本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種利用有機(jī)廢物生產(chǎn)聚果糖的固體發(fā)酵方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

聚果糖是果糖分子以β-1，2糖苷鍵或β-2，6糖苷鍵連接的多糖，人們將果糖單元數(shù)大于20的稱為多聚果糖，小于20的稱為低聚果糖。聚果糖是一種優(yōu)良的水溶性膳食纖維，可以預(yù)防便秘與結(jié)腸癌、降低血液膽固醇、穩(wěn)定血糖水平。同時還是一種很好的“益生元”，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增殖雙歧桿菌、促進(jìn)鈣的吸收、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抗齲齒等保健功能，可減少肝臟毒素，能在腸中生成抗癌的有機(jī)酸，有顯著的防癌功能；另外，聚果糖不僅是動物的免疫增強(qiáng)劑，也可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性，增強(qiáng)植物體對病害的抵抗力，是一種安全而新型的飼料添加劑。

果寡糖又稱低聚果糖（Fructo-oligosaccharides，F(xiàn)OS），是一種天然的飼料添加劑，果寡糖具有非著色性、賦形性、耐堿性、耐高溫、保水性和穩(wěn)定性等優(yōu)點，果寡糖吸濕性低，可減緩飼料因吸濕而發(fā)霉變酸；同時果寡糖的防霉性能好，可以延長飼料保存期。作為添加劑應(yīng)用于飼料中主要是寡果三糖（GF2）、寡果四糖（GF3）和寡果五糖（GF4）。果寡糖廣泛存在于香蕉、大麥、大蒜、洋蔥、黑麥、馬鈴薯、洋姜、小麥、出小麥等植物小，但提取較為困難，且難以批量生產(chǎn)，果寡糖在工業(yè)生產(chǎn)上有兩種制造方法，一種是用菊粉含量高的菊芋作為原料，用熱水抽提菊粉，經(jīng)微生物菊粉酶部分水解生成果糖聚合度為2～10的鏈狀聚果糖；第二種是用蔗糖作為原料制造的，在一定濃度的蔗糖培養(yǎng)基中，利用微生物產(chǎn)生的β-呋喃果糖苷酶作用，將蔗糖轉(zhuǎn)化為聚果糖；但這兩種方法都必須依賴于外源酶的作用，由于生物酶自身的特點，制約了低聚果糖的生產(chǎn)效率和聚合度。另一方面，目前用于生產(chǎn)低聚果糖的菊粉酶和β-呋喃果糖苷酶來源有限，生產(chǎn)成本高，轉(zhuǎn)化效率低，生產(chǎn)時間長，因而開發(fā)研究新型聚果糖生產(chǎn)工藝具有明顯的現(xiàn)實意義和經(jīng)濟(jì)價值。

膠凍樣類芽孢桿菌PS04可以產(chǎn)生聚果糖，現(xiàn)有技術(shù)研究了PS04在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生聚果糖的方法，但液體發(fā)酵后聚果糖的提取過程成本較高，很難滿足禽畜飼料的生產(chǎn)需要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種利用有機(jī)廢物生產(chǎn)聚果糖的固體發(fā)酵方法及其應(yīng)用。

一種利用有機(jī)廢物生產(chǎn)聚果糖的固體發(fā)酵方法，是將膠凍樣類芽孢桿菌PS04的菌液與有機(jī)廢物混合培養(yǎng)4～5d得有機(jī)廢物-PS04培養(yǎng)物，從有機(jī)廢物-PS04培養(yǎng)物中提取即獲得聚果糖；所述有機(jī)廢物中蔗糖的含量為2.5～5.1wt%；水含量為55～63.3 wt %。

在利用膠凍樣類芽孢桿菌PS04進(jìn)行固體發(fā)酵時，發(fā)現(xiàn)對其固體發(fā)酵生產(chǎn)聚果糖產(chǎn)量影響顯著的因素包括固體培養(yǎng)基中蔗糖的含量、水含量和發(fā)酵的時間，本發(fā)明利用有機(jī)廢物發(fā)酵時，必須同時控制這三個因素。

另外，研究還發(fā)現(xiàn)，膠凍樣類芽孢桿菌PS04的接種量也會影響最終聚果糖的產(chǎn)量，但影響沒有上面幾個因素顯著，優(yōu)選地，所述膠凍樣類芽孢桿菌PS04的接種量為1～10 V/W %。

