本發(fā)明屬于固定化細胞制備技術領域，涉及一種高效生產(chǎn)κ-卡拉膠低聚糖的生物反應器及其應用。

背景技術：

固定化細胞技術是指用物理或化學的手段將游離細胞定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持催化活性、反復使用的方法。由于固定化細胞保持了細胞的生命活動能力，它不但比游離細胞的發(fā)酵更具有優(yōu)越性，而且比固定化酶有更多的優(yōu)點，因為固定化細胞省去了制備酶或含酶細胞處理過程所需要的完整酶系，并能不斷產(chǎn)生新酶及其所需的輔助因子，且固定化方法較簡單，可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細胞，能一邊徘出發(fā)酵液，一邊進行培養(yǎng)，排除了產(chǎn)物抑制和消耗。

磁性高分子微球是指通過適當?shù)姆椒ㄊ褂袡C高分子與無機磁性物質結合起來形成具有一定磁性和特殊結構的微球。磁性微球的核心是磁性材料，多為Fe、Co、Ni等過渡金屬特定晶型的氧化物、混合氧化物及其水化物。目前被研究最多并且應用最廣泛的是鐵及其氧化物，其中以Fe₃O₄居多。磁核賦予磁性微球以分離功能，殼層生物高分子功能基團賦予磁性微球以載體的功能。近年來，采用具有生物相容性的表面改性劑制備出的磁性復合顆粒，其表面可引入不同的功能基團如-OH，-COOH，-NH₂，-CH₃Cl等，拓寬Fe₃O₄納米粒子在材料、醫(yī)學、食品等領域的應用范圍。

殼聚糖為一種天然多糖衍生物，具有優(yōu)良的生物親和性和可降解性能，對于細胞不產(chǎn)生毒副作用，且其分子鏈上豐富的羥基和氨基使其易于進一步進行化學修飾而賦予多種功能，接連上具有生物活性的物質如藥物、蛋白質類物質等，在生物醫(yī)學等領域具有廣泛的應用前景。由于殼聚糖具有良好的生物相容性和血液相容性，與復合形成的微球具有磁響應性，在磁性材料、細胞生物學、分子生物學和醫(yī)學等諸多領域顯示強大的生命力。

目前卡拉膠低聚糖制備方法主要有：物理降解法、化學降解法及酶解法（酸水解、堿處理、超聲波、微波處理、輻射及生物酶解法）。其中，化學法是制備卡拉膠低聚糖主要方法，但化學降解方法存在反應條件不易控制、降解產(chǎn)率低、目的產(chǎn)物不易分離等瓶頸問題，制約了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應用。而微生物酶解法能彌補化學降解法的不足，不但對生產(chǎn)工藝要求簡單，反應條件溫和、產(chǎn)物活性高，而且產(chǎn)物專一，從而成為制備卡拉膠低聚糖的熱點。已有報道中，多種海洋細菌可有效降解卡拉膠，但由于游離菌株酶解效率低，耗時長，限制了微生物發(fā)酵生產(chǎn)卡拉膠低聚糖在工廠的開發(fā)。目前仍未見有采用固定化細胞技術生產(chǎn)制備κ-卡拉膠低聚糖，其中，集美大學肖安風以公開了一種固定化κ-卡拉膠酶及其制備κ-卡拉膠寡糖的方法。但由于酶固定化技術中存在的問題如：酶活力易損失、反應條件要求高等，因此本發(fā)明以實驗組自主篩選的κ-卡拉膠降解菌為原始菌，設計制備了一種菌株高濃度富集的生物反應器，以用于高效生產(chǎn)卡拉膠低聚糖。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的提供一種高效生產(chǎn)κ-卡拉膠低聚糖的生物反應器及其應用，通過載體的制備，菌株固定化的溫度、時間對載體富集菌株效果的影響，確定最佳固定化條件。并對反應器發(fā)酵生產(chǎn)κ-卡拉膠低聚糖的最佳條件及重復使用率進行研究，以期為固定化菌株生產(chǎn)κ-卡拉膠低聚糖提供理論依據(jù)。

