結(jié)構(gòu)單元和試劑。這些方法可包括并入用于釋放自由3’-OH末端的通用可裂解接頭亞磷酰胺，并入具有用于寡核苷酸合成和合成后環(huán)化的正交保護(hù)、可尋址官能團(tuán)的支鏈接頭，使用可購(gòu)得試劑的用于環(huán)化步驟的更有效交聯(lián)化學(xué)，和其他改良。嘗試對(duì)于原位合成陣列進(jìn)行探針倒轉(zhuǎn)的以前方法涉及大量特殊接頭、結(jié)構(gòu)單元和試劑，從而可能使得它用于原位合成陣列的大規(guī)模制造是不可行的。

本公開(kāi)的方面提供方法，其包含：提供具有偶合至所述底物的多個(gè)分支接頭的底物，其中所述底物包含多個(gè)羥烷基，其中每個(gè)分支接頭包含(i)包含第一炔的第一分支和(ii)第二分支，其中所述第二分支包含偶合至第一寡核苷酸的3’末端的第一可裂解接頭，并且其中所述第一寡核苷酸的5’末端偶合至第一疊氮化物基團(tuán)；并且通過(guò)使所述第一疊氮化物基團(tuán)與第二炔反應(yīng)來(lái)環(huán)化所述第一寡核苷酸，其中所述第二炔是所述第一炔或鄰接炔；其中當(dāng)所述第二分支還包含加帽部分時(shí)，所述環(huán)化的效率增加。

在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)分支接頭經(jīng)由所述多個(gè)羥烷基來(lái)偶合至所述底物。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)分支接頭經(jīng)由選自由圖2A、圖2B和圖2C所示結(jié)構(gòu)組成的組的第一中間物來(lái)偶合至所述底物。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述第二炔是所述第一炔。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述第一可裂解接頭經(jīng)由選自由圖3A、圖3B和圖3C所示結(jié)構(gòu)組成的組的第二中間物而變成所述分支接頭的一部分。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述可裂解接頭與所述第一炔之間的比率是約5、約4、約3、約2、約1、約0.5、約0.33、約0.25、約0.2或約0.1。如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包含(c)裂解所述第一可裂解接頭，從而使所述第一寡核苷酸的所述3’末端與所述第二分支分離。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述裂解包含使用堿來(lái)去保護(hù)。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述所述效率是至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，另一個(gè)第二分支包含偶合至第二寡核苷酸的3’末端的第二可裂解接頭，其中所述第二寡核苷酸短于所述第一寡核苷酸，并且其中所述裂解將所述第二寡核苷酸從所述底物中釋放。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述裂解將至少90％的所述第二寡核苷酸從所述底物中釋放。

本公開(kāi)的另一個(gè)方面提供方法，其包括：提供底物；

將多個(gè)分支接頭連接至所述底物，其中所述分支接頭包含(i)包含炔的第一分支和(ii)第二分支；將可裂解接頭連接至所述第二分支的第一基團(tuán)；將加帽部分連接至所述第二分支的第二基團(tuán)；在所述可裂解接頭上以3’至5’定向來(lái)合成第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括(i)經(jīng)由所述可裂解接頭來(lái)偶合至所述第二分支的3’末端和(ii)偶合至疊氮化物基團(tuán)的5’末端；并且通過(guò)使所述疊氮化物基團(tuán)與所述炔反應(yīng)來(lái)環(huán)化所述第一寡核苷酸，從而將所述第一寡核苷酸的所述5’末端偶合至所述第一分支中的一個(gè)。

在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，第二分支的所述第一基團(tuán)與第二分支的所述第二基團(tuán)的比率在約5:1至約1:5之間。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，第二分支的所述第一基團(tuán)與第二分支的所述第二基團(tuán)的比率是約5:1、約4:1、約3:1、約2:1、約1:1、約1:2、約1:3、約1:4或約1:5。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，第二分支的所述第一基團(tuán)與第二分支的所述第二基團(tuán)的比率是約1或更小。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，其中所述加帽部分經(jīng)由加帽亞磷酰胺的中間物來(lái)連接。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述底物包含多個(gè)羥烷基。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述分支接頭經(jīng)由所述多個(gè)羥烷基來(lái)偶合至所述底物。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述方法還包含(c)裂解所述可裂解接頭，從而使所述第一寡核苷酸的所述3’末端與所述第二分支的所述第一基團(tuán)分離。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，第二寡核苷酸連接至所述第二分支的第三基團(tuán)，其中所述第二寡核苷酸缺少連至所述第一分支的共價(jià)鍵，其中所述裂解將所述第二寡核苷酸從所述底物中釋放。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，底物包含受控微孔玻璃。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述合成包含光刻合成。

本公開(kāi)的另一個(gè)方面提供系統(tǒng)，其包含：包含多個(gè)羥烷基的底物；和偶合至所述多個(gè)羥烷基的多個(gè)分支接頭，其中每個(gè)所述分支接頭包含(i)包含第一炔的第一分支和(ii)第二分支，其中所述第二分支包含第一可裂解接頭和加帽部分，其中所述第一可裂解接頭偶合至第一寡核苷酸的3’末端，并且其中所述第一寡核苷酸的5’末端偶合至第一疊氮化物基團(tuán)。

在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述第一疊氮化物基團(tuán)與第二炔反應(yīng)以環(huán)化所述第一寡核苷酸，其中所述第二炔是所述第一炔或鄰接炔。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述可裂解接頭與所述加帽部分之間的比率是約10、約5、約4、約3、約2、約1、約0.5、約0.33、約0.25、約0.2或約0.1。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)分支接頭經(jīng)由選自由圖2A、圖2B和圖2C所示結(jié)構(gòu)組成的組的第一中間物來(lái)偶合至所述底物。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述第一可裂解接頭經(jīng)由選自由圖3A、圖3B和圖3C所示結(jié)構(gòu)組成的組的第二中間物而變成所述分支接頭的一部分。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述加帽部分是酰基、二烷氧基磷?；⑼榛?、烷氧基羰基或二烷基氨基羰基。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述第一可裂解接頭可使用堿，例如，氨、甲基胺、1,2-二氨基乙烷和碳酸鉀來(lái)裂解。

本公開(kāi)的另一個(gè)方面提供方法，其包含：提供具有偶合至所述底物的多個(gè)分支接頭的底物，其中每個(gè)分支接頭包含(i)包含第一炔的第一分支和(ii)第二分支，其中所述第二分支包含偶合至第一寡核苷酸的3’末端的可裂解接頭，和其中所述第一寡核苷酸的5’末端偶合至疊氮化物基團(tuán)；使所述疊氮化物基團(tuán)與第二炔反應(yīng)以環(huán)化所述第一寡核苷酸，所述反應(yīng)在室溫下通過(guò)緩沖液中的Cu(I)催化劑來(lái)催化，所述第二炔是所述第一炔或鄰接炔；并且(c)裂解所述可裂解接頭，從而使所述第一寡核苷酸倒轉(zhuǎn)。

在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，所述第二炔是所述第一炔。在本文提供方面的一些實(shí)施方案中，方法還包含：(d)提供與在(c)中獲得的倒轉(zhuǎn)第一寡核苷酸的至少一部分互補(bǔ)的第二寡核苷酸，其中在與所述倒轉(zhuǎn)第一寡核苷酸雜交之后，所述第二寡核苷酸留下3’突出端；并且(e)用聚合酶和熒光標(biāo)記dNTP來(lái)延伸所述第二寡核苷酸，從而證實(shí)所述第一寡核苷酸的所述倒轉(zhuǎn)。

