發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明描述了選擇性地?；幕虻鞍字械陌被姆椒ǎ渲兴鲭幕虻鞍拙哂袃蓚€或多個反應(yīng)性的親核官能團(tuán)。

發(fā)明背景

已經(jīng)批準(zhǔn)許多肽用于醫(yī)療實(shí)踐，并且這些肽可以通過重組DNA技術(shù)在合適的宿主細(xì)胞中制備，或可以通過非常確實(shí)的肽合成技術(shù)合成法制備它們。然而，天然的肽以及其類似物傾向于顯示出高清除率，這在許多在長時間內(nèi)需要高的肽血漿濃度的臨床適應(yīng)癥中是無法接受的。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，肽和肽類似物的各種衍生作用可以以良好的趨勢影響肽的清除率，例如，WO98/08871、WO98/08872、WO99/43708、EP 1227107和WO00/55119中所描述的內(nèi)容。這種衍生作用之一是將親脂性的?；氲搅酥委熾闹?，導(dǎo)致合乎需要的長效作用特性(相對于非?；碾?。由此，頻率更小地給予治療蛋白改善了患者對處方治療的依從性，并且還可以降低所給予的肽的數(shù)量。

為了使治療用的肽經(jīng)濟(jì)上切實(shí)可行，制備肽的成本以及肽的治療劑量是關(guān)鍵性的因素。在制備治療用肽期間的主要成本是從雜質(zhì)中分離靶蛋白所要求的純化步驟，其與靶蛋白密切相關(guān)。這些純化步驟通常利用色譜法進(jìn)行，這意味著昂貴的色譜基質(zhì)和溶劑，以及總產(chǎn)率被降低。

將酰基引入到具有一個以上的親核原子(例如，一個以上的胺)的肽或蛋白的一個或多個位點(diǎn)中，會使粗品混合物中的產(chǎn)物-相關(guān)雜質(zhì)的產(chǎn)物混合物增多，所述相關(guān)雜質(zhì)與目標(biāo)化合物極其相似，這就造成產(chǎn)物損失，并因此需要更困難的純化步驟。

本發(fā)明的目標(biāo)是：提供有效、穩(wěn)健和經(jīng)濟(jì)的方法，以便通過間隔基將親脂性基團(tuán)引入到肽或蛋白中。所述間隔基可以例如由一個或多個8-氨基-3,6-二氧雜辛酸部分和谷氨酸組成。與其它已知的方法相比，該方法更具特異性、更穩(wěn)健，由此導(dǎo)致高產(chǎn)率，并降低密切相關(guān)雜質(zhì)的形成。達(dá)到了制備酰化肽或蛋白的成本明顯減少的目的。為了使能夠獲得治療的患者數(shù)量最大，以及為了利用替代性遞送途徑(與皮下注射相比，這種遞送途徑具有更低的生物利用率)例如透皮、肺或口服遞送的益處，價格低廉的酰化肽是高度合乎需要的。

本發(fā)明由此提供了具有驚人的高選擇性的選擇性地?；幕虻鞍字匈嚢彼釟埢摩?氨基的方法。

本發(fā)明概述

本發(fā)明描述了選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性的親核官能團(tuán)。

在一方面，該方法包括∶

a)在水介質(zhì)中，使具有至少兩個反應(yīng)性親核官能團(tuán)的肽或蛋白與通式I的?；瘎┓磻?yīng)

其中

n是1-6

m是1-2

w是4-20

R1是離去基團(tuán)，當(dāng)所述酰化劑與游離胺反應(yīng)時，其可以促進(jìn)在R1連接的羰基和所述胺之間形成酰胺鍵；

其中水介質(zhì)的pH值在pH8至pH14之間；和

b)分離N-?；碾幕虻鞍?；

其中，獲得N-?；碾幕虻鞍?，其包含至少一個游離反應(yīng)性親核官能團(tuán)，該官能團(tuán)沒有被?；騼H僅被部分酰化。

附圖說明

圖1∶用22-羧基-1-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1,10,19,24-四氧代-3,6,12,15-四氧雜-9,18,23-三氮雜四十一烷-41-酸(化合物1)?；痆Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1(7-37)。說明了純度對所加入?；噭?shù)量和pH值的(用HPLC，在260nm處測定)的依賴性。舉例說明的pH值是∶pH10.00(-●-)，pH11.25(-■-)和pH12.00(-▲-)。