具體地，本發(fā)明所述有機(jī)廢物為木薯渣或者麩皮。

更優(yōu)選地，當(dāng)所述有機(jī)廢物為木薯渣時，是將膠凍樣類芽孢桿菌PS04的菌液與木薯渣混合培養(yǎng)4d得有機(jī)廢物-PS04培養(yǎng)物，從有機(jī)廢物-PS04培養(yǎng)物中提取即獲得聚果糖；所述有機(jī)廢物中蔗糖的含量為5.06wt%；水含量為63.3 wt %。

更優(yōu)選地，當(dāng)所述有機(jī)廢物為麩皮時，是將膠凍樣類芽孢桿菌PS04的菌液與麩皮混合培養(yǎng)5d得有機(jī)廢物-PS04培養(yǎng)物，從有機(jī)廢物-PS04培養(yǎng)物中提取即獲得聚果糖；所述有機(jī)廢物中蔗糖的含量為2.5wt%；水含量為55 wt %。

本發(fā)明通過固體發(fā)酵培養(yǎng)后獲得的有機(jī)廢物-PS04培養(yǎng)物可直接與飼料混合，從而滿足禽畜飼料生產(chǎn)的需要。

因此，本發(fā)明還提供所述有機(jī)廢物-PS04培養(yǎng)物作為飼料添加劑的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明通過膠凍樣類芽孢桿菌PS04在木薯渣培養(yǎng)基中的培養(yǎng)獲得聚果糖，具體是將膠凍樣類芽孢桿菌PS04的菌液與有機(jī)廢物混合培養(yǎng)4～5d得有機(jī)廢物-PS04培養(yǎng)物，從有機(jī)廢物-PS04培養(yǎng)物中提取即獲得聚果糖；所述有機(jī)廢物中蔗糖的含量為2.5～5.1wt%；水含量為55～63.3 wt %；本發(fā)明所述方法克服了液體發(fā)酵產(chǎn)聚果糖提取成本高，難以滿足禽畜飼料生產(chǎn)需要的缺陷，同時，利用本發(fā)明所述方法生產(chǎn)的聚果糖含量高，發(fā)酵完的培養(yǎng)物可直接與飼料混合，可以大大降低聚果糖提取和干燥需要的能源消耗，生產(chǎn)成本低，能帶來良好的經(jīng)濟(jì)效益。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬 于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

查氏培養(yǎng)基：硝酸鈉 3g，磷酸氫二鈉 1g，硫酸鎂( MgSO₄·7H₂O) 0.5g，氯化鉀 0.5g，硫酸亞鐵 0.01g，蔗糖 30g，蒸餾水 1000mL；用于PS04的液體培養(yǎng)。

麩皮培養(yǎng)基：稱取麩皮25g，按麩皮：蒸餾水=1：1（W/W）的比例配制麩皮培養(yǎng)基，攪拌混合均勻后，裝于500mL錐形瓶中，高壓蒸汽滅菌（121℃滅菌20min）。作為實施例1的固體培養(yǎng)基用于發(fā)酵。

木薯渣培養(yǎng)基：木薯渣25g、自來水50ml，混合均勻后裝入500ml三角瓶內(nèi)，用棉塞塞好包扎好，滅菌后備用，作為實施例2的固體培養(yǎng)基用于發(fā)酵。

實施例1 以麩皮為固體培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)聚果糖

1、PS04液體培養(yǎng)：查氏培養(yǎng)基按100mL/500mL錐形瓶分裝，高壓蒸汽滅菌（121℃滅菌20min）后備用。刮取新鮮的菌苔1～2 環(huán)接種在500mL錐形瓶中，30 ℃、150 r/min，振蕩培養(yǎng)84 h后制得PS04液體菌種。

2、PS04固體培養(yǎng)：在滅菌冷卻后的麩皮培養(yǎng)基中，按5%（V/W）的接種量接種PS04液體菌種，接種后攪拌，使菌種和麩皮培養(yǎng)基充分混勻，置于30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)84h，期間不定時震蕩翻動3～4次。

