本發(fā)明涉及一種羊來源的低分子肝素——羊依諾肝素鈉，及其制備方法與應(yīng)用，屬于醫(yī)藥生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，也屬于清真藥物。
背景技術(shù)：
：依諾肝素鈉(EnoxaparinSodium，ES)是一種低分子的肝素鈉鹽，由大分子肝素經(jīng)解聚而來，是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的抗凝抗栓藥物之一。目前USP39和EP8.6規(guī)定依諾肝素鈉的來源為豬腸粘膜肝素，而豬肝素不具有清真性。清真是穆斯林在中國流行的專用名稱，穆斯林教義對食品和藥品等有著明確的要求，哺乳動物中只允許食用牛、綿羊、山羊等反芻動物產(chǎn)品，禁食豬和狗等不反芻動物產(chǎn)品。全球穆斯林人口2013年突破16億，占全球69億人口的23％。在一些由穆斯林人口占多數(shù)的國家，如印度尼西亞、巴基斯坦、伊朗等等，清真市場缺失符合清真教義的抗凝藥物，開發(fā)符合穆斯林教義的清真低分子肝素有著無可比擬的優(yōu)勢。本發(fā)明人在之前的專利申請(申請公布號：CN105131153A)中，詳細(xì)描述了一種羊依諾肝素鈉的制備方法，這種羊依諾肝素鈉是本發(fā)明人首次報道的不同于豬來源依諾肝素鈉的化合物，本發(fā)明將著重介紹此羊依諾肝素及其注射劑，包括其具體的理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種羊依諾肝素鈉及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明的目的，將通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：羊依諾肝素鈉，是以羊源的肝素制備得到的。所述羊依諾肝素鈉的二糖組成，以肝素酶酶解后的SAX-HPLC分析，主要二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量在60％-74％之間，含量次多的二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)和ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)分別是8％-11％和4％-7％，與抗-Ⅹa和抗-Ⅱa活性至關(guān)重要的核心五糖中3-位硫酸化的四糖峰——ΔⅡA-ⅡSglu，含量是1.2％-2.1％；而在豬腸粘膜依諾肝素鈉中，ΔⅠS、ΔⅡS和ΔⅢS的含量分別是58％-66％、9.5％-11.5％和5.8％-7.8％，ΔⅡA-ⅡSglu的含量則是2.1％-2.5％。所述羊依諾肝素鈉包括綿羊來源的依諾肝素鈉和山羊來源的依諾肝素鈉。所述綿羊來源的依諾肝素鈉的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量為66％-74％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量為8％-10％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量為4％-6％；所述山羊來源的依諾肝素鈉的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量為60％-68％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量為9％-11％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量為5％-7％。進(jìn)一步地，綿羊來源的依諾肝素鈉的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量為66.26％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量為9.15％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量為6.44％；山羊來源的依諾肝素鈉的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量為63.58％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量為10.71％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量為10.27％。