本發(fā)明的技術方案：

一種高效生產(chǎn)κ-卡拉膠低聚糖的生物反應器，其生物反應器制備步驟如下：

步驟一、固定化載體的制備：

配制5wt%的醋酸溶液，采用超聲輔助溶解，配制濃度為1.5wt%的殼聚糖醋酸溶液，取20mL殼聚糖醋酸溶液，按照殼聚糖與Fe₃O₄磁性納米粒子質量比1:1加入Fe₃O₄磁性納米粒子，超聲波分散20min使Fe₃O₄磁性納米粒子充分混勻?？刂茢嚢杵鞯退龠\轉，將配制的磁性納米級Fe₃O₄/殼聚糖醋酸逐滴加到80mL液體石蠟（油水相比4:1）和2mL Span-80的混合液中，在室溫下充分乳化攪拌30 min后，緩慢加入1 mL戊二醛(25wt%)溶液，在50℃水浴中反應 1 h后，再升溫到70℃反應1.5 h，反應結束時用永磁鐵將產(chǎn)物——磁性殼聚糖微球（Fe₃O₄/CTS）分離，依次用有機溶劑石油醚、丙酮及超純水充分洗滌，將有機溶劑和乳化劑砂芯抽濾后超純水洗凈，60℃下干燥，輕研成粉末，即得到磁性殼聚糖微球載體（Fe₃O₄/CTS）。

步驟二、生物反應器的制備

取磁性納米載體Fe₃O₄/CTS 0.1~0.5g 用去離子水溶脹1-2小時，再洗滌至無紫外吸收峰滅菌待用；制備菌懸液，將1g菌泥溶解于100mL無菌去離子水中；無菌條件下，磁場下倒出去離子水，將磁性納米載體移入菌懸液中，4~30℃下固定1~4 h，然后用無菌去離子水洗滌3次，磁場下去除未固定游離細胞，即得到固定化生物反應器。

磁性納米級Fe₃O₄采用H₂O₂氧化水熱法制備，其粒徑為20~30nm。

菌泥為菌株Thalassospira sp. Fjfst-332經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，采用0.9wt%生理鹽水清洗2~3次，10000r/min離心20min獲得。

菌株Thalassospira sp. Fjfst-332，為實驗室自主篩選獲得，保藏號為CCTCC M 2013706，經(jīng)檢測可有效酶解κ-卡拉膠獲得κ-卡拉膠低聚糖的野生菌。

κ-卡拉膠低聚糖的制備包括如下步驟：

1）取固定化生物反應器無菌狀態(tài)下加入30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃，130r/min恒溫搖床中發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，用永磁鐵吸附生物反應器，發(fā)酵液8000r/min離心20min取上清酶液；

2）上清酶液經(jīng)10kDa超濾膜濃縮后，按1:20（v/v）的比例加入到0.5% κ-卡拉膠水溶液中，酶解24 h；

3）酶解液加熱5min停止反應，10000r/min離心30min去除未降解的κ-卡拉膠片段，取上清液分別過10kDa及3kDa超濾膜，收集分子量小于3kDa的酶解液，經(jīng)旋蒸后真空冷凍干燥，得到不同聚合度的κ-卡拉膠低聚糖。

發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：氯化鈉15 g/L，低聚果糖1 g/L，κ-卡拉膠3 g/L，酵母膏1 g/L，NaNO₃ 2 g/L，MgSO₄?7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄ 1 g/L，CaC1₂ 0.l g/L，余量為去離子水，pH= 7.5±0.1。

本發(fā)明的效益在于：生物反應器載體制備工藝簡單并可大量生產(chǎn)，生物反應器酶解κ-卡拉膠效果好，效率高，且重復使用率高，產(chǎn)物易分離，對于實現(xiàn)卡拉膠低聚糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)有重要的應用價值。