發(fā)明說明

本方法提供了在肽或蛋白的目標(biāo)位置固定選擇性?；姆椒?。通過進(jìn)行本發(fā)明的酰化反應(yīng)，令人驚訝地表明，可以獲得選擇性的酰化，并由此使得?；磻?yīng)混合物的雜質(zhì)特性是更少的不合乎需要的雜質(zhì)形式，在?；^程終止之后，這能夠更容易純化和分離目標(biāo)選擇性酰化的產(chǎn)物。

此外，通過本發(fā)明，可以獲得?；椒?，在該方法中，獲得?；碾幕虻鞍祝邗；襟E中或?；襟E之后，不使用苛刻的試劑。所獲得的產(chǎn)物是由此以高產(chǎn)率獲得的，此外，由于使用了集中的方法，與使用非集中方法相比，該方法是比較便宜的方法。

按照本發(fā)明，使用?；噭?，其包括1至6個之間的OEG間隔基，其中OEG間隔基是下式的8-氨基-3,6-二氧雜辛酸(還可以將其命名為[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)部分∶

當(dāng)這種OEG間隔基存在于?；噭┲胁⑶沂褂贸Ｒ?guī)?；椒〞r，本發(fā)明人的經(jīng)驗(yàn)是：常常以低產(chǎn)率獲得?；a(chǎn)物。本發(fā)明提供了有效和穩(wěn)定的?；幕虻鞍椎姆椒ǎ摲椒ㄊ褂冒?至6個OEG間隔基的?；噭?，以高產(chǎn)率提供產(chǎn)物。

?；墙o化合物添加酰基的方法。由此，本文將“?；瘎倍x為：能夠提供可加到肽或蛋白上的?；幕衔?。

“選擇性?；被颉斑x擇性”在本文中是指：與肽或蛋白的其它位置相比，?；噭┲饕谒；碾幕虻鞍椎囊粋€位置反應(yīng)。例如，使用按照本發(fā)明?；椒▽㈦幕虻鞍柞；@得的產(chǎn)物，可以產(chǎn)生?；a(chǎn)物，在該?；a(chǎn)物中，?；瘋?cè)鏈僅僅與肽或蛋白的一個位置相連接，并且不是可能獲得?；乃形恢枚季哂袩o選擇性的?；Ｔ诒景l(fā)明的一方面，獲得選擇性，可以實(shí)現(xiàn)肽或蛋白的?；?，這樣就可以使?；磻?yīng)完成時反應(yīng)混合物中有至少50％的被?；幕虻鞍资窃趦?yōu)選的酰化位點(diǎn)上被?；?。

在一方面，當(dāng)?；磻?yīng)完成時，反應(yīng)混合物中有至少60％酰化肽或蛋白是在優(yōu)選的?；稽c(diǎn)上被酰化的。在另一個方面，至少70％?；幕虻鞍资窃趦?yōu)選的?；稽c(diǎn)被酰化的。在另一個方面，至少80％?；幕虻鞍资窃趦?yōu)選的?；稽c(diǎn)被酰化的。在另一個方面，至少85％酰化肽或蛋白是在優(yōu)選的?；稽c(diǎn)被?；?。在另一個方面，至少90％?；幕虻鞍资窃趦?yōu)選的酰化位點(diǎn)被?；?。在另一個方面，至少95％酰化肽或蛋白是在優(yōu)選的?；稽c(diǎn)被酰化的。在另一個方面，至少97％?；幕虻鞍资窃趦?yōu)選的?；稽c(diǎn)被?；摹Ｔ诹硪粋€方面，至少98％酰化肽或蛋白是在優(yōu)選的?；稽c(diǎn)被?；?。在另一個方面，至少99％酰化肽或蛋白是在優(yōu)選的?；稽c(diǎn)被?；?，在又一個方面，當(dāng)酰化反應(yīng)完畢時，反應(yīng)混合物中大約所有的酰化肽或蛋白是在優(yōu)選的?；稽c(diǎn)被?；?。