所述羊依諾肝素鈉的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以核磁共振氫譜和核磁共振碳譜來判斷，羊依諾肝素鈉與豬依諾肝素鈉的譜圖大致相同，但氫譜δ2.04ppm和碳譜δ24.9ppm共同反映的氮-乙?；募谆?，羊依諾肝素鈉中積分要小一些，反映出糖鏈上氮-乙?；揎椄?。所述的核磁共振方法，更優(yōu)的方案是采用異核單量子關(guān)系-核磁共振(HSQC-NMR)等更高級的二維核磁分析，以此可以明確判斷一些具體糖鏈結(jié)構(gòu)上的差異。所述羊依諾肝素鈉的磺酸根羧酸根比例分析，方法遵照USP37進(jìn)行，磺酸根羧酸根比例反映糖鏈上的磺酸根修飾情況，羊依諾肝素鈉的磺酸根羧酸根比例在2.0以上，USP37和EP8.0規(guī)定的豬腸粘膜依諾肝素鈉的放行標(biāo)準(zhǔn)中，該項指標(biāo)是不小于1.8，羊依諾肝素鈉的磺酸根羧酸根比例稍高，反映出羊依諾肝素鈉的磺酸化修飾程度更高。所述羊依諾肝素鈉的生物學(xué)抗凝活性，參照USP37進(jìn)行分析，抗-Ⅹa活性折干后在90-125單位每毫克之間，抗-Ⅱa活性折干后在20-35單位每毫克之間，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在2.8-4.8之間。其中抗-Ⅹa活性和抗-Ⅱa活性都與USP37和EP8.0規(guī)定的依諾肝素鈉放行標(biāo)準(zhǔn)一致，但抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例要稍小一些，在USP37和EP8.0中，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在3.3-5.3之間。優(yōu)選地，所述羊依諾肝素鈉可進(jìn)行精制和分級，使抗-Ⅹa活性和抗-Ⅱa活性及兩者之間的比例，符合USP37對依諾肝素鈉的放行標(biāo)準(zhǔn)。所述羊依諾肝素鈉的分子量及分子量分布，參照USP37進(jìn)行分析，羊依諾肝素鈉的重均分子量在3800-5000之間，其中分子量<2000部分的比例在12.0％-20.0％之間，2000<分子量<8000部分的比例在68.0％-82.0％之間，分子量>8000部分的比例不超過18.0％。羊依諾肝素鈉的分子量及分子量分布，符合USP39和EP8.6規(guī)定的依諾肝素鈉放行標(biāo)準(zhǔn)要求。所述羊依諾肝素鈉的1,6-酐含量測定，具體是利用肝素酶酶解后進(jìn)行強(qiáng)陰離子交換樹脂-高效液相色譜(SAX-HPLC)分析檢測，酶解和檢測方法遵照USP32附錄<207>“依諾肝素鈉的1,6-酐衍生物檢查”進(jìn)行。所述羊依諾肝素鈉的1,6-酐含量在15％-25％之間，符合USP37和EP8.0規(guī)定的依諾肝素鈉放行標(biāo)準(zhǔn)要求。優(yōu)選地，所述羊依諾肝素鈉可進(jìn)行精制或分級。羊依諾肝素鈉的精制包括脫色、反復(fù)的鹽水復(fù)溶醇沉等方式，分級則包括陰離子交換分級或超濾分級，以使羊依諾肝素鈉產(chǎn)品的指標(biāo)符合USP37和EP8.0規(guī)定的除種源外依諾肝素鈉放行標(biāo)準(zhǔn)要求，包括提高抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例以及其他指標(biāo)，對比現(xiàn)行的藥典版本USP39和EP8.6也是完全符合的。優(yōu)選地，所述羊依諾肝素鈉在防治與抗凝、抗栓有關(guān)疾病中的應(yīng)用，以及開發(fā)為清真抗凝抗栓藥物。以上所述羊依諾肝素鈉的制備方法，與本發(fā)明人在之前的專利申請(申請公布號：CN105131153A)主張的制備方法相同，具體采用如下步驟：S1、原料羊肝素的預(yù)處理：將羊肝素鈉粗品溶解后進(jìn)行溶液脫色，精過濾，再在室溫下進(jìn)行醇沉精制，收集沉淀物，干燥獲得羊肝素；S2、羊肝素季銨鹽的制備：將S1中獲得的羊肝素溶解配制成羊肝素水溶液，并與芐索氯銨水溶液進(jìn)行混合，過濾或離心獲得羊肝素季銨鹽，并進(jìn)行洗滌干燥，制得羊肝素季銨鹽；S3、羊肝素芐酯的制備：將S2中干燥得到的羊肝素季銨鹽與有機(jī)溶劑二氯甲烷及氯化芐按重量比例混合酯化，在酯化后的羊肝素季銨鹽中滴加醋酸鈉甲醇溶液，制得羊肝素芐基酯沉淀，將羊肝素芐基酯沉淀進(jìn)行過濾、洗滌、干燥，制得羊肝素芐基酯；S4、羊依諾肝素鈉成品制得：將S3中的羊肝素芐基酯進(jìn)行堿解聚，脫色，以酸中和至中性，醇沉淀，精制，干燥，得到羊依諾肝素鈉成品。