本公開(kāi)的額外方面和優(yōu)勢(shì)從以下詳細(xì)說(shuō)明變得為本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易知，其中僅示出并描述本公開(kāi)的例示性實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的是，本公開(kāi)能夠具有其他以及不同的實(shí)施方案，并且其若干細(xì)節(jié)能夠在各種不同方面做出修改，所有均不脫離公開(kāi)內(nèi)容。因此，附圖和詳述應(yīng)被視為在本質(zhì)上是說(shuō)明性的而不是限制性的。

以引用的方式并入

本說(shuō)明書中提及的所有公布、專利和專利申請(qǐng)都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和個(gè)別地指示將各個(gè)別公布、專利或?qū)＠暾?qǐng)以引用的方式并入一般。

附圖簡(jiǎn)述

本發(fā)明的新型特征在隨附權(quán)利要求中具體闡述。通過(guò)參考以下闡述利用了本發(fā)明的原理的說(shuō)明性實(shí)施方案的詳細(xì)描述及其附圖將獲得對(duì)本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)的更好理解：

圖1A示出使探針倒轉(zhuǎn)的示例性方法。

圖1B示出用于分支接頭(左側(cè))和可裂解接頭(中心)，和溴己基亞磷酰胺(右側(cè))的示例性中間物。

圖1C示出用于并入圖1B的中間物的探針倒轉(zhuǎn)的示例性寡核苷酸(SEQ ID NO:1)。

圖2A示出產(chǎn)生分支接頭的示例性中間物。

圖2B示出產(chǎn)生分支接頭的示例性中間物。

圖2C示出產(chǎn)生分支接頭的示例性中間物。

圖3A示出產(chǎn)生可裂解接頭(CL)的示例性中間物。

圖3B示出產(chǎn)生可裂解接頭(CL)的示例性中間物。

圖3C示出產(chǎn)生可裂解接頭(CL)的示例性中間物。

圖4A示出未倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的示例性HPLC輪廓。

圖4B示出沒(méi)有加帽亞磷酰胺的倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的示例性HPLC輪廓。

圖4C示出具有1:1比率的可裂解接頭與加帽亞磷酰胺的倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的示例性HPLC輪廓。

圖4D示出具有1:2比率的可裂解接頭與加帽亞磷酰胺的倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的示例性HPLC輪廓。

圖5A示出未倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的示例性質(zhì)譜。

圖5B示出倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的示例性質(zhì)譜。

圖6A示出沒(méi)有寡核苷酸的對(duì)照芯片的示例性熒光圖像。

圖6B示出具有未倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的對(duì)照芯片的示例性熒光圖像。

圖6C示出具有倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的芯片的示例性熒光圖像。

圖7A示出具有延伸反應(yīng)之前的倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的芯片的示例性熒光圖像。

圖7B示出具有倒轉(zhuǎn)延伸寡核苷酸的芯片的示例性熒光圖像。

圖7C示出具有延伸反應(yīng)之前的未倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的芯片的示例性熒光圖像。

圖7D示出具有延伸反應(yīng)之后的未倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的芯片的示例性熒光圖像。

圖8A示出具有–NNT-3’的不同序列變換的寡核苷酸陣列(按呈現(xiàn)的順序分別為SEQ ID NO 4和5)的示意圖。

圖8B示出具有延伸反應(yīng)之后的倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的芯片的示例性熒光圖像。

圖9A示出具有–NN-3’的不同序列變換的寡核苷酸陣列(按呈現(xiàn)的順序分別為SEQ ID NO 6和5)的示意圖。

圖9B示出具有延伸反應(yīng)之后的倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的芯片的示例性熒光圖像。

圖10示出具有與Cy3-標(biāo)記互補(bǔ)DNA雜交的倒轉(zhuǎn)核苷酸的晶片上的對(duì)準(zhǔn)標(biāo)志的圖像。

圖11A示出在單一堿基延伸中并入dGTP核苷酸的圖像。

圖11B示出在單一堿基延伸中并入dTTP核苷酸的圖像。

圖11C示出在單一堿基延伸中并入dATP核苷酸的圖像。

圖11D示出在單一堿基延伸中并入dCTP核苷酸的圖像。

圖12A示出在單一堿基延伸中將dGTP核苷酸并入倒轉(zhuǎn)晶片芯片的3’位置的圖像。

圖12B示出在單一堿基延伸中將dTTP核苷酸并入倒轉(zhuǎn)晶片芯片的3’位置的圖像(插圖：展示陣列特征的實(shí)際圖像的放大部分)。

圖12C示出在單一堿基延伸中將dATP核苷酸并入倒轉(zhuǎn)晶片芯片的3’位置的圖像。

圖12D示出在單一堿基延伸中將dCTP核苷酸并入倒轉(zhuǎn)晶片芯片的3’位置的圖像。

詳述

本公開(kāi)提供環(huán)化并倒轉(zhuǎn)原位合成寡核苷酸探針的方法。描述特定環(huán)化化學(xué)，包括使用溴基或碘化物基團(tuán)的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)(click chemistry reaction)。這類反應(yīng)可用于使寡核苷酸的5’末端結(jié)合至表面結(jié)合接頭分子；然后，環(huán)化寡核苷酸可使其3’末端釋放，從而將寡核苷酸倒轉(zhuǎn)。本文公開(kāi)的方法也可減少或消除不含有完全合成寡核苷酸序列的截短寡核苷酸探針，同時(shí)保存含有完全合成寡核苷酸序列的全長(zhǎng)寡核苷酸探針。舉例來(lái)說(shuō)，全長(zhǎng)寡核苷酸可在釋放3’末端之前環(huán)化，而非全長(zhǎng)寡核苷酸保持非環(huán)化并且因此在釋放3’末端時(shí)從表面移除。

術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”可意指核苷酸鏈。在一些情況下，寡核苷酸小于200個(gè)殘基長(zhǎng)度，例如，15與100個(gè)之間的核苷酸長(zhǎng)度。寡核苷酸可包含至少或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)堿基。寡核苷酸可為約3至約5個(gè)堿基，約1至約50個(gè)堿基，約8至約12個(gè)堿基，約15至約25個(gè)堿基，約25至約35個(gè)堿基，約35至約45個(gè)堿基，或約45至約55個(gè)堿基。寡核苷酸(也被稱為“寡核苷酸”)可為任何類型寡核苷酸(例如，引物)。寡核苷酸可包含天然核苷酸、非天然核苷酸或其組合。

術(shù)語(yǔ)“點(diǎn)擊化學(xué)”可意指模塊化、寬范圍、給出高產(chǎn)量、只產(chǎn)生無(wú)害副產(chǎn)物的反應(yīng)，諸如可通過(guò)非色譜方法來(lái)移除，并且立體定向(但是不一定對(duì)映選擇性)的副產(chǎn)物。示例性點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)是疊氮化物和炔的胡伊斯根1,3-偶極環(huán)加成，即，疊氮化物與炔的銅催化反應(yīng)以形成5員雜原子環(huán)，被稱為Cu(I)催化疊氮化物-炔環(huán)加成(CuAAC)。

術(shù)語(yǔ)“點(diǎn)擊化學(xué)部分”可為末端炔。

如本文使用的術(shù)語(yǔ)“約”是指指定量的+/-10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

如本文使用的術(shù)語(yǔ)“環(huán)化(circularize)”或“環(huán)化(circularization)”是指使其兩個(gè)末端經(jīng)由共價(jià)鍵來(lái)連接至底物或支撐物的寡核苷酸結(jié)構(gòu)。