在本發(fā)明的一方面，肽或蛋白上的優(yōu)選?；稽c(diǎn)是賴氨酸殘基的ε-氨基，這樣就可以主要在所述賴氨酸的ε-氨基上獲得選擇性的?；?/p>

本文使用的術(shù)語“肽或蛋白”是指由至少五個通過肽鍵連接的構(gòu)成氨基酸組成的化合物。構(gòu)成性氨基酸可以得自于遺傳密碼編碼的氨基酸，并且它們可以是天然氨基酸(不是遺傳密碼編碼的)以及合成氨基酸。非遺傳密碼編碼的天然氨基酸是例如γ-羧基谷氨酸，鳥氨酸，磷酸絲氨酸，D-丙氨酸和D-谷酰胺。合成氨基酸包括化學(xué)合成制備的氨基酸，即通過遺傳密碼編碼的氨基酸的D-異構(gòu)體，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸，Aib(α-氨基異丁酸)，Abu(α-氨基丁酸)，Tle(叔丁基甘氨酸)，β-丙氨酸，3-氨甲基苯甲酸，鄰氨基苯甲酸。

22個產(chǎn)生蛋白的(proteogenic)氨基酸是∶

丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，門冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷酰胺，谷氨酸，甘氨酸，組氨酸，羥脯氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，色氨酸，酪氨酸，纈氨酸。

由此，非產(chǎn)生蛋白的(proteogenic)氨基酸是可以通過肽鍵結(jié)合進(jìn)肽或蛋白中的部分，但不是產(chǎn)生蛋白的(proteogenic)氨基酸。實(shí)例是：γ-羧基谷氨酸，鳥氨酸，磷酸絲氨酸，D-氨基酸(例如D-丙氨酸和D-谷酰胺)，合成的非產(chǎn)生蛋白的(proteogenic)氨基酸，包括通過化學(xué)合成制備的氨基酸，即通過遺傳密碼編碼的氨基酸的D-異構(gòu)體，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸，Aib(α-氨基異丁酸)，Abu(α-氨基丁酸)，鳥氨酸，Dap(2,3-二氨基丙酸)，Dab(2,4-二氨基丁酸)，Tle(叔丁基甘氨酸)，3-氨甲基苯甲酸，鄰氨基苯甲酸，去氨基-組氨酸，氨基酸的β類似物，例如β-丙氨酸等等，D-組氨酸，去氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，homo-組氨酸，N^α-乙酰基-組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，α-甲基-組氨酸，3-吡啶基丙氨酸，2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸，(1-氨基環(huán)丙基)羧酸，(1-氨基環(huán)丁基)羧酸，(1-氨基環(huán)戊基)羧酸，(1-氨基環(huán)己基)羧酸，(1-氨基環(huán)庚基)羧酸，或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；

本文關(guān)于肽或蛋白使用的術(shù)語“類似物”是指修飾的肽或蛋白，其中肽或蛋白的一個或多個氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代，和/或，其中一個或多個氨基酸殘基從肽或蛋白上除去，和/或，其中一個或多個氨基酸殘基從肽或蛋白上除去，和/或，其中一個或多個氨基酸殘基加到肽或蛋白上。氨基酸殘基的這種加入或除去可以在肽或蛋白的N端進(jìn)行，和/或，在肽或蛋白的C端進(jìn)行。一種簡單的系統(tǒng)常常用于描述類似物∶例如[Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1(7-37)表示GLP-1(7-37)類似物，其中天然存在的丙氨酸在8位被α-氨基異丁酸取代，和賴氨酸在34位被精氨酸取代。將沒有說明旋光異構(gòu)體的所有氨基酸理解為L-異構(gòu)體。在本發(fā)明的方面中，已經(jīng)修飾了最多17個氨基酸。在本發(fā)明的方面中，已經(jīng)修飾了最多15個氨基酸。在本發(fā)明的方面中，已經(jīng)修飾了最多10個氨基酸。在本發(fā)明的方面中，已經(jīng)修飾了最多8個氨基酸。在本發(fā)明的方面中，已經(jīng)修飾了最多7個氨基酸。在本發(fā)明的方面中，已經(jīng)修飾了最多6個氨基酸。在本發(fā)明的方面中，已經(jīng)修飾了最多5個氨基酸。在本發(fā)明的方面中，已經(jīng)修飾了最多4個氨基酸。在本發(fā)明的方面中，已經(jīng)修飾了最多3個氨基酸。在本發(fā)明的方面中，已經(jīng)修飾了最多2個氨基酸。在本發(fā)明的方面中，已經(jīng)修飾了1個氨基酸。