優(yōu)選地，S1中采用質(zhì)量濃度為1％-3％的氯化鈉水溶液溶解羊肝素鈉粗品進(jìn)行脫色、過濾和精制，直至預(yù)處理后羊肝素鈉的水溶液澄清且色度不深于5號標(biāo)準(zhǔn)色；醇沉精制的沉淀劑為甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮中的一種或幾種的組合。S2中芐索氯銨與羊肝素鈉的重量比為2-5:1。S3中酯化溫度30-40℃，羊肝素季銨鹽、二氯甲烷、氯化芐的質(zhì)量比為1:3-10:1.1。S4中采用氫氧化鈉溶液解聚，解聚溫度在30℃-70℃之間，保溫時間在0.5小時以上；S4中采用雙氧水脫色，室溫或以下加入0.1-1倍羊肝素芐基酯重量的30％雙氧水，氧化脫色10分鐘以上，直至反應(yīng)液顏色淺至Y6與GY6以下。優(yōu)選地，S3中羊肝素芐基酯沉淀的洗滌包括如下步驟：S31、在加入醋酸鈉甲醇溶液的羊肝素季銨鹽溶液中加入甲醇靜置沉降和分離制得羊肝素芐基酯；S32、在分離后的羊肝素芐基酯中添加8％-12％的氯化鈉水溶液進(jìn)行復(fù)溶，所述氯化鈉水溶液與所述羊肝素季銨鹽重量比為0.5-2:1；S33、對S32中獲得的溶液以60％-70％的甲醇終濃度進(jìn)行醇沉結(jié)晶；S34、重復(fù)氯化鈉水溶液復(fù)溶和醇沉結(jié)晶2-5次至羊肝素芐基酯復(fù)溶不渾濁。一種羊依諾肝素鈉注射劑，組分包括以上所述的羊依諾肝素鈉和注射用水。優(yōu)選地，所述羊依諾肝素鈉注射劑的制備方法，是將羊依諾肝素鈉以注射用水溶解，待完全溶解后補(bǔ)注射用水至一定的濃度，無菌過濾，灌裝至注射器、西林瓶或安瓿瓶等。優(yōu)選地，所述羊依諾肝素鈉注射劑的活性濃度在10000抗-Ⅹa單位每毫升，優(yōu)選制成預(yù)灌封針，規(guī)格為4000抗-Ⅹa單位、6000抗-Ⅹa單位和10000抗-Ⅹa單位以及其他規(guī)格。優(yōu)選地，所述羊依諾肝素鈉注射劑，在抗凝、抗栓及清真藥物中的應(yīng)用。另一種羊依諾肝素鈉注射劑，組分包括羊依諾肝素鈉、注射用水和苯甲醇。優(yōu)選地，所述另一種羊依諾肝素鈉注射劑的制備方法，是將羊依諾肝素鈉以注射用水溶解，再加入苯甲醇，待完全溶解混勻后補(bǔ)注射用水至一定的濃度，無菌過濾，灌裝至西林瓶等。優(yōu)選地，所述苯甲醇的濃度在1.35毫克每毫升至1.65毫克每毫升之間。優(yōu)選地，所述另一種羊依諾肝素鈉注射劑的活性濃度在10000抗-Ⅹa單位每毫升，優(yōu)選灌封成西林瓶，規(guī)格為30000抗-Ⅹa單位以及其他規(guī)格。優(yōu)選地，所述另一種羊依諾肝素鈉注射劑，在抗凝、抗栓及清真藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述羊依諾肝素鈉和羊依諾肝素鈉注射劑的抗凝作用，體外試驗以人血考察。血液分離血漿后，按自動凝血儀和試劑盒方法，考察羊依諾肝素鈉和羊依諾肝素鈉注射劑等對血凝常規(guī)的影響，包括但不限于APTT、TT和PT等。優(yōu)選地，所述羊依諾肝素鈉和羊依諾肝素鈉注射劑的抗凝作用，體內(nèi)試驗優(yōu)選兔進(jìn)行動物體內(nèi)試驗。優(yōu)選皮下注射給藥后，采集給藥前及給藥后各時間點(diǎn)的兔血液，用3.8％枸櫞酸鈉抗凝劑1:9抗凝，上機(jī)檢測對血凝常規(guī)的影響，包括但不限于APTT、TT和PT等，以及其他凝血因子的影響。優(yōu)選地，所述羊依諾肝素鈉和羊依諾肝素鈉注射劑，在體內(nèi)外抗凝試驗，均表現(xiàn)出近似或等同于依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的效果。本發(fā)明突出效果為：提供了一種羊依諾肝素鈉以及它的注射劑，除了由種源特征性帶來的分子結(jié)構(gòu)(二糖組成)和抗凝血活性(較小的抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例)外，羊依諾肝素鈉均符合其他USP37依諾肝素鈉所列的質(zhì)量放行指標(biāo)，對比現(xiàn)行的USP39和EP8.6，也是符合的。羊依諾肝素鈉，原料簡便易得，質(zhì)量可控，可極大豐富市場中依諾肝素鈉的來源和產(chǎn)量。羊依諾肝素鈉來源于羊，具有清真性，屬于清真藥物，可應(yīng)用于廣大穆斯林國家、地區(qū)和人群，經(jīng)濟(jì)潛力巨大。以下便結(jié)合實(shí)施例附圖，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步的詳述，以使本發(fā)明技術(shù)方案更易于理解、掌握。