隨著快速基因組測(cè)序和大基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的出現(xiàn)，遺傳信息可以無(wú)數(shù)方式來(lái)利用。這類應(yīng)用中的一個(gè)是寡核苷酸陣列。寡核苷酸陣列，或普遍地被稱為DNA微陣列或DNA陣列或DNA芯片的一般結(jié)構(gòu)是表面上的點(diǎn)或可尋址位置的明確界定的陣列。每個(gè)點(diǎn)可含有相對(duì)短DNA鏈的層，被稱為“探針”或“捕獲探針”(例如，Schena編,“DNA Microarrays A Practical Approach”,Oxford University Press；Marshall等人(1998)Nat.Biotechnol.16:27-31；各自以引用方式并入本文)。至少存在用于產(chǎn)生陣列的兩種技術(shù)。一種技術(shù)基于光刻(例如Affymetrix)，而另一種技術(shù)基于機(jī)器人控制噴墨(spotbot)技術(shù)(例如，Arrayit.com)。產(chǎn)生微陣列的其他方法是已知的并且可在本文中使用任何這類已知方法。

總體上，安置于陣列中的給定點(diǎn)的寡核苷酸(探針或捕獲探針)被選擇來(lái)結(jié)合核酸或目標(biāo)核酸的互補(bǔ)核酸的至少一部分。在適當(dāng)雜交條件下，將含水樣品與陣列接觸來(lái)安置。然后將陣列充分地洗滌以移除所有非特異性吸附物質(zhì)。為了確定是否捕獲目標(biāo)序列，陣列可通過(guò)添加例如與目標(biāo)序列的未占據(jù)部分互補(bǔ)的熒光標(biāo)記寡核苷酸序列來(lái)“顯影”。然后，微陣列使用輸出陣列圖像的微陣列讀取器或掃描器來(lái)“讀取”。展現(xiàn)強(qiáng)熒光的點(diǎn)對(duì)于此特定目標(biāo)序列來(lái)說(shuō)是陽(yáng)性的。

探針可包含沉積以便產(chǎn)生成點(diǎn)陣列的生物材料。探針可包含根據(jù)其他技術(shù)來(lái)合成、沉積或定位以形成陣列的材料。因此，在下文出于便利，根據(jù)任何這些技術(shù)來(lái)形成的微陣列可總體上并且共同地被稱為“探針陣列”。術(shù)語(yǔ)“探針”不限于以陣列格式來(lái)固定的探針。實(shí)際上，本文描述的功能和方法也可相對(duì)于其他并行測(cè)定裝置來(lái)使用。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)探針固定于珠粒、光纖或其他底物或介質(zhì)上或中時(shí)，可采用這些功能和方法。

在本公開(kāi)的方法和系統(tǒng)中，探針可連接至固體底物。探針可直接或經(jīng)由接頭來(lái)結(jié)合至底物。接頭可包含例如氨基酸、多肽、核苷酸、寡核苷酸或不干擾探針功能的其他有機(jī)分子。

固體底物可為生物、非生物、有機(jī)、無(wú)機(jī)底物或任何這些底物的組合。底物可以例如一個(gè)或多個(gè)顆粒、鏈、沉淀物、凝膠、薄片、管材、球、容器、毛細(xì)管、襯墊、切片、薄膜、板、載玻片或半導(dǎo)體集成芯片形式存在。固體底物可為扁平的或可采用替代表面配置。舉例來(lái)說(shuō)，固體底物可含有發(fā)生合成或沉積的凸起或凹陷區(qū)域。在一些實(shí)例中，可選擇固體底物來(lái)提供適當(dāng)光吸收特性。舉例來(lái)說(shuō)，底物可為聚合Langmuir Blodgett膜、功能化玻璃(例如受控微孔玻璃)、二氧化硅、氧化鈦、氧化鋁、銦錫氧化物(ITO)、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO₂、SiN₄、改性硅、半導(dǎo)體集成電路(IC)芯片的頂部介電層，或各種凝膠或聚合物諸如(聚)四氟乙烯、(聚)偏氟二乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、多環(huán)烯烴中的任何一個(gè)或其組合。

固體底物可包含聚合物涂層或凝膠，諸如聚丙烯酰胺凝膠或PDMS凝膠。凝膠和涂層可另外包含改變其物理化學(xué)性質(zhì)例如疏水性的組分。舉例來(lái)說(shuō)，聚丙烯酰胺凝膠或涂層可在其聚合物結(jié)構(gòu)中包含改性丙烯酰胺單體諸如乙氧基化丙烯酰胺單體、磷酸膽堿丙烯酰胺單體、甜菜堿丙烯酰胺單體及其組合。

DNA微陣列可使用預(yù)先合成寡核苷酸的空間引導(dǎo)原位合成或固定來(lái)制造。在兩種情況下，合成寡核苷酸通常在添加單體的情況下在3’至5’方向上，使用標(biāo)準(zhǔn)3’-亞磷酰胺試劑和固相合成方案(例如，M.Egli等人編,“Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry”,John Wiley&Sons)來(lái)進(jìn)行。主要雜質(zhì)是由于不完全單體偶合以及在較小程度上脫嘌呤反應(yīng)所產(chǎn)生的截短、部分長(zhǎng)度序列。

在一方面，制造預(yù)先合成寡核苷酸探針的陣列通常涉及經(jīng)由5’-末端將寡核苷酸共價(jià)連接至底物，當(dāng)寡核苷酸在高通量合成器中合成時(shí)經(jīng)由添加至末端的反應(yīng)性改性劑(參見(jiàn)S.J.Beaucage等人Curr.Med.Chem.2001,8,1213-44)。這確保連接至支撐物的探針主要是全長(zhǎng)序列，因?yàn)榻囟绦蛄性诤铣善陂g被加帽并且變得無(wú)反應(yīng)性(Brown T and Brown T,Jr.(2005-2015)Solid-phase oligonucleotide synthesis.[Online]Southampton,UK,ATDBio.<http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis>[2016年8月9日訪問(wèn)])。

本公開(kāi)的顯著優(yōu)勢(shì)是寡核苷酸探針的3’-羥基在底物的“遠(yuǎn)端”，并且自由地可用于酶反應(yīng)，諸如模板引導(dǎo)的聚合酶催化鏈延伸和連接；并且可利用此特性來(lái)執(zhí)行用于檢測(cè)并定量遺傳多態(tài)性的非常敏感和特異性測(cè)定(K.Lindroos等人Nucleic Acids Res.2001,29,e69；Gunderson KL等人Nature Genetics 2005,37,549-54)。

另一方面，DNA微陣列也可使用序列的原位合成直接在支撐物上制造。在此情況下，序列以高度并行方式通過(guò)使用噴墨的空間引導(dǎo)合成(T.R.Hughes等人Nature Biotechnol 2001,19,342-7；C.Lausted等人Genome Biol 2004,5,R58)、光刻技術(shù)(A.C.Pease等人Proc Natl Acad Sci USA 1994,91,5022-6；G.McGall等人Proc Natl Acad Sci USA 1996；93:13555-60；S.Singh-Gasson等人Nature Biotechnol 1999,17,974-8；)或電化學(xué)技術(shù)(PLoS ONE 2006,1,e34；B.Y.Chow等人Proc Natl Acad Sci USA 2009,106,15219-24)來(lái)“印刷”。在此處，合成也在3’至5’方向上進(jìn)行(雖然在5’至3’方向上的固相寡核苷酸合成是可行的，但是不太有效和經(jīng)濟(jì)，提供較低產(chǎn)率和產(chǎn)品純度)。然而，所得探針在3’-末端處連接至底物，并且在合成期間出現(xiàn)的任何截短序列雜質(zhì)保留于支撐物上，其在光刻合成的情況下可尤其造成問(wèn)題(J.Forman等人Molecular Modeling of Nucleic Acids,第13章，第221頁(yè),American Chemical Society(1998)和G.McGall等人J.Am.Chem.Soc.119:5081-5090(1997))。因此，使用以這種方式制成的陣列，基于聚合酶的延伸測(cè)定通常是不可行的。

盡管上述限制，光刻合成仍然是制造極高密度DNA陣列的非常有吸引力的方法，因?yàn)樗軌蛑圃斐^(guò)1千萬(wàn)個(gè)排列序列/cm²(A.R.Pawloski等人J Vac Sci Technol B 2007,25,2537-46)，并且在制造環(huán)境中是高度可擴(kuò)展的。