在本發(fā)明的一方面，按照本發(fā)明的衍生物的C端可以以酸或酰胺的形式終止。在一方面，本發(fā)明的衍生物的C端是酰胺。在另一個方面，本發(fā)明的衍生物的C端是酸。

應(yīng)該理解，肽或蛋白應(yīng)該攜帶至少兩個反應(yīng)性的親核官能團(tuán)，例如氨基，例如N端氨基和/或側(cè)鏈氨基。肽或蛋白可以包括不是通過遺傳密碼編碼的氨基酸，例如D-氨基酸，3-羥脯氨酸，Aib(α-氨基異丁酸)，鳥氨酸，Dap(2,3-二氨基丙酸)，Dab(2,4-二氨基丁酸)和戊基甘氨酸。尤其感興趣的是賴氨酸、鳥氨酸、Dap和Dab氨基酸殘基的氨基。賴氨酸殘基的ε-氨基的N-酰化與該方法尤其相關(guān)。

本文中，按照下列原理進(jìn)行肽或蛋白的命名∶以相對于母體肽或蛋白(例如人GLP-1或人胰島素)的突變和修飾(?；?形式給予命名。為了命名?；糠郑凑誌UPAC命名法進(jìn)行命名，在其它情況下，按照肽命名法來命名。例如，命名?；糠帧?/p>

可以是例如“十八烷二?；?γGlu-OEG-OEG”，或“17-羧基十七酰-γGlu-OEG-OEG”，其中OEG是氨基酸-NH(CH₂)₂O(CH₂)₂OCH₂CO-的速記符號，γGlu(或gGlu)是氨基酸γ谷氨酸部分的速記符號。

在一方面，要按照本發(fā)明?；碾幕虻鞍拙哂兄辽賰蓚€可以與?；噭┓磻?yīng)的反應(yīng)性的親核官能團(tuán)。在另一個方面，肽或蛋白具有2和10個之間的反應(yīng)性的親核官能團(tuán)，例如，2和8個之間的反應(yīng)性的親核官能團(tuán)，2和6個之間的反應(yīng)性的親核官能團(tuán)，2和4個之間的反應(yīng)性的親核官能團(tuán)或2和3個之間的反應(yīng)性的親核官能團(tuán)。在一方面，肽或蛋白具有2個反應(yīng)性的親核官能團(tuán)。

在本文中，反應(yīng)性親核官能團(tuán)被理解為：在給定反應(yīng)條件下與酰化試劑反應(yīng)形成穩(wěn)定共價鍵的化學(xué)官能團(tuán)。這種反應(yīng)性的親核官能團(tuán)的例子包括但不局限于：例如酪氨酸的羥基(其中羥基可以與?；噭┓磻?yīng))，絲氨酸的羥基(其中羥基可以與?；噭┓磻?yīng))，蘇氨酸的羥基(其中羥基可以與?；噭┓磻?yīng))，例如半胱氨酸的硫醇基(其中硫醇基可以與?；噭┓磻?yīng))，氨基，例如但不局限于：例如肽或蛋白的Nα-端胺，賴氨酸的氨基(其中ε-氨基可以與?；噭┓磻?yīng))，及在肽或蛋白內(nèi)的其它親核劑，例如但不局限于：精氨酸(其中胍基團(tuán)可以與?；噭┓磻?yīng))和組氨酸(其中咪唑基可以與?；噭┓磻?yīng))。

在一方面，要按照本發(fā)明?；碾幕虻鞍拙哂兄辽賰蓚€游離氨基。在另一個方面，肽或蛋白具有2和10個之間的游離氨基，例如，2和8個之間的游離氨基，2和6個之間的游離氨基，2和4個之間的游離氨基或2和3個之間的游離氨基。在一方面，肽或蛋白具有2個游離氨基。