制作麩皮培養(yǎng)基，接種后，分別準(zhǔn)確稱取發(fā)酵前和發(fā)酵后的麩皮各l0g（無菌操作）作為待測樣品，用于測定發(fā)酵前和發(fā)酵后麩皮中所含菌種量，結(jié)果表明：培養(yǎng)前后菌種的量明顯增加，說明PS04菌能在麩皮培養(yǎng)基中生長，能以麩皮作為固體培養(yǎng)基（表1）。

3、PS04固體培養(yǎng)基單因素優(yōu)化

多糖提取及產(chǎn)量的測定：將發(fā)酵完的固體培養(yǎng)基加入150mL的蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，?00℃的水浴鍋中水浴浸提1h，待其冷卻后過濾，取濾液，15000 r/min離心30 min（4℃）。量取30mL上清液于離心瓶中，加入9倍體積的 95%乙醇，混合均勻后4℃下靜置沉淀多糖30min，15000 r/min離心15 min（4℃），除上清液。將沉淀用鑷子輕輕夾起放入準(zhǔn)備好的濾紙上（已烘干稱質(zhì)量，記為W₁）中，105 ℃烘至恒重，冷卻后稱質(zhì)量（記為W₂），多糖質(zhì)量=W₂-W₁。

（1）蔗糖含量對PS04多糖產(chǎn)量的影響

往麩皮培養(yǎng)基中添加蔗糖，添加量分別為1%，2%，3%，4%，6%，8%，10%（W/W），固體培養(yǎng)84h后結(jié)果如表2。

試驗結(jié)果表明：當(dāng)蔗糖添加量為2%（W/W）時，麩皮培養(yǎng)基中的多糖含量達(dá)到最大值99.12mg/g，之后隨著蔗糖添加量的增加，多糖含量呈下降趨勢。原因是當(dāng)蔗糖添加量太低時碳源不夠，無法滿足細(xì)菌的生長，而隨著蔗糖添加量的升高，細(xì)菌處于較高的滲透壓條件下，抑制了細(xì)菌的生長。

（2）含水量對PS04多糖產(chǎn)量的影響

往麩皮培養(yǎng)基中添加2%（W/W）蔗糖，調(diào)節(jié)含培養(yǎng)基水量分別為30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%（W/W），固體培養(yǎng)84h后結(jié)果如表3。

試驗結(jié)果表明，隨著含水量的增加，麩皮培養(yǎng)基中的多糖含量相應(yīng)增加，當(dāng)含水量為50% （W/W）時，多糖含量達(dá)到最大95.2 mg/g，隨后含水量繼續(xù)增大，多糖合成量呈下降趨勢。隨著含水量的提高，微生物生長所需要的水分增加，有利于微生物的生長；而當(dāng)含水量高于最適含水量，麩皮的黏度增加，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的氧含量下降，進(jìn)而抑制菌體的生長。

（3）培養(yǎng)時間對PS04多糖產(chǎn)量的影響

往麩皮培養(yǎng)基中添加2%（W/W）蔗糖，調(diào)節(jié)培養(yǎng)時間分別為0d ，2d，3d，4d，5d，6d，7d；固體培養(yǎng)后結(jié)果如表4。

試驗結(jié)果表明：隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，多糖產(chǎn)量增大，在發(fā)酵0～3d時，多糖產(chǎn)率增加較平緩，發(fā)酵天數(shù)為5d時，多糖產(chǎn)量達(dá)到最多，為0.08240g/g，之后隨著發(fā)酵天數(shù)增加多糖產(chǎn)量反而呈減少趨勢。隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，培養(yǎng)基中的碳源被消耗完，菌種會使用次生代謝產(chǎn)物多糖（聚果糖）作為碳源而消耗掉部分聚果糖，導(dǎo)致多糖含量減少。

（）接種量對PS04多糖產(chǎn)量的影響

往麩皮培養(yǎng)基中添加2%（W/W）蔗糖，分別以接種量為1%，3%，5%，7%，10%（V/W）進(jìn)行接種，固體培養(yǎng)84h后結(jié)果如表5。

試驗結(jié)果表明：1%～10%的接種量對菌體生長多糖產(chǎn)量的影響沒有表現(xiàn)出較大的差異，說明接種量對菌株產(chǎn)生胞外多糖有影響。