以一定配比的生物反應器與κ-卡拉膠發(fā)酵液混合生產(chǎn)κ-卡拉膠低聚糖，酶解時間與游離菌株發(fā)酵相比，縮短了3倍。

附圖說明

圖1生物反應器合成原理圖。

圖2磁性Fe₃O₄電鏡掃描圖。

圖3磁性殼聚糖微球載體（Fe₃O₄/CTS）電鏡掃描圖。

圖4磁性殼聚糖微球載體（Fe₃O₄/CTS）固定化菌株Thalassospira sp. Fjfst-332的電鏡掃描圖。

圖5 傅里葉紅外光譜分析圖。

圖6固定化溫度、時間對固定化效果的影響。

圖7生物反應器添加量對κ-卡拉膠低聚糖生產(chǎn)的影響。

圖8 生物反應器發(fā)酵生產(chǎn)κ-卡拉膠低聚糖的穩(wěn)定性。

圖9固定菌株及游離菌株產(chǎn)酶曲線分析。

圖10 固定化菌株制備κ-卡拉膠低聚糖的TLC圖。

具體實施方式

以下是說明本發(fā)明的具體實施例，但本發(fā)明并不限于此：

實施例1

步驟一、固定化載體的制備：

配制5wt%的醋酸溶液，采用超聲輔助溶解，配制濃度為1.5wt%的殼聚糖醋酸溶液，取20mL殼聚糖醋酸溶液，按照殼聚糖與Fe₃O₄磁性納米粒子質量比1:1加入Fe₃O₄磁性納米粒子，超聲波分散20min使Fe₃O₄磁性納米粒子充分混勻?？刂茢嚢杵鞯退龠\轉，將配制的磁性納米級Fe₃O₄/殼聚糖醋酸逐滴加到80mL液體石蠟（油水相比4:1）和2mL Span-80的混合液中，在室溫下充分乳化攪拌30 min后，緩慢加入1 mL戊二醛(25wt%)溶液，在50℃水浴中反應 1 h后，再升溫到70℃反應1.5 h，反應結束時用永磁鐵將產(chǎn)物——磁性殼聚糖微球（Fe₃O₄/CTS）分離，依次用有機溶劑石油醚、丙酮及超純水充分洗滌，將有機溶劑和乳化劑砂芯抽濾后超純水洗凈，60℃下干燥，輕研成粉末，即得到磁性殼聚糖微球載體（Fe₃O₄/CTS）。所述的磁性納米級Fe₃O₄采用H₂O₂氧化水熱法制備，其粒徑為20nm。

步驟二、生物反應器的制備

取磁性納米載體Fe₃O₄/CTS 0.1 g 用去離子水溶脹2個小時，再洗滌至無紫外吸收峰滅菌待用；制備菌懸液，將1g菌泥溶解于100mL無菌去離子水中；無菌條件下，磁場下倒出去離子水，將磁性納米載體移入菌懸液中，4℃下固定4 h，然后用無菌去離子水洗滌3次，磁場下去除未固定游離細胞，即得到固定化生物反應器。所述的菌泥為菌株Thalassospira sp. Fjfst-332經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，采用0.9wt%生理鹽水清洗2次，10000r/min離心20min獲得。

步驟三、κ-卡拉膠低聚糖的制備包括如下步驟：

1）取固定化生物反應器無菌狀態(tài)下加入30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃，130r/min恒溫搖床中發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，用永磁鐵吸附生物反應器，發(fā)酵液8000r/min離心20min取上清酶液；

2）上清酶液經(jīng)10kDa超濾膜濃縮后，按1:20（v/v）的比例加入到0.5wt% κ-卡拉膠水溶液中，酶解24 h；

3）酶解液加熱5min停止反應，10000r/min離心30min去除未降解的κ-卡拉膠片段，取上清液分別過10kDa及3kDa超濾膜，收集分子量小于3kDa的酶解液，經(jīng)旋蒸后真空冷凍干燥，得到不同聚合度的κ-卡拉膠低聚糖。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：氯化鈉15 g/L，低聚果糖1 g/L，κ-卡拉膠3 g/L，酵母膏1 g/L，NaNO₃ 2 g/L，MgSO₄?7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄ 1 g/L，CaC1₂ 0.l g/L，余量為去離子水，pH 7.5±0.1。