當(dāng)本文使用時，術(shù)語“游離氨基”是指在給定反應(yīng)條件下與?；瘎┓磻?yīng)形成共價鍵的伯或仲氨基。

當(dāng)與N-?；碾牡闹辽僖粋€游離氨基結(jié)合使用時，術(shù)語“部分?；笔侵福涸诎鯪-酰化的肽的反應(yīng)混合物中，反應(yīng)混合物中的一部分肽具有至少一個不與酰化部分連接的游離氨基，肽的另一個部分具有相同的至少一個與?；糠诌B接的氨基。

要被?；碾幕虻鞍卓梢园ㄒ粋€或多個賴氨酸(Lys)氨基酸殘基。在一方面，選擇的?；恢迷陔幕虻鞍字械馁嚢彼峄鶊F(tuán)的ε-氨基和肽或蛋白的N端中的α-氨基之間，其中?；饕窃谝粋€或多個ε-氨基上獲得的，而不是在肽或蛋白的N端中的α-氨基上獲得的。在一方面，肽或蛋白包含一個賴氨酸(Lys)氨基酸殘基和一個或多個N端α-氨基，其中在Lys氨基酸的ε-氨基上進(jìn)行選擇性酰化。在一個進(jìn)一步的方面，肽或蛋白包含一個賴氨酸(Lys)氨基酸殘基和一個N端α-氨基，其中在Lys氨基酸的ε-氨基上進(jìn)行選擇性?；?。

“反應(yīng)混合物”在本文中被理解為：當(dāng)?；瘎┡c肽或蛋白反應(yīng)時所使用的溶劑和試劑的混合物。反應(yīng)混合物應(yīng)該是水溶液，即水存在于反應(yīng)混合物中。

為了獲得選擇性?；瑢⒑磻?yīng)混合物的pH值調(diào)節(jié)至pH8和pH14之間。在一方面，反應(yīng)介質(zhì)的pH值在pH9和pH13之間。在另一個方面，pH值在pH10和pH12之間。在另一個方面，pH值在pH12和pH13之間。在另一個方面，pH值在pH10和pH13之間。在另一個方面，pH值在pH10.5和pH12.0之間，或在pH11.0和pH11.5之間，在又一個方面，pH值是大約pH11.0-11.3。在另一個方面，pH值在pH11和pH12之間，例如在pH11.5和pH12之間，或在pH11.5和pH11.8之間，或在pH11.5和pH12.5之間。在一方面，pH值大約是pH11.5。

本文使用的術(shù)語“大約”或“大致”是指合理地接近所表明的數(shù)值，例如加上或減去10％，或?qū)H值來說是加上或減去0.2。

按照本發(fā)明通過調(diào)節(jié)pH值，可以獲得意外穩(wěn)健的?；磻?yīng)。當(dāng)涉及到?；磻?yīng)時，“穩(wěn)健的”或“穩(wěn)固的”在本文中是指：當(dāng)使用按照本發(fā)明的?；椒〞r，可以獲得高產(chǎn)率和高選擇性，并且當(dāng)加入過量酰化劑時，對加入的?；瘎┑牧坎幻舾?參見例如圖1)。

反應(yīng)混合物的pH值可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來控制。例如，可以用簡單的pH計(jì)測定pH值，可以人工地加入酸或堿，以便調(diào)節(jié)pH值，或可以使用具有反饋機(jī)理的pH計(jì)，其可以控制溶液的pH值。

適合于調(diào)節(jié)pH值的酸包括但不局限于∶鹽酸，硫酸和乙酸。

適合于調(diào)節(jié)pH值的堿包括但不局限于∶叔胺堿，例如但不局限于三乙胺或二異丙基乙胺，N-甲基嗎啉，堿金屬氫氧化物，例如但不局限于氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化銫，和堿金屬碳酸鹽，例如但不局限于碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸鋰、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉或碳酸氫鋰。

在本發(fā)明的一方面，反應(yīng)混合物包含緩沖液。在本發(fā)明的一方面，緩沖液選自∶磷酸鹽緩沖液，碳酸鈉緩沖液，Bicine(N,N-二(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液)，HEPPS緩沖液(3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸緩沖液)，HEPES緩沖液(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸緩沖液)，MOPS緩沖液(3-(N-嗎啉基)丙磺酸緩沖液)和TEA緩沖液(三乙胺緩沖液)。