4、PS04固體培養(yǎng)的正交試驗

以優(yōu)化得到的含水量、蔗糖含量和發(fā)酵天數(shù)進(jìn)行3因素3水平的正交試驗。采用L₉(3⁴)正交表（見表6）確定各組分的最佳配比。

按表7的正交表的方法進(jìn)行正交試驗，測定結(jié)果如表8，由此可見：發(fā)酵天數(shù)是影響 PS04 菌株產(chǎn)生多糖的最主要的因素，含水量次之，蔗糖添加量對其影響最小。綜合這3個因素不同水平對發(fā)酵的影響，確定最適合該菌株發(fā)酵產(chǎn)生多糖的麩皮培養(yǎng)基各組分為含水量55%（W/W），蔗糖含量2.5%（W/W），發(fā)酵天數(shù)為5d。

通過單因素試驗和正交試驗相結(jié)合，初步得到，菌株P(guān)S04在以麩皮為固體培養(yǎng)基產(chǎn)生的胞外多糖發(fā)酵過程中，接種量對發(fā)酵產(chǎn)生多糖影響不大，發(fā)酵的最適培養(yǎng)條件為：固體培養(yǎng)幾種含水量為55%（W/W），蔗糖含量為2.5%（W/W），發(fā)酵天數(shù)為5d。其中發(fā)酵天數(shù)對多糖發(fā)酵影響最大，含水量次之，蔗糖含量影響最小。

實施例2 以木薯渣為固體培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)聚果糖

1、PS04的活化：從PS04試管斜面上挑取少許菌苔，接種到已經(jīng)滅菌的液體查氏培養(yǎng)基中，于30℃活化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180r/min的搖床上培養(yǎng)84 h。

2、PS04的種子培養(yǎng)：按接種量1%（V/V）吸取活化后的PS04菌液，接種到裝有查氏培養(yǎng)基的三角瓶中（控制裝液系數(shù)（裝液體積與容積體積之比）為0.4），于溫度30℃，轉(zhuǎn)速180r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)84 h，即為PS04種子液。

3、PS04的木薯渣培養(yǎng)：定量吸取PS04的種子液，接種到滅菌的木薯渣培養(yǎng)基中（同一批次接種均為同一批次培養(yǎng)的菌液，無特別說明均為3mL），攪拌混合均勻后置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)時間一般為3～4天。

4、聚果糖的提取：定量稱取木薯渣-PS04培養(yǎng)物置于500mL燒杯中，加入250mL或200mL熱水，于90℃恒溫水浴下提取1.5h,期間用玻璃棒邊攪拌。趁熱過濾，取其中濾液30mL，加入9倍體積的醫(yī)用乙醇，攪拌均勻后，靜置至少2h，沉淀聚果糖。然后于9000r/min條件下，離心15min，沉淀即為聚果糖。該沉淀為灰白色的，外表性狀與聚果糖一致。

5、聚果糖的測定

把沉淀物連帶濾紙放入烘干機(jī)烘烤5h，直到聚果糖完全干燥。再對其稱量，每個實驗流程方案的最終產(chǎn)物為3個重復(fù)的平均值，聚果糖凈產(chǎn)量為每30mL濾液的產(chǎn)物平均值，總產(chǎn)量為每25g木薯渣發(fā)酵后得到的聚果糖的量，產(chǎn)率為每克木薯渣得到的聚果糖的量。

6、PS04生物量的測定（稀釋平板計數(shù)法）

沒有經(jīng)過培養(yǎng)的木薯渣培養(yǎng)基，直接對PS04菌倒平板培養(yǎng)的培養(yǎng)基都以A來代表，A的單菌落數(shù)量即為起始生物量；木薯渣培養(yǎng)基經(jīng)過72h培養(yǎng)，再對PS04菌倒平板培養(yǎng)的培養(yǎng)基都以B表示，B的單菌落數(shù)量為培養(yǎng)后的生物量。

7、PS04固體培養(yǎng)基單因素優(yōu)化

（1）蔗糖含量對PS04多糖產(chǎn)量的影響

在配制好的木薯渣培養(yǎng)基中，分別添加蔗糖0g、1.4g、2.8g、3.5g、4.2g、4.9g、5.6g、7g；其終濃度分別為0%、2%、3.8%、4.8%、5.7%、6.5%、7.4%、9.1%。滅菌后，無菌操作下接PS04種子菌液。其中蔗糖添加為0g的不接種。接種后置于28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，72h后，測定其聚果糖含量。