因此，開(kāi)發(fā)使這類探針陣列上的序列倒轉(zhuǎn)的有效方法是非常合乎需要的。

多個(gè)探針可位于固體底物上的一或多個(gè)可尋址區(qū)域(點(diǎn)、位置等)，在本文中被稱為“像素”。在一些情況下，固體底物包含至少約2、3、4、5、6或7-10、10-50、50-100、100-500、500-1,000、1,000-5,000、5,000-10,000、10,000-50,000、50,000-100,000、100,000-500,000、500,000-1,000,000或超過(guò)1,000,000個(gè)具有探針的像素。在一些情況下，固體底物包含至多約2、3、4、5、6或7-10、10-50、50-100、100-500、500-1,000、1,000-5,000、5,000-10,000、10,000-50,000、50,000-100,000、100,000-500,000、500,000-1,000,000或超過(guò)1,000,000個(gè)具有探針的像素。在一些情況下，固體底物包含約2、3、4、5、6或7-10、10-50、50-100、100-500、500-1,000、1,000-5,000、5,000-10,000、10,000-50,000、50,000-100,000、100,000-500,000、500,000-1,000,000或超過(guò)1,000,000個(gè)具有探針的像素。

在一些情況下，具有不含有探針的像素是有用的。這類像素可充當(dāng)對(duì)照點(diǎn)以便增加測(cè)量的質(zhì)量，例如，通過(guò)使用結(jié)合至所述點(diǎn)來(lái)估計(jì)并校正非特異性結(jié)合。在一些情況下，可控制探針的密度以促進(jìn)探針的連接或增強(qiáng)探針的隨后檢測(cè)。

在一些實(shí)例中，具有冗余像素是有用的，所述冗余像素具有與另一個(gè)像素相同的探針序列但是在實(shí)體上可能與其他像素不相鄰或接近。通過(guò)這類探針陣列所獲得的數(shù)據(jù)可能不太易發(fā)生制造非理想性和測(cè)量誤差。

在一些情況下，除了并入目標(biāo)中的標(biāo)記以外，將標(biāo)記連接至像素內(nèi)的探針。在這類系統(tǒng)中，所捕獲的目標(biāo)可導(dǎo)致兩個(gè)標(biāo)記在像素中彼此緊密接近。如以前論述，特異性標(biāo)記之間的相互作用可產(chǎn)生獨(dú)特可檢測(cè)信號(hào)。舉例來(lái)說(shuō)，在目標(biāo)和探針上的標(biāo)記分別是可參與熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)現(xiàn)象的熒光供體和受體部分時(shí)，可檢測(cè)到FRET信號(hào)強(qiáng)化或信號(hào)淬滅。

合成倒轉(zhuǎn)寡核苷酸

圖1A示出將原位合成探針陣列中的探針倒轉(zhuǎn)并且移除截短探針序列的示例性方法。首先，制備合成底物，其包含可用表面基團(tuán)諸如羥基，如圖1A中示出。這些羥基是合成底物或支撐物上的羥烷基的一部分。舉例來(lái)說(shuō)，表面可用試劑例如羥烷基三烷氧基硅烷來(lái)改性以提供可用于分支接頭連接的羥烷基?；蛘?，聚合物薄膜可施加至合成底物或支撐物的表面，其中聚合物含有用于連接的自由羥基。此外，與DNA合成試劑和處理?xiàng)l件相容并且含有羥烷基的支撐物可用于連接分支接頭。

然后，分支接頭(例如，ALK，在圖1B中)可經(jīng)由各種中間物來(lái)添加至合成底物或支撐物的表面以便在一個(gè)位置/分支上引入炔并且在另一個(gè)位置/分支上引入DMT保護(hù)羥基(以便稍后連接寡核苷酸)。用于引入分支接頭的上述中間物包括但不限于分支接頭亞酰胺中間物(例如，圖1B(左圖)和圖2C中的炔改性劑絲氨醇亞磷酰胺)，或如圖2A和圖2B中示出的中間物。

現(xiàn)在轉(zhuǎn)向圖2A和2B，乙酰丙基(LEV)是用于羥基的保護(hù)基并且可使用含有水合肼、醋酸和吡啶的試劑(例如，使用1:1吡啶/醋酸中的0.5M水合肼)來(lái)特異性地移除。4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)是可在酸性條件下移除的另一種羥基保護(hù)基。2-氰乙基(CE)是亞磷酸鹽/磷酸鹽保護(hù)基并且可在堿性條件下移除。圖2A、2B和2C示出的分子可從Glen Research(Sterling,VA 20164)購(gòu)得。

用于引入分支接頭的中間體，例如，在圖2A和圖2B中示出的中間體，不但可與表面羥烷基反應(yīng)以便連接至支撐物，而且具有兩個(gè)正交保護(hù)羥基以允許引入疊氮化物連接寡核苷酸、炔或加帽部分。舉例來(lái)說(shuō)，需要少許額外步驟來(lái)將炔基團(tuán)連接至分支接頭的第一分支。首先，圖2A和圖2B中的亞磷酰胺中間物偶合至支撐物上的表面羥烷基，隨后將所得亞磷酸鹽氧化至磷酸鹽。然后將LEV保護(hù)基團(tuán)選擇性移除而不影響DMT保護(hù)基團(tuán)以致于揭露羥基。含有炔的亞磷酰胺，例如，化合物A，然后偶合至顯露羥基以完成具有炔的第一分支的合成。將亞磷酸鹽氧化至磷酸鹽可在化合物A與表面羥烷基的反應(yīng)之后執(zhí)行。

或者，圖2C中的炔改性劑絲氨醇亞磷酰胺可直接偶合至支撐物。因?yàn)槿不鶊F(tuán)預(yù)先安裝于此中間物中，所以不需要額外步驟來(lái)將炔基團(tuán)引入第一分支。

在安裝含有炔基團(tuán)的第一分支之后，可移除DMT保護(hù)基團(tuán)以提供另一個(gè)羥基作為用于連接可裂解接頭，隨后連接寡核苷酸的處置柄。寡核苷酸可通過(guò)任何寡核苷酸合成法以逐步方式來(lái)引入。用于每一輪寡核苷酸合成，執(zhí)行加帽步驟以便在延伸(在此自由羥基上沒(méi)有寡核苷酸鏈的延伸)之后使用乙?；蛟诹姿峄笫褂闷渌线m加帽分子將自由羥基加帽。以這種方式，防止加帽失敗序列參與目標(biāo)寡核苷酸的鏈延長(zhǎng)的其余部分。因此，這些加帽失敗序列是截短寡核苷酸，如圖1A中示出。在寡核苷酸鏈延伸的最終步驟處，最后一個(gè)核酸的顯露5’羥基可用含有疊氮化物的尾部來(lái)加帽。此步驟可通過(guò)首先引入在末端處具有離去基團(tuán)的接頭來(lái)實(shí)現(xiàn)。離去基團(tuán)可為Cl、Br、I、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽或三氟甲磺酸鹽。然后將離去基團(tuán)用疊氮化物取代。溴化物至疊氮化物轉(zhuǎn)化的實(shí)例在圖1A的第二行中示出。

如上所述，接頭可包含合成后反應(yīng)性基團(tuán)，諸如用于點(diǎn)擊化學(xué)。舉例來(lái)說(shuō)，可使用炔基團(tuán)，其在寡核苷酸的DNA合成期間可為穩(wěn)定的，并且因此將不需要使用保護(hù)/去保護(hù)策略。具有亞磷酰胺部分的分支接頭和可裂解接頭可添加至合成底物或支撐物以提供稍后使用標(biāo)準(zhǔn)DNA合成方案來(lái)引入寡核苷酸的接近點(diǎn)。在一些情況下，接頭可使用具有延長(zhǎng)偶合時(shí)間(例如，3分鐘)的標(biāo)準(zhǔn)DNA合成方案來(lái)添加至合成底物。