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所述羊依諾肝素鈉樣品與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的二糖譜比較示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2所述羊依諾肝素鈉樣品與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的1H-NMR對比示意圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例3所述羊依諾肝素鈉樣品與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的13C-NMR比較示意圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例4所述羊依諾肝素鈉樣品的磺酸根和羧酸根比例示意圖。圖5為本發(fā)明實(shí)施例6所述羊依諾肝素鈉樣品與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的分子量分布比較示意圖圖6為本發(fā)明實(shí)施例10所述羊依諾肝素鈉及其注射劑樣品與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品在兔體內(nèi)對APTT、PT和TT的影響以及抗-Ⅹa活性比較示意圖，其中(1)為對APTT的影響圖，(2)為對PT的影響圖，(3)為對TT的影響圖，(4)為抗-Ⅹa活性圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施例描述了一種羊來源的依諾肝素鈉——羊依諾肝素鈉，以及羊依諾肝素鈉注射劑，下面以具體實(shí)驗案例為例來說明具體實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。羊依諾肝素鈉成品，來源于本發(fā)明人專利申請(申請公布號：CN105131153A)的實(shí)施例二，以下實(shí)施例如無特殊說明，均采用此樣品或類似工藝制備的分級后樣品。實(shí)施例1羊依諾肝素鈉二糖和1,6-酐含量分析：二糖組成和1,6-酐含量分析，遵照USP32附錄<207>“依諾肝素鈉的1,6-酐衍生物檢查”進(jìn)行，結(jié)果見圖1和表1。表1：羊依諾肝素鈉與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的二糖組成比例及1,6-酐％從圖1和表1可以看出，羊依諾肝素鈉與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的二糖相比，ΔⅠS、ΔⅡS和ΔⅢS的含量分別是70.2％、9.19％和5.01％，ΔⅡA-ⅡSglu的含量則是1.60％，這些都與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品有差異。同時，羊依諾肝素鈉的1,6-酐百分含量與標(biāo)準(zhǔn)品幾乎相同，為20.4％，符合USP37要求的15％-25％的指標(biāo)。實(shí)施例2羊依諾肝素鈉的核磁氫譜(1H-NMR)分析：羊依諾肝素鈉的核磁氫譜分析，設(shè)備用蘇州大學(xué)分析測試中心的400MHz核磁共振譜儀，以3-三甲基硅基丙酸鈉-d4(TSP)定零點(diǎn)。待測樣品溶液配制：羊依諾肝素鈉樣品和依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品，各準(zhǔn)確各稱取20毫克左右，按重以氘水(D2O)溶解成20毫克每毫升左右的濃度，滴加1-2滴TSP，震蕩混勻后0.22微米過濾送檢，結(jié)果如圖2所示，其中，3.4ppm為甲醇?xì)埩舻募谆鶜浞澹?.7ppm為水氫峰。結(jié)果顯示，羊依諾肝素鈉樣品的氫譜與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品基本一致，但在δ2.04ppm處的氮-乙?；募谆?，羊依諾肝素鈉樣品的積分含量要低一些，說明羊依諾肝素鈉樣品中，氮-乙?；揎椄?，相應(yīng)地，其氮-磺酸基修飾就更多。通常，更多的磺酸基修飾可以帶來更高的抗凝活性。實(shí)施例3羊依諾肝素鈉的核磁碳譜(13C-NMR)分析：羊依諾肝素鈉樣品的的核磁碳譜分析，設(shè)備用蘇州大學(xué)分析測試中心的400MHz核磁共振譜儀，方法遵照USP37進(jìn)行。結(jié)果如圖3所示，其中，50ppm為甲醇?xì)埩舻募谆挤?。