所述不同聚合度的κ-卡拉膠低聚糖分別為二糖、四糖、六糖、八糖。

圖1為該生物反應器的合成原理，即以納米級Fe₃O₄為反應器核心，賦予磁性微球以分離功能，外層為帶有功能基團（-COOH及-NH2）的殼聚糖生物高分子，賦予微球以載體的功能。所復配成的磁性微球的磁核與外殼的結合，主要借助氫鍵、范德華力及配位鍵牢牢束縛在一起，形成堅實的載體微球。而此生物反應器是通過物理吸附，菌體附著于磁性微球表面，并與功能基團-COOH、-NH結合，不添加其他化學試劑，從而確保了菌體的功能穩(wěn)定性及活性。

圖2 為本實施例Fe₃O₄納米顆粒的SEM圖，由圖可觀察Fe₃O₄納米粒子粒徑分布均勻，表面光滑，且顆粒明顯的團聚在一起，可能由于顆粒間帶有較強的磁性，分子間的磁響應作用促進了顆粒的團聚。圖3為本實施例Fe₃O₄/CTS的SEM圖，可觀察到Fe₃O₄納米粒子依舊呈現(xiàn)球狀，但表面附著了殼聚糖，粒徑較Fe₃O₄納米顆粒大，但相差并不明顯。顆粒間表現(xiàn)出團聚現(xiàn)象，分析由于粒子粒徑小，間距短，粒子間的范德華力遠大于粒子自身重力，從而產(chǎn)生團聚現(xiàn)象，且粒子本身被磁化，也造成了粒子團聚。圖4為本實施例Fe₃O₄/CTS固定化菌體的SEM圖，由圖可知，微球表面的顆粒密集度相較于Fe₃O₄/CTS顆粒更大，表面有大量的菌體有效包覆于Fe₃O₄/CTS粒子表層，且固定化后微球粒徑明顯變大，同時，微球間由于磁性及范德華力，依舊存在團聚現(xiàn)象。

圖5為本實施例生物反應器的FTIR圖分析，571.62cm^-1是Fe-O的特征吸收峰，由圖可知，經(jīng)過載體制備及菌體吸附后，生物反應器仍有磁性吸收峰存在。Fe₃O₄/CTS在3415.66cm^-1處有吸收峰，歸因于殼聚糖中-NH₂及-OH的伸縮振動。1070.15，1045.63cm^-1是C-O鍵典型變形振動峰， 1397.15cm^-1是C-H的變形振動峰，這是由于殼聚糖沒有完全脫去乙?；鶊F所產(chǎn)生。Fe₃O₄/CTS圖中1558.41和1650.40 cm^-1吸收峰在經(jīng)過菌體固定化后，在Fe₃O₄/CTS Immobilized cell圖中表現(xiàn)為1558.41cm^-1吸收峰消失，1646.32 cm^-1處有一個較強特征吸收峰，表明由于殼聚糖上的基團與菌體結合形成了Schiff堿，使菌體固定于微球表面。

由圖6、7可知，固定化溫度及時間對生物反應器的制備有重要影響，從其產(chǎn)物量可知，該磁性微球在20℃、2 h及具有較好的固定效果，且發(fā)酵反應中，生物反應器添加量為700mg/30ml時，具有較高的應用效果。圖8為以Fe₃O₄/CTS為載體，采用兩種方法固定化菌株的實例圖，實例1把滅菌后的載體添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵過程中制備固定化菌，F(xiàn)e₃O₄/CTS（2）是將滅菌后的載體加入菌懸液中，靜態(tài)吸附菌體制備生物反應器，兩種方法制備的的生物反應器降解卡拉膠能力實例1較好，但方法二（Fe₃O₄/CTS（2））操作簡單，且效果也較佳。此外，由圖8可知，該生物反應器具有較好的穩(wěn)定性及重復使用率，反復使用7次后產(chǎn)生明顯的活力下降。與游離菌株相比（圖9），固定菌在12 h即可達到底物生產(chǎn)最高值，時間效率提高了3倍。圖10表明，經(jīng)過固定化后的菌株，其產(chǎn)物與游離菌所生產(chǎn)的寡糖種類一直，表明固定過程中，菌體并為發(fā)生物理及化學改變，其遺傳及功能穩(wěn)定性較好。