具體來(lái)說(shuō)，在形成自由羥基之后，可裂解接頭亞酰胺中間物(CL)可并入分支接頭中，諸如圖1B(中間圖)、圖3A、圖3B和圖3C示出的可裂解接頭。可裂解接頭可使用標(biāo)準(zhǔn)DNA合成方案來(lái)添加至合成底物。在一些情況下，可裂解接頭可使用具有延長(zhǎng)偶合時(shí)間(例如，3分鐘)的標(biāo)準(zhǔn)DNA合成方案來(lái)添加至合成底物。

然后，標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸探針合成可在可裂解接頭上經(jīng)由其自由羥基來(lái)進(jìn)行以便合成探針序列。合成探針序列可包含全長(zhǎng)探針序列和截短探針序列。全長(zhǎng)探針序列可在5’末端上包含具有溴基(例如，溴)基團(tuán)的接頭基團(tuán)(參見(jiàn)，例如，圖1A)或碘化物基團(tuán)或在一個(gè)末端處包含其他離去基團(tuán)。舉例來(lái)說(shuō)，DNA合成方案的最后偶合可使用5’-溴己基亞磷酰胺來(lái)執(zhí)行以在合成寡核苷酸的5’末端處提供溴基團(tuán)。在一些情況下，全長(zhǎng)探針序列可包含5’末端上的–OH基團(tuán)，并且–OH基團(tuán)可與試劑反應(yīng)以添加在其末端上具有所需離去基團(tuán)(諸如Br、I、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽和三氟甲磺酸鹽)的接頭。然后，全長(zhǎng)探針序列的5’末端上的這些離去基團(tuán)可轉(zhuǎn)化成其他基團(tuán)，諸如疊氮化物基團(tuán)。舉例來(lái)說(shuō)，疊氮化鈉和碘化鈉于DMF中的溶液可用于使合成寡核苷酸與離去基團(tuán)在其5’末端上反應(yīng)以提供疊氮化物基團(tuán)。在一些情況下，合成底物可在與疊氮化物基團(tuán)反應(yīng)之前和/或之后加以洗滌(例如，使用乙腈)。

在一個(gè)實(shí)例中，受控微孔玻璃(CPG)珠粒用作合成底物，并且寡核苷酸探針在連接至底物的可裂解接頭上得以合成。珠粒在管柱中使用乙腈來(lái)洗滌并且在氮?dú)庀赂稍铩Ｈ缓?，將洗滌珠粒添加?3毫克(mg)疊氮化鈉和30mg碘化鈉于2毫升(mL)于干燥DMF中的溶液并且在65℃下允許反應(yīng)1小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物冷卻并且用吸移管將溶劑移除，并且珠粒用2mL DMF和2mL乙腈洗滌兩次。然后，將珠粒轉(zhuǎn)移至管柱并且在氮?dú)庀赂稍?。寡核苷酸?’末端羥基也可遵循由Eric T Kool(J Org Chem.2004,69,2404-2410)公布的報(bào)告方案來(lái)轉(zhuǎn)化成含有疊氮化物的接頭基團(tuán)。

全長(zhǎng)探針序列的末端上的疊氮化物基團(tuán)可環(huán)化至相同或不同分支接頭的另一個(gè)分支，例如，如圖1A的第三行中示出。環(huán)化可經(jīng)由點(diǎn)擊化學(xué)(例如，Cu(I)點(diǎn)擊化學(xué)或Cu⁺點(diǎn)擊化學(xué))來(lái)完成。用于點(diǎn)擊化學(xué)的催化劑可為Cu(I)鹽，或通過(guò)使用還原劑將Cu(II)試劑還原成Cu(I)試劑來(lái)原位制成的Cu(I)鹽(Pharm Res.2008Oct；25(10):2216–2230)。用于點(diǎn)擊化學(xué)的已知Cu(II)試劑可購(gòu)得，包括但不限于Cu(II)-(TBTA)復(fù)合物和Cu(II)(THPTA)復(fù)合物。作為三-[(1-芐基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺的TBTA，也稱為三-(芐基三唑基甲基)胺，是Cu(I)鹽的穩(wěn)定配位體。作為三-(羥丙基三唑基甲基)胺的THPTA是Cu(I)的另一個(gè)穩(wěn)定劑。環(huán)化也可使用無(wú)銅點(diǎn)擊DNA連接來(lái)完成，諸如通過(guò)環(huán)應(yīng)變促進(jìn)炔-疊氮化物環(huán)加成反應(yīng)(參見(jiàn)，例如，Chem.Commun.,2011,47:6257-6259或Nature,2015,519(7544):486-90)。

可進(jìn)行環(huán)化以使得僅全長(zhǎng)探針序列得以環(huán)化。然后，可裂解接頭可例如通過(guò)使用堿包括但不限于氨、甲基胺、1,2-二氨基乙烷和碳酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)去保護(hù)來(lái)裂解?？闪呀饨宇^的裂解可釋放探針序列的3’-OH末端，從而釋放截短探針序列并且使環(huán)化全長(zhǎng)探針序列倒轉(zhuǎn)，如圖1A的第三行示出。

由于全長(zhǎng)探針序列的大小和空間限制，炔與疊氮化物之間的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的效率和位置可變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)化形成均連接至同一分支接頭的炔基團(tuán)與疊氮化物基團(tuán)之間的共價(jià)鍵。在另一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)化形成各自連接至不同分支接頭的炔基團(tuán)與疊氮化物基團(tuán)之間的共價(jià)鍵。雖然分子內(nèi)反應(yīng)(相對(duì)于同一分支接頭)總體上優(yōu)于分子間反應(yīng)(在兩個(gè)不同分支接頭之間)，但是前體的反應(yīng)性以及空間位阻可使得分子間反應(yīng)更有利，尤其在與用于分子內(nèi)反應(yīng)的候選物相比，存在用于分子間反應(yīng)的更多候選物時(shí)或在歸因于空間位阻，與用于分子內(nèi)反應(yīng)的候選物相比，用于分子間反應(yīng)的候選物更可接近時(shí)。如本文使用的環(huán)化效率是指在底物上的疊氮化物至1,2,3-三唑的轉(zhuǎn)化率。

影響點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的效率的一個(gè)方法是改變底物上的炔與疊氮化物基團(tuán)之間的比率。這可通過(guò)使第二接頭上的可利用羥基與用于引入可裂解接頭中間物和加帽部分的中間物混合物反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。這類加帽部分可為?；?、二烷氧基磷酰基、烷基、烷氧基羰基或二烷基氨基羰基基團(tuán)，其可與自由羥基反應(yīng)并且使得羥基不可用于連接可裂解接頭和隨后帶有疊氮化物的寡核苷酸。分支接頭上的加帽部分的存在不僅減少與寡核苷酸相關(guān)聯(lián)的空間位阻，而且它還提供較高炔與疊氮化物的比率以基于疊氮化物基團(tuán)的消耗來(lái)改進(jìn)環(huán)化效率。當(dāng)加帽部分與用于引入可裂解接頭的中間物一起添加時(shí)，疊氮化物基團(tuán)可具有與其反應(yīng)的多個(gè)鄰接炔基團(tuán)。

最后，本公開(kāi)允許經(jīng)由與表面上的羥基反應(yīng)的個(gè)別亞磷酰胺單體來(lái)將帶有疊氮化物的寡核苷酸和炔引入支撐物，而不是引入在分支接頭上的寡核苷酸和炔。