結(jié)果顯示，同氫譜一致，羊依諾肝素鈉樣品的碳骨架與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品一致，但一些具體的位置，如24.9ppm的氮-乙?；募谆?，含量有一定的差異。USP37沒有對氮-乙?；e分的要求，因此，羊依諾肝素鈉樣品的碳譜是符合藥典規(guī)定的。實(shí)施例4羊依諾肝素鈉的磺酸根羧酸根比例分析：磺酸根羧酸根比例的分析方法遵照USP37進(jìn)行，以活化過的陽離子樹脂和陰離子樹脂分別裝柱串聯(lián)，裝柱規(guī)格分別是1.5厘米×7.5厘米和1.5厘米×2.5厘米。準(zhǔn)確稱取羊依諾肝素鈉樣品50毫克，以純水配制成5毫克每毫升，上樣依次通過裝有陰離子樹脂和陽離子樹脂的柱子，在柱子出口端用燒杯收集流出液。流出液以氫氧化鈉溶液進(jìn)行滴定，并記錄電導(dǎo)率的變化。參照USP37進(jìn)行作圖，計算磺酸根和羧酸根的摩爾比，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，羊依諾肝素鈉樣品的磺酸根和羧酸根比例是2.4，USP37規(guī)定的依諾肝素鈉放行標(biāo)準(zhǔn)是不小于1.8，通常豬依諾肝素鈉的磺酸根和羧酸根比例是2.2，羊依諾肝素鈉要稍大一些，這反映出羊依諾肝素鈉有更多的磺酸化修飾。實(shí)施例5抗-Ⅹa、抗-Ⅱa活力和全綿羊血漿法活力對比分析：抗-Ⅹa和抗-Ⅱa的活性測定遵照USP37進(jìn)行，全綿羊血漿法的抗凝血活性參照專利申請(申請公布號：CN105131153A)的實(shí)施例進(jìn)行，羊依諾肝素鈉樣品與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的各活性對比如下表2。表2：羊依諾肝素鈉樣品的抗凝活力對比結(jié)果顯示：羊依諾肝素鈉樣品和依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品相比，全綿羊血漿法的抗凝血活力相當(dāng)，在各藥典規(guī)定的抗-Ⅹa和抗-Ⅱa的活性及比例方面，羊依諾肝素鈉樣品符合USP37的放行指標(biāo)要求。實(shí)施例6重均分子量及分子量分布分析：分子量及分子量分布分析與計算參照USP37方法進(jìn)行，結(jié)果如附圖5和表3所列。表3：羊依諾肝素鈉樣品的重均分子量及分子量分布結(jié)果可以看出，羊依諾肝素鈉樣品(Ovine-038)，其均重分子量和分子量分布與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品非常接近，符合USP37放行指標(biāo)的要求。實(shí)施例7羊依諾肝素鈉注射劑1的制備：按活性計算并準(zhǔn)確稱取羊依諾肝素鈉粉末190.6克(干燥失重3.4％，折干后105.6抗-Ⅹa單位每毫克，共0.2億抗-Ⅹa單位)，以冷卻的注射用水溶解并定容至2000毫升，兩級0.2微米過濾器無菌過濾進(jìn)A級潔凈區(qū)，并以灌封機(jī)灌封至1毫升玻璃注射器中，規(guī)格為6000單位(或0.6毫升)，去除損耗，共收獲羊依諾肝素鈉注射劑1成品2160支。實(shí)施例8羊依諾肝素鈉注射劑2的制備：按活性計算并準(zhǔn)確稱取羊依諾肝素鈉粉末190.6克(干燥失重3.4％，折干后105.6抗-Ⅹa單位每毫克，共0.2億抗-Ⅹa單位)，以冷卻的注射用水溶解，加入75.0克苯甲醇，攪拌均勻，再以冷卻的注射用水定容至2000毫升，兩級0.2微米過濾器無菌過濾進(jìn)A級潔凈區(qū)，并以灌封機(jī)灌封至5毫升西林瓶中，規(guī)格為30000單位(或3.0毫升)，去除損耗，共收獲羊依諾肝素鈉注射劑2成品552瓶。實(shí)施例9羊依諾肝素鈉與羊依諾肝素鈉注射劑的人血體外抗凝試驗：實(shí)驗方法：每次采用3人份外周靜脈血3mL，用3.8％枸櫞酸鈉抗凝劑1:9抗凝，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，分離出貧血小板血漿(PPP)。按試劑盒方法，上機(jī)(全自動血凝儀，StagoCompact)檢測。實(shí)驗組別如下：羊依諾肝素鈉樣品組(批號：Ovine-038)、羊依諾肝素鈉注射劑1組(實(shí)施例七所述)、羊依諾肝素鈉注射劑2組(實(shí)施例八所述)和依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品組(為臨床市售藥品，克賽，批號：24459)，其濃度均為～3μg/mL，實(shí)驗設(shè)生理鹽水為空白對照。