實施例2

步驟一、固定化載體的制備：

配制5wt%的醋酸溶液，采用超聲輔助溶解，配制濃度為1.5wt%的殼聚糖醋酸溶液，取20mL殼聚糖醋酸溶液，按照殼聚糖與Fe₃O₄磁性納米粒子質量比1:1加入Fe₃O₄磁性納米粒子，超聲波分散20min使Fe₃O₄磁性納米粒子充分混勻。控制攪拌器低速運轉，將配制的磁性納米級Fe₃O₄/殼聚糖醋酸逐滴加到80mL液體石蠟（油水相比4:1）和2mL Span-80的混合液中，在室溫下充分乳化攪拌30 min后，緩慢加入1 mL戊二醛(25wt%)溶液，在50℃水浴中反應 1 h后，再升溫到70℃反應1.5 h，反應結束時用永磁鐵將產(chǎn)物——磁性殼聚糖微球（Fe₃O₄/CTS）分離，依次用有機溶劑石油醚、丙酮及超純水充分洗滌，將有機溶劑和乳化劑砂芯抽濾后超純水洗凈，60℃下干燥，輕研成粉末，即得到磁性殼聚糖微球載體（Fe₃O₄/CTS）。所述的磁性納米級Fe₃O₄采用H₂O₂氧化水熱法制備，其粒徑為25nm。

步驟二、生物反應器的制備

取磁性納米載體Fe₃O₄/CTS 0.3 g 用去離子水溶脹1個小時，再洗滌至無紫外吸收峰滅菌待用；制備菌懸液，將1g菌泥溶解于100mL無菌去離子水中；無菌條件下，磁場下倒出去離子水，將磁性納米載體移入菌懸液中，4℃下固定4 h，然后用無菌去離子水洗滌3次，磁場下去除未固定游離細胞，即得到固定化生物反應器。所述的菌泥為菌株Thalassospira sp. Fjfst-332經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，采用0.9wt%生理鹽水清洗3次，10000r/min離心20min獲得。

步驟三、κ-卡拉膠低聚糖的制備包括如下步驟：

1）取固定化生物反應器無菌狀態(tài)下加入30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃，130r/min恒溫搖床中發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，用永磁鐵吸附生物反應器，發(fā)酵液8000r/min離心20min取上清酶液；

2）上清酶液經(jīng)10kDa超濾膜濃縮后，按1:20（v/v）的比例加入到0.5wt% κ-卡拉膠水溶液中，酶解24 h；

3）酶解液加熱5min停止反應，10000r/min離心30min去除未降解的κ-卡拉膠片段，取上清液分別過10kDa及3kDa超濾膜，收集分子量小于3kDa的酶解液，經(jīng)旋蒸后真空冷凍干燥，得到不同聚合度的κ-卡拉膠低聚糖。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：氯化鈉15 g/L，低聚果糖1 g/L，κ-卡拉膠3 g/L，酵母膏1 g/L，NaNO₃ 2 g/L，MgSO₄?7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄ 1 g/L，CaC1₂ 0.l g/L，余量為去離子水，pH 7.5±0.1。