?；噭?yīng)該優(yōu)選以固體形式加入到溶液中，或溶解在合適惰性溶劑中，而后以溶液形式加入。惰性溶劑的例子是例如但不局限于：N-甲基吡咯烷酮，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，乙腈，四氫呋喃和二甲亞砜。?；噭┑募尤肓靠梢允抢?.5-20當(dāng)量，例如1-20當(dāng)量，1-5當(dāng)量或1-3當(dāng)量(相對于反應(yīng)性親核官能團(tuán)，例如被酰化的氨基的數(shù)目)。例如，如果加入1摩爾肽或蛋白(具有1個要被?；陌被?，可以加入0.5摩爾至20摩爾數(shù)量的?；瘎?，例如1至5摩爾。意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用按照本發(fā)明方法時，可以實(shí)現(xiàn)選擇性和穩(wěn)健性，即使在加入大量過剩的?；噭r。在一方面，加入的?；噭┑臄?shù)量為1-4當(dāng)量，或者1.2-3.0當(dāng)量，或者1.4-2.0當(dāng)量。在一方面，酰化試劑的加入數(shù)量為大約1.75當(dāng)量。當(dāng)溶解在惰性溶劑中時，可以以每ml惰性溶劑至少10mg?；噭┑臐舛燃尤膈；噭Ｔ谝环矫?，?；噭┰诙栊匀軇┲械臐舛仍?0mg/ml和1000mg/ml惰性溶劑之間。在另一個方面，該濃度在50mg/ml和250mg/ml惰性溶劑之間。在又一個方面，?；噭┰诙栊匀軇┲械臐舛却蠹s為100mg/ml惰性溶劑。

在?；^程期間，反應(yīng)混合物的溫度可以在-5℃和50℃之間，例如在0℃和50℃之間。在一方面，該溫度在5℃和40℃之間。在另一個方面，溫度在10℃和30℃之間。在又一個方面，該溫度大約為20℃。在又另一個方面，溫度在-5℃和10℃之間。在又另一個方面，溫度在0℃和5℃之間。在又另一個方面，溫度在2和5℃之間。在本發(fā)明的一方面，將反應(yīng)混合物保持在室溫下。

可以在攪拌或攪動下，在0分鐘和480分鐘之間的期間內(nèi)，將?；噭┘尤氲椒磻?yīng)混合物中，例如，在10和240分鐘之間的期間內(nèi)。在一方面，在10和180分鐘之間的期間內(nèi)加入試劑。在另一個方面，在20和120分鐘之間的期間內(nèi)加入試劑。在又一個方面，在大約30分鐘期間內(nèi)加入試劑。在又一個方面，在大約60分鐘期間內(nèi)加入試劑。在又另一個方面，在30和60分鐘之間的期間內(nèi)加入試劑。

加入酰化試劑之后，可以使?；磻?yīng)混合物(任選在攪拌或攪動下)保持反應(yīng)0分鐘和1440分鐘(即24小時)之間的時間，例如在0和720分鐘之間，而后通過將pH值調(diào)節(jié)至大約7.5-8.0或更低來終止反應(yīng)。在一方面，使?；磻?yīng)混合物保持15和240分鐘之間。在另一個方面，使酰化混合物保持30和120分鐘之間。在另一個方面，使酰化混合物保持0和15分鐘之間。在又一個方面，使?；旌衔锉３执蠹s0分鐘，即，加入?；噭┲罅⒓唇K止反應(yīng)。在又一個方面，使?；旌衔锉３执蠹s30分鐘。在又一個方面，使?；旌衔锉３执蠹s60分鐘。在又另一個方面，使?；旌衔锉３?0和60分鐘之間。