所使用的接頭，包括分支接頭和可裂解接頭，在諸如本文論述的寡核苷酸探針合成方法期間可為穩(wěn)定的。接頭的穩(wěn)定性可允許寡核苷酸探針合成到無(wú)需使用保護(hù)-去保護(hù)步驟來(lái)保持接頭。接頭可缺少反應(yīng)性物質(zhì)。在接頭中不存在反應(yīng)性物質(zhì)可導(dǎo)致接頭在DNA合成方法期間呈惰性，從而可消除保護(hù)-去保護(hù)步驟的需要。在一些情況下，在DNA合成之前存在的接頭的至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或99.999％在DNA合成之后保持完整。

本文論述的探針倒轉(zhuǎn)技術(shù)可在水性介質(zhì)中進(jìn)行。避免使用有機(jī)溶劑可使得這類技術(shù)更環(huán)保并且增加化學(xué)操作和廢物處置的簡(jiǎn)易性。

本文論述的探針倒轉(zhuǎn)技術(shù)可在至少約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0或13.5的pH下進(jìn)行。本文論述的探針倒轉(zhuǎn)技術(shù)可在至多約14.0、13.5、13.0、12.5、12.0、11.5、11.0、10.5、10.0、9.5、9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0或0.5的pH下進(jìn)行。本文論述的探針倒轉(zhuǎn)技術(shù)可在約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0或13.5的pH下進(jìn)行。在一些情況下，本文論述的探針倒轉(zhuǎn)技術(shù)可在生理pH或大約生理pH下，諸如在約7.365或約7.5下進(jìn)行。在生理pH下進(jìn)行反應(yīng)可減少或消除操作苛刻物質(zhì)或反應(yīng)條件的需要，并且可使用水性介質(zhì)。

本文論述的探針倒轉(zhuǎn)技術(shù)可在約15℃、20℃、25℃、30℃或35℃的溫度下進(jìn)行。本文論述的探針倒轉(zhuǎn)技術(shù)可在至多約15℃、20℃、25℃、30℃或35℃的溫度下進(jìn)行。本文論述的探針倒轉(zhuǎn)技術(shù)可在至少約15℃、20℃、25℃、30℃或35℃的溫度下進(jìn)行。在一些情況下，本文論述的探針倒轉(zhuǎn)技術(shù)可在室溫或大約室溫下，諸如在約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約20℃至約26℃，或約20℃至約22℃下進(jìn)行。在室溫下進(jìn)行反應(yīng)可減少或消除操作苛刻物質(zhì)或反應(yīng)條件的需要。

釋放截短探針序列可增加存在于陣列中的全長(zhǎng)序列的百分比。在一些情況下，在探針倒轉(zhuǎn)方法之后保持結(jié)合至陣列底物的探針的至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或99.999％是全長(zhǎng)序列。在一些情況下，探針倒轉(zhuǎn)方法可釋放在探針倒轉(zhuǎn)方法之前結(jié)合至陣列底物的截短探針的至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或99.999％。

合成底物可包含不同形式或形狀，諸如珠?；虮馄疥嚵?。合成底物可包含任何合適材料，包括但不限于玻璃(例如，受控微孔玻璃)、硅或塑料。底物可包含聚合物涂層或凝膠，諸如聚丙烯酰胺凝膠或PDMS凝膠。凝膠和涂層可另外包含改變其物理化學(xué)性質(zhì)例如疏水性的組分。舉例來(lái)說(shuō)，聚丙烯酰胺凝膠或涂層可在其聚合物結(jié)構(gòu)中包含改性丙烯酰胺單體諸如乙氧基化丙烯酰胺單體、磷酸膽堿丙烯酰胺單體、甜菜堿丙烯酰胺單體及其組合。

對(duì)于各種應(yīng)用，倒轉(zhuǎn)探針可提供優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)未倒轉(zhuǎn)探針的許多優(yōu)勢(shì)。舉例來(lái)說(shuō)，如以上論述，探針倒轉(zhuǎn)可移除大多數(shù)或全部不需要的截短序列，從而提供含有多達(dá)100％全長(zhǎng)序列的倒轉(zhuǎn)探針群體。另外，倒轉(zhuǎn)探針可具有自由3’OH基團(tuán)，其可有利于進(jìn)行酶反應(yīng)(例如，單一或多個(gè)堿基延伸、連接酶反應(yīng))。倒轉(zhuǎn)探針也可用于通過(guò)合成來(lái)測(cè)序(SBS)。

實(shí)施例

實(shí)施例1–受控微孔玻璃上的探針倒轉(zhuǎn)

具有炔部分的分支接頭亞磷酰胺在DNA合成器上使用標(biāo)準(zhǔn)DNA合成方案來(lái)偶合至dT-衍生受控微孔玻璃(CPG)固體支撐物(參見(jiàn)，例如，圖1A)。然后，可裂解接頭(CL，參見(jiàn)圖1B)使用標(biāo)準(zhǔn)程序來(lái)連接至分支接頭(Alk，參見(jiàn)圖1B)，隨后合成19-基體DNA序列(5’-GGCTGAGTATGTGGTCTAT-3’(SEQ ID NO:1))。在最后寡核苷酸偶合步驟中，并入5’-溴己基亞磷酰胺(Br-Hex，參見(jiàn)圖1B)(參見(jiàn)圖1C)。DNA合成使用ABI 394 DNA合成器使用標(biāo)準(zhǔn)DNA合成方案來(lái)進(jìn)行。延長(zhǎng)偶合時(shí)間(3分鐘)用于所有接頭亞磷酰胺(Alk、CL和Br-Hex)。

一旦DNA合成完成，通過(guò)在65℃下在CPG固體支撐物上用DMF中的NaN₃/NaI處理寡核苷酸1小時(shí)來(lái)將5’-溴基轉(zhuǎn)化至疊氮化物基團(tuán)。13mg疊氮化鈉(NaN₃)和30mg碘化鈉(NaI)溶解于2mL干燥DMF中；然后將此溶液添加至2mL微量離心管中的負(fù)載于CPG珠粒上的寡核苷酸。在65℃下加熱反應(yīng)混合物1小時(shí)。在冷卻之后，將反應(yīng)混合物和CPG珠粒轉(zhuǎn)移回到管柱。珠粒用水(4mL)和乙腈(6mL)洗滌，然后在氮?dú)庀赂稍铩?/p>

然后，點(diǎn)擊環(huán)化使用銅催化疊氮化物-炔環(huán)加成(CuAAC)化學(xué)來(lái)執(zhí)行。新鮮制備5mM濃度的抗壞血酸儲(chǔ)備溶液(例如，2.0mL水中的1.8mg抗壞血酸)。銅(II)-TBTA儲(chǔ)備溶液以55％DMSO中的10mM銅(II)-TBTA的濃度來(lái)制備(例如，將5mg CuSO₄于1mL水中的溶液與11.6mg TBTA于1.1mL DMSO中的溶液混合)。具有炔-疊氮化物修飾寡核苷酸的CPG珠粒在耐壓密閉的小瓶中與55μL水混合。將20μL的2M三乙基銨乙酸酯(TEAA)緩沖液(pH 7.0)添加至小瓶，隨后添加95μL的DMSO。將小瓶渦動(dòng)。然后，將20μL的5mM抗壞血酸儲(chǔ)備溶液添加至小瓶，并且短暫渦動(dòng)。溶液通過(guò)將氮?dú)夤呐萃ㄈ肫渲?分鐘來(lái)脫氣。將10μL的10mM銅(II)-TBTA儲(chǔ)備溶液添加至小瓶。然后將小瓶用氮?dú)鉀_洗、密封、充分地渦動(dòng)，并且在室溫下過(guò)夜培育。小瓶中的最終濃度為約0.5μmol CPG珠粒、約50vol％DMSO、約50vol％水、0.5mM抗壞血酸、0.2M TEAA緩沖液，和0.5mM Cu-TBTA復(fù)合物。