所述不同聚合度的κ-卡拉膠低聚糖分別為二糖、四糖、六糖、八糖。

實施例3

步驟一、固定化載體的制備：

配制5wt%的醋酸溶液，采用超聲輔助溶解，配制濃度為1.5wt%的殼聚糖醋酸溶液，取20mL殼聚糖醋酸溶液，按照殼聚糖與Fe₃O₄磁性納米粒子質量比1:1加入Fe₃O₄磁性納米粒子，超聲波分散20min使Fe₃O₄磁性納米粒子充分混勻?？刂茢嚢杵鞯退龠\轉，將配制的磁性納米級Fe₃O₄/殼聚糖醋酸逐滴加到80mL液體石蠟（油水相比4:1）和2mL Span-80的混合液中，在室溫下充分乳化攪拌30 min后，緩慢加入1 mL戊二醛(25wt%)溶液，在50℃水浴中反應 1 h后，再升溫到70℃反應1.5 h，反應結束時用永磁鐵將產(chǎn)物——磁性殼聚糖微球（Fe₃O₄/CTS）分離，依次用有機溶劑石油醚、丙酮及超純水充分洗滌，將有機溶劑和乳化劑砂芯抽濾后超純水洗凈，60℃下干燥，輕研成粉末，即得到磁性殼聚糖微球載體（Fe₃O₄/CTS）。所述的磁性納米級Fe₃O₄采用H₂O₂氧化水熱法制備，其粒徑為30nm。

步驟二、生物反應器的制備

取磁性納米載體Fe₃O₄/CTS 0.5 g 用去離子水溶脹1.5個小時，再洗滌至無紫外吸收峰滅菌待用；制備菌懸液，將1g菌泥溶解于100mL無菌去離子水中；無菌條件下，磁場下倒出去離子水，將磁性納米載體移入菌懸液中，20℃下固定2 h，然后用無菌去離子水洗滌3次，磁場下去除未固定游離細胞，即得到固定化生物反應器。所述的菌泥為菌株Thalassospira sp. Fjfst-332經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，采用0.9wt%生理鹽水清洗3次，10000r/min離心20min獲得。

步驟三、κ-卡拉膠低聚糖的制備包括如下步驟：

1）取固定化生物反應器無菌狀態(tài)下加入30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃，130r/min恒溫搖床中發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，用永磁鐵吸附生物反應器，發(fā)酵液8000r/min離心20min取上清酶液；

2）上清酶液經(jīng)10kDa超濾膜濃縮后，按1:20（v/v）的比例加入到0.5wt% κ-卡拉膠水溶液中，酶解24 h；

3）酶解液加熱5min停止反應，10000r/min離心30min去除未降解的κ-卡拉膠片段，取上清液分別過10kDa及3kDa超濾膜，收集分子量小于3kDa的酶解液，經(jīng)旋蒸后真空冷凍干燥，得到不同聚合度的κ-卡拉膠低聚糖。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：氯化鈉15 g/L，低聚果糖1 g/L，κ-卡拉膠3 g/L，酵母膏1 g/L，NaNO₃ 2 g/L，MgSO₄?7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄ 1 g/L，CaC1₂ 0.l g/L，余量為去離子水，pH 7.5±0.1。

所述不同聚合度的κ-卡拉膠低聚糖分別為二糖、四糖、六糖、八糖。

實施例中采用的檢測方法：

1、κ-卡拉膠酶活力測定：取 l mL 酶液加入到盛有5 mL 0.2% 卡拉膠底物的試管中，于32 ℃恒溫水浴反應60 min，對照組用 l mL滅活酶液和 5mL 底物溶液混合。以反應液中還原糖的增加量作為檢測酶活力的指標。還原糖的測定則采用DNS法(3,5-二硝基水楊酸)。取 1 mL 反應液加 l mL DNS溶液，沸水浴反應5 min 后，冷卻，定容至10 mL，于540 nm 下測定吸光值。以半乳糖做標準曲線，根據(jù)反應組和對照組吸光值的差值計算還原糖的產(chǎn)生量。1 個酶活力單位(U)定義為在32℃條件下，每分鐘產(chǎn)生 1 μg 還原糖(以半乳糖計)所需要的酶量。

2、載體微球吸附效果測定：考慮到細胞增殖對檢測的影響，將菌懸液稀釋4倍進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)其在600nm下有吸收，以此作為檢測依據(jù)。去離子水作為參比，稀釋4倍的細胞液的紫外吸收作為初始濃度，固定化后的上層液的吸收作為Ai值，吸附率AD=（Ao-Ai）/Ao*100%。AD值越大，說明吸附后的上層液中含細胞越少，吸附效果越好。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。