注：聚果糖凈產(chǎn)量為每30mL濾液的產(chǎn)物平均值，總產(chǎn)量為每25g木薯渣發(fā)酵后得到的聚果糖的量，產(chǎn)率為每克木薯渣得到的聚果糖的量。

由表9看出當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖添加量和接種量為0時，聚果糖產(chǎn)物為0，說明用此法結(jié)果并沒有受到木薯渣培養(yǎng)基中其他成分的影響，PS04對在該培養(yǎng)基的蔗糖有果糖基轉(zhuǎn)移酶作用。當(dāng)蔗糖濃度4.8%（3.5g）時，聚果糖產(chǎn)率為0.2206最高。

（2）含水量對PS04多糖產(chǎn)量的影響

往木薯渣培養(yǎng)基中添加蔗糖3.5g，并分別添加0ml、28.5ml、35ml、43ml、50ml、57ml、63ml、71ml水，使得木薯渣培養(yǎng)基的含水量分別為0%、50%、55.1%、60.1%、63.7%、66.7%、68.9%、71.4%。滅菌后，無菌操作下接PS04種子菌液。其中水添加為0的不接種。接種后置于28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，72h后測定其聚果糖含量。

由表10看出當(dāng)培養(yǎng)基的含水量為零蔗糖添加量并不為零時，聚果糖產(chǎn)物也為零，說明經(jīng)過熱水浸提和乙醇離心沉淀后產(chǎn)物中排除了蔗糖，驗證產(chǎn)物為聚果糖。當(dāng)含水量為63.7%，即培養(yǎng)基組成為木薯渣25g+蔗糖3.5g+水50mL時，聚果糖產(chǎn)率0.4357最高。

木薯渣培養(yǎng)基的含水量也是PS04菌株能否正常生長和積累代謝物的重要因素之一。如果培養(yǎng)基含水量過少，則會導(dǎo)致菌株生長延緩，減弱了果糖基轉(zhuǎn)移酶作用，從而降低了產(chǎn)量。而培養(yǎng)基含水量過多，則培養(yǎng)基在高壓滅菌過程中，木薯渣容易出現(xiàn)黏糊狀，降低了培養(yǎng)基內(nèi)部的透氣性，使其缺少氧氣，不利于菌株進(jìn)一步生長，進(jìn)而影響到產(chǎn)量。通過對木薯渣培養(yǎng)基不同含水量的比較試驗，得出適合PS04菌的含水量，進(jìn)而可以提高聚果糖的產(chǎn)量和品質(zhì)。

（3）發(fā)酵時間對PS04多糖產(chǎn)量的影響

25g木薯渣中，蔗糖添加量為3.5g，水添加量為50ml。滅菌后，無菌操作下接PS04種子菌液。接種后置于28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，分別于46h、69h、93h、120h、148h取樣，每個時間段取樣2個，提取聚果糖，測定其聚果糖含量。

從表11看出，PS04菌在木薯渣培養(yǎng)基中對蔗糖起果糖基轉(zhuǎn)移酶作用積累聚果糖的適宜培養(yǎng)時間為69h，產(chǎn)率最高為0.4589。

8、PS04固體培養(yǎng)的正交試驗

根據(jù)實驗實際情況，擬定影響木薯渣培養(yǎng)基得出產(chǎn)物的3個主要因素，即A（蔗糖含量）、B（水添加量）、C（培養(yǎng)時間）為優(yōu)選因素。每個因素選3個水平進(jìn)行L₉(3⁴)正交試驗，以聚果糖產(chǎn)量為評價指標(biāo)。實驗因素水平設(shè)計見表12。

注：A為蔗糖含量g，B為水的含量mL，C為培養(yǎng)天數(shù)d，D為溫度，實際溫度都為28℃。

由于RC>RB>RA，因此影響PS04菌在木薯渣培養(yǎng)基積累聚果糖的3個主要因素的主次順序為C>B>A。再由3個主要因素的K1、K2、K3最大值，可以得出最佳工藝為C3B2A3，再結(jié)合實驗因素水平表L₉(3⁴)，得出PS04積累聚果糖的最佳木薯渣培養(yǎng)基為：25g木薯渣培養(yǎng)基中，蔗糖含量4g，水的含量50ml，培養(yǎng)時間為4天。木薯渣、蔗糖、水含量占總重的百分比分別為：31.65%、5.06%、63.29%。