僅具有疊氮化物官能度的全長(zhǎng)寡核苷酸得以環(huán)化(參見(jiàn)，例如，圖1A)。一旦點(diǎn)擊環(huán)化完成，使用標(biāo)準(zhǔn)去保護(hù)條件(例如，在55℃下用NH₄OH處理15小時(shí))將寡核苷酸去保護(hù)并且從可裂解接頭(CL)位點(diǎn)中裂解。

點(diǎn)擊環(huán)化和探針倒轉(zhuǎn)效率通過(guò)將標(biāo)準(zhǔn)未倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的HPLC輪廓(參見(jiàn)圖4A)與倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的HPLC輪廓(圖4B)比較來(lái)測(cè)試。標(biāo)記為“1”的峰對(duì)應(yīng)于未倒轉(zhuǎn)寡核苷酸，而標(biāo)記為“2”的峰對(duì)應(yīng)于倒轉(zhuǎn)寡核苷酸。HPLC分析展示約70％的寡核苷酸在測(cè)試反應(yīng)條件下倒轉(zhuǎn)。將點(diǎn)擊環(huán)化反應(yīng)時(shí)間從過(guò)夜增加至3天未增加倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的百分比。

點(diǎn)擊環(huán)化的效率降低可歸諸于致密CPG固體支撐物上的DNA分子的空間位阻。為了減少固體支撐物上的DNA探針密度，在第一亞磷酰胺(分支接頭，Alk)偶合之后立即使用不同比率(例如，1:0、1:1、1:2)的可裂解接頭(CL)與加帽亞磷酰胺(CAP，參見(jiàn)圖4A中的插圖)的混合物。直接在分支接頭(Alk)偶合步驟之后使用加帽亞磷酰胺(CAP)可減少固體支撐物上的寡核苷酸密度，并且可增加可最后有助于點(diǎn)擊環(huán)化的炔的百分比(參見(jiàn)圖4A-4D，右圖)。DNA密度減少50％(CL:CAP 1:1；疊氮化物:炔比率1:2，圖4C)導(dǎo)致大約90％的寡核苷酸倒轉(zhuǎn)。DNA密度減少66％(CL:CAP 1:2；疊氮化物:炔比率1:3，圖4D)提供寡核苷酸的約100％倒轉(zhuǎn)。倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的存在通過(guò)將點(diǎn)擊環(huán)化之前的未倒轉(zhuǎn)(參見(jiàn)圖5A)的質(zhì)譜點(diǎn)擊環(huán)化之后的倒轉(zhuǎn)寡核苷酸(參見(jiàn)圖5B)的質(zhì)譜比較來(lái)再確認(rèn)。

實(shí)施例2–芯片上的探針倒轉(zhuǎn)

芯片(例如，硅烷化玻璃表面)上的DNA合成以與在G.H.McGall,F.A.Fidanza,Photolithographic synthesis of arrays.In Methods in Molecular Biology:DNA Arrays,methods and Protocols；J.B.Rampal編；Humana Press:Torowa,NJ,2001；第170卷,71-101中所描述的方案類似的方式來(lái)進(jìn)行。DNA密度減少不被視為對(duì)于芯片上寡核苷酸倒轉(zhuǎn)是必不可少的，因?yàn)樵诰哂泻蜎](méi)有密度減少的情況下，倒轉(zhuǎn)效率是相似的。為了在芯片上產(chǎn)生特定DNA特征，使用光可裂解亞磷酰胺代替標(biāo)準(zhǔn)DMT-亞磷酰胺。

在DNA合成之后，通過(guò)在65℃下用NaN₃和NaI于DMF中的混合物處理2小時(shí)將5’-溴基轉(zhuǎn)化成疊氮化物。13mg疊氮化鈉(NaN3)和30mg碘化鈉(NaI)溶解于2mL干燥DMF中；然后將溶液經(jīng)由注射器添加至含有芯片的流槽，并且反應(yīng)混合物在65℃下加熱2小時(shí)，并且在1小時(shí)之后將新鮮反應(yīng)混合物推至流槽中。在冷卻至室溫之后，將反應(yīng)混合物移除并且寡核苷酸用DMF、水和乙腈洗滌，并且在氮?dú)庀赂稍铩?/p>

然后，全長(zhǎng)寡核苷酸使用CuAAC點(diǎn)擊化學(xué)來(lái)環(huán)化(參見(jiàn)，例如，圖1A)。含有芯片的流槽用氮?dú)鉀_洗約5-10分鐘。反應(yīng)混合物制備如下：將275μL水添加至2mL微量離心管，隨后添加pH 7.0下的100μL的0.2M三乙基銨乙酸酯(TEAA緩沖液)和475μL的DMSO。將混合物渦動(dòng)，添加100μL的5mM抗壞血酸儲(chǔ)備溶液(如實(shí)施例1所描述)，并且將混合物短暫渦動(dòng)。然后溶液通過(guò)將氮?dú)夤呐?分鐘來(lái)脫氣。將50μL的10mM銅(II)-TBTA儲(chǔ)備溶液(如實(shí)施例1所描述)添加至混合物。反應(yīng)混合物用氮?dú)鉀_洗1分鐘，然后在氮?dú)夥障陆?jīng)由注射器添加至芯片。點(diǎn)擊環(huán)化反應(yīng)在室溫下執(zhí)行24小時(shí)。

點(diǎn)擊環(huán)化之后，寡核苷酸用50％EDA/H₂O混合物來(lái)去保護(hù)。EDA處理用于將DNA堿基去保護(hù)并且將寡核苷酸的3’末端從可裂解接頭(CL)位點(diǎn)處裂解。在室溫下將芯片在乙二胺(EDA)與水的1:1混合物培育7小時(shí)，并且每2小時(shí)將EDA:H₂O去保護(hù)混合物用新鮮制備EDA:H₂O混合物交換。其后芯片用水充分地洗滌，然后在4℃下存儲(chǔ)。此步驟移除截短以及未環(huán)化寡核苷酸，只允許全長(zhǎng)倒轉(zhuǎn)寡核苷酸序列保持連接至固體表面。EDA處理還使得3'-OH基團(tuán)可用于進(jìn)一步酶干預(yù)(參見(jiàn)，例如，圖1A)。

為了觀測(cè)芯片上倒轉(zhuǎn)寡核苷酸，將與倒轉(zhuǎn)序列互補(bǔ)的Cy3-標(biāo)記DNA序列用于雜交(參見(jiàn)，例如，圖6A-6C)。通過(guò)在芯片頂部將500nM DNA溶液安置于4x鹽水檸檬酸鈉緩沖液(SSC)中，將倒轉(zhuǎn)寡核苷酸與Cy3標(biāo)記互補(bǔ)DNA序列雜交。在45℃下培育反應(yīng)混合物1小時(shí)。其后芯片用4x SSC緩沖液洗滌幾次。在雜交之后來(lái)自Cy3探針的熒光信號(hào)的存在證實(shí)在芯片上存在倒轉(zhuǎn)寡核苷酸(參見(jiàn)圖6C)。然而，在沒(méi)有寡核苷酸的對(duì)照芯片中(圖6A)或在沒(méi)有點(diǎn)擊環(huán)化的情況下將寡核苷酸去保護(hù)并裂解的芯片中(圖6B)，未觀察到熒光信號(hào)。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)所有芯片上寡核苷酸得以倒轉(zhuǎn)。