結(jié)果與分析：1)APTT、PT和TT實(shí)驗結(jié)果如下表格所示：表4體外對APTT、PT和TT的影響組別APTTPTTT羊依諾肝素鈉樣品104.1±9.5s13.2±0.6s127.4±37.4s羊依諾肝素鈉注射劑1105.3±12.1s13.9±0.4s145.4±43.6s羊依諾肝素鈉注射劑2102.5±9.8s13.4±0.5s134.4±44.3s依諾肝素鈉104.8±10.2s13.8±0.3s140.4±54.7s空白對照38.1±1.4s12.7±0.6s16.6±0.7s由表4可知，在體外所有樣品組別均可以顯著延長APTT和TT，但對PT的影響較小。2)AT和纖維蛋白原：實(shí)驗結(jié)果如下表格所示：表5體外對AT和纖維蛋白原的影響組別AT纖維蛋白原復(fù)鈣時間羊依諾肝素鈉樣品2.31±0.34g/L96.33±10.50s31.00±0.00s*羊依諾肝素鈉注射劑12.26±0.34g/L97.00±9.54s31.00±0.00s*羊依諾肝素鈉注射劑22.24±0.37g/L96.67±9.50s31.00±0.00s*依諾肝素鈉2.29±0.44g/L99.00±6.29s31.00±0.00s*空白對照2.57±0.25g/L94.00±8.1s9.95±0.40s*：均已超出檢測范圍由表5可知，與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品相比，羊依諾肝素鈉及其注射劑對AT和纖維蛋白原均幾乎無影響；在體外所有樣品均可以顯著延長復(fù)鈣時間，數(shù)據(jù)均已超出檢測范圍(>31.00s)。所有以上數(shù)據(jù)揭示，羊依諾肝素鈉及其注射劑，在體外有著良好的抗凝效果，且與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)。實(shí)施例10羊依諾肝素鈉與羊依諾肝素鈉注射劑的動物體內(nèi)抗凝試驗：實(shí)驗方法：選取日本大白兔2-3Kg，根據(jù)體重分別在前背部近上肢處皮下注射給藥。試驗組別設(shè)置如下：羊依諾肝素鈉樣品組(批號：Ovine-038)、羊依諾肝素鈉注射劑1組(實(shí)施例七所述)、羊依諾肝素鈉注射劑2組(實(shí)施例八所述)和依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品組(為臨床市售藥品，克賽，批號：24459)，濃度均為1mg/Kg；實(shí)驗設(shè)生理鹽水為空白對照。于給藥前及給藥后30min、1h、2h、4h、6h和8h分別采血3mL，用3.8％枸櫞酸鈉抗凝劑1:9抗凝，上機(jī)檢測(同1.1體外抗凝血實(shí)驗)以及抗-Ⅹa活性。實(shí)驗結(jié)果與分析：1)APTT：實(shí)驗結(jié)果如附圖6(1)所示，從圖中可以看出：與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品相比，羊依諾肝素鈉及其注射劑均能顯著延長APTT，且其對APTT延長作用相當(dāng)，他們在兔體內(nèi)達(dá)到APTT最大值時間相近，衰減時間也相近，揭示羊依諾肝素鈉及其注射劑在兔體內(nèi)與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品是一致的。2)PT：實(shí)驗結(jié)果如附圖6(2)所示，從圖中可以看出：各組樣品在兔體內(nèi)均對PT影響較小。此外，在前述1.2中，這三者在體外對PT無顯著延長，體內(nèi)外的效應(yīng)呈現(xiàn)出相對的一致性。3)TT：實(shí)驗結(jié)果如附圖6(3)所示，從圖中可以看出：羊依諾肝素鈉及其注射劑均能顯著延長TT，在兔體內(nèi)達(dá)到TT最大值的時間與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品相近，衰減時間也相當(dāng)。4)抗-Xa活性：實(shí)驗結(jié)果如附圖6(4)所示，從圖中可以看出：各組皮下注射后，兔血漿中肝素的抗-Ⅹa活性，其吸收和代謝(或衰減)曲線均一致，都是在大約2小時至4小時達(dá)到吸收峰值，在8小時幾乎全部衰減。所有以上數(shù)據(jù)揭示，羊依諾肝素鈉及其注射劑，在兔體內(nèi)有著良好的抗凝效果，且與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)。本發(fā)明尚有多種實(shí)施方式，凡采用等同變換或者等效變換而形成的所有技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3