倒轉(zhuǎn)寡核苷酸上的3’-OH基團(tuán)的存在通過(guò)使用熒光dNTP的引物延伸來(lái)證實(shí)并觀測(cè)(參見(jiàn)，例如，圖7)。首先通過(guò)在45℃下將芯片與4x SSC中的1μM DNA模板培育1小時(shí)來(lái)使倒轉(zhuǎn)寡核苷酸與DNA模板(5’-CGAACGACGCAATAGACCACATACTCAGCC-3’(SEQ ID NO:2))雜交。其后，用水將過(guò)量DNA模板從芯片中洗掉。延伸反應(yīng)混合物使用5μL的10x標(biāo)準(zhǔn)Taq緩沖液(最終量：1X)，8μL的5單位/μL TaqDNA聚合酶溶液(最終量：40單位)，包含Alexa568-dUTP、dATP、dCTP和dGTP的10μL的10μM dNTP(最終濃度2μM)和27μL水來(lái)制備。延伸反應(yīng)混合物與雜交DNA模板一起安置于芯片頂部并且在50℃下在密封盒中在潮濕氣氛下培育2小時(shí)。在延伸之后，芯片用水洗滌，然后成像。

熒光掃描展示來(lái)自倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的延伸部分的強(qiáng)烈信號(hào)(圖7B)，而在不含有寡核苷酸的對(duì)照芯片中未發(fā)現(xiàn)熒光(圖7A)。為了控制在5’OH未端處的非特異性引物延伸的可能性，對(duì)于具有自由5’OH的標(biāo)準(zhǔn)未倒轉(zhuǎn)寡核苷酸執(zhí)行引物延伸。在此情況下，在進(jìn)行引物延伸反應(yīng)之前(圖7C)或之后(圖7D)也未觀察到熒光信號(hào)，指示在5’OH末端處缺少引物延伸。

實(shí)施例3–ABI合成寡核苷酸陣列的探針倒轉(zhuǎn)

寡核苷酸陣列在ABI合成器上合成并且使用如本文論述的銅-催化疊氮化物炔環(huán)加成反應(yīng)來(lái)倒轉(zhuǎn)。一組陣列使用在3’末端處具有呈其不同變換形式(例如，-CCT-3’、-GCT-3’、-ACT-3’、-TCT-3’等，如圖8A中示出)的序列-NNT-3’的三種核苷酸來(lái)制造。另一組陣列使用在3’末端處具有呈其不同變換形式(例如，-CT-3’、-GT-3’、-AT-3’、-TT-3’等，如圖9A中示出)的序列-NN-3’的三種核苷酸來(lái)制造。

隨后，倒轉(zhuǎn)寡核苷酸陣列首先使用與端接–TAT-3’或–AT-3’的那些寡核苷酸互補(bǔ)的DNA模板來(lái)雜交。通過(guò)在45℃下將陣列與4x SSC中的1mL的1μM DNA模板培育1小時(shí)，將倒轉(zhuǎn)寡核苷酸與DNA雜交。其后，首先使用4X SSC將過(guò)量DNA模板從陣列中洗掉，然后使用引物延伸緩沖液來(lái)洗滌。

然后，引物延伸以此模板使用Taq DNA聚合酶來(lái)執(zhí)行。延伸反應(yīng)混合物包含Taq多聚酶(8uL，40單位)和1μM的dNTP(包括Alexa568-dUTP)并且與雜交DNA模板一起安置于陣列頂部。將陣列在50℃下在密封盒中在潮濕氣氛下培育1小時(shí)。一旦延伸完成，將陣列用水洗滌，然后成像。

成像實(shí)驗(yàn)在倒轉(zhuǎn)寡核苷酸的3’末端完全匹配模板DNA的陣列區(qū)域中展示信號(hào)(參見(jiàn)圖8B和圖9B)。

實(shí)施例4–晶片上探針倒轉(zhuǎn)

寡核苷酸陣列在晶片上合成并且使用如本文論述的銅催化疊氮化物炔環(huán)加成反應(yīng)來(lái)倒轉(zhuǎn)。

隨后，倒轉(zhuǎn)寡核苷酸陣列晶片通過(guò)在55℃下將對(duì)準(zhǔn)標(biāo)志與4x SSC緩沖液中的400μL的1μM Cy3-標(biāo)記互補(bǔ)DNA序列雜交1小時(shí)來(lái)分析。其后，使用4x SSC將任何過(guò)量Cy3-標(biāo)記DNA從陣列中洗掉，然后成像。圖10示出具有與Cy3-標(biāo)記互補(bǔ)DNA雜交的倒轉(zhuǎn)核苷酸的晶片上的對(duì)準(zhǔn)標(biāo)志的圖像。

然后通過(guò)在55℃下培育1小時(shí)將晶片芯片的頂部接頭(FC2’)與FC2引物(FC2’的互補(bǔ)序列)雜交來(lái)執(zhí)行單一堿基引物延伸(在與芯片上倒轉(zhuǎn)DNA序列互補(bǔ)的目標(biāo)序列上)。頂部接頭包含倒轉(zhuǎn)序列頂部的區(qū)域。過(guò)量引物使用4x SSC來(lái)洗掉，隨后使用并入緩沖液來(lái)進(jìn)行最終洗滌。

將含有DNA聚合酶和熒光團(tuán)標(biāo)記可逆終止子dNTP(所有四個(gè)核苷酸經(jīng)過(guò)標(biāo)記)的Illumina并入反應(yīng)混合物(400μL)安置于晶片芯片頂部，所述晶片芯片已經(jīng)與FC2引物雜交。將芯片在50℃下在密封盒中在潮濕氣氛下培育1小時(shí)。一旦并入完成，將晶片陣列使用并入緩沖液來(lái)洗滌，然后成像(參見(jiàn)圖11A-11D)。在通道1中發(fā)光的特征顯示并入dGTP核苷酸(參見(jiàn)圖11A)。在通道2中發(fā)光的特征顯示dTTP并入(參見(jiàn)圖11B)，并且在通道3中并入dATP(參見(jiàn)圖11C)并且在通道4中并入dCTP(參見(jiàn)圖11D)。晶片芯片的條形碼區(qū)域(中間接頭)含有具有不同堿基組合的序列陣列，并且出于任何特定原因，輸入合成堿基可為四個(gè)堿基(A、T、G、C)中的任何一個(gè)。圖11A-11D所示圖像證明在陣列上的位置處觀察發(fā)生哪一種堿基延伸的能力，從而允許通過(guò)合成來(lái)測(cè)序。

為了對(duì)于倒轉(zhuǎn)晶片芯片序列進(jìn)行單一堿基引物延伸，將3’阻斷互補(bǔ)序列，即在5’位置處具有突出端(3’-ACGTTCGAACGTAGCT-5’(SEQ ID NO:3))的FC2，以與如上所述相同的方式與倒轉(zhuǎn)晶片的頂部接頭雜交。將含有DNA聚合酶和熒光團(tuán)標(biāo)記可逆終止子dNTP(所有四個(gè)核苷酸經(jīng)過(guò)標(biāo)記)的Illumina并入反應(yīng)混合物(400mL)安置于晶片芯片頂部，所述晶片芯片已經(jīng)與引物(3’ddc-FC2-突出端)雜交。然后將芯片在50℃下在密封盒中在潮濕氣氛下培育1小時(shí)。一旦并入完成，晶片陣列使用并入緩沖液來(lái)洗滌，然后成像。特征只在通道2中發(fā)光，證明并入dTTP(參見(jiàn)圖12B)。由于目標(biāo)引物突出端中的第一堿基是dATP，酶只在倒轉(zhuǎn)芯片的3’位置處并入dTTP。在任何其他通道中未觀察到信號(hào)(參見(jiàn)圖12A、12C-12D)。

盡管本文已示出和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將顯而易見(jiàn)，所述實(shí)施方案僅作為實(shí)例提供。在不脫離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)將會(huì)想到眾多變化、改變和替代。應(yīng)理解，本文所述的本發(fā)明的實(shí)施方案的各種替代方案可用于實(shí)行本發(fā)明。意圖在于，以下權(quán)利要求書定義本發(fā)明的范圍并且因此可涵蓋處于這些權(quán)利要求書范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)以及其等效物。