肽或蛋白應(yīng)該優(yōu)選以至少5.0mg/ml的濃度存在于反應(yīng)混合物中。在一方面，蛋白或肽的濃度在5.0mg/ml和250mg/ml反應(yīng)混合物之間。在又一個方面，蛋白或肽的濃度在10mg/ml和100mg/ml之間。在又一個方面，蛋白或肽的濃度在10mg/ml和75mg/ml之間。在又一個方面，蛋白或肽的濃度在10mg/ml和50mg/ml之間。在又一個方面，蛋白或肽的濃度在10mg/ml和30mg/ml之間。在又一個方面，蛋白或肽的濃度在15mg/ml和25mg/ml之間。在又一個方面，蛋白或肽的濃度在10.0mg/ml和20.0mg/ml之間。在另一個方面，蛋白或肽的濃度大致為12.5mg/ml。在另一個方面，蛋白或肽的濃度大致為20mg/ml。

反應(yīng)混合物可以包括其它組份和/或溶劑。反應(yīng)混合物中可以存在例如惰性溶劑，例如極性非質(zhì)子溶劑，包括但不限于：N-甲基吡咯烷酮，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，乙腈，四氫呋喃和二甲亞砜。在一方面，惰性溶劑的存在數(shù)量為反應(yīng)混合物總量的0-25％v/v。在另一個方面，惰性溶劑的存在數(shù)量為0-10％v/v或0-5％v/v。在另一個方面，惰性溶劑的存在數(shù)量為4-20％v/v或4-10％v/v。在又一個方面，惰性溶劑的存在數(shù)量為4-5％v/v。在一方面，存在惰性溶劑，并且是N-甲基吡咯烷酮。

在一方面，反應(yīng)混合物進(jìn)一步包含化合物和/或鹽，其在肽或蛋白和?；噭┤芙庠诜磻?yīng)介質(zhì)中之前，存在于要被?；碾幕虻鞍字?，或存在于酰化試劑中。例如，由于例如作為肽或蛋白質(zhì)合成的結(jié)果而通過離子鍵存在于肽或蛋白中的鹽或其它化合物，可以存在于按照本發(fā)明方法的反應(yīng)混合物中。這種化合物和/或鹽的例子包括但不局限于∶三氟乙酸(TFA)，乙酸，鹽酸(HCl)，枸櫞酸，亞磷酸，磺酸，鈉鹽，鉀鹽和鋰鹽。

在本發(fā)明的一方面，要被引入到肽或蛋白中，例如，肽或蛋白的Lys殘基的ε-氨基的酰基，包括白蛋白結(jié)合的殘基，即，在體內(nèi)條件下與白蛋白結(jié)合的殘基(當(dāng)連接肽或蛋白時)。

在一方面，白蛋白結(jié)合殘基是親脂性的殘基。在進(jìn)一步方面，親脂性的殘基通過連接基與肽或蛋白相連接。

在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，白蛋白結(jié)合殘基在生理pH值下帶負(fù)電荷。在本發(fā)明的另一個方面，白蛋白結(jié)合殘基包括可以被帶負(fù)電荷的基團(tuán)。一個優(yōu)選的可以被帶負(fù)電荷的基團(tuán)是羧基。

在一方面，白蛋白結(jié)合殘基是α,ω-脂肪族二酸殘基。

在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，親脂性殘基的α,ω-脂肪族二酸殘基具有6至40個碳原子，8至26個碳原子或8至22個碳原子。

在本發(fā)明的另一個方面，白蛋白結(jié)合殘基是直鏈或支鏈烷烴α,ω-二羧酸的?；?。在進(jìn)一步方面，白蛋白結(jié)合殘基是直鏈或支鏈烷烴α,ω-二羧酸的?；撍岚ò被岵糠?，例如，γ-Glu部分。在進(jìn)一步方面，白蛋白結(jié)合殘基是直鏈或支鏈烷烴α,ω-二羧酸的?；?，該酸包括兩個氨基酸部分，例如，γ-Glu部分和8-氨基-3,6-二氧雜辛酸(OEG)部分。在進(jìn)一步方面，白蛋白結(jié)合殘基是直鏈或支鏈烷烴α,ω-二羧酸的?；?，該酸包括多個氨基酸部分，例如，一個γ-Glu部分和連續(xù)的多個8-氨基-3,6-二氧雜辛酸(OEG)部分。

在按照本發(fā)明的方法中，使具有至少兩個反應(yīng)性親核官能團(tuán)的肽或蛋白與通式I的酰化劑反應(yīng)

其中

n是1-6，或者1-3，1-2，或者2

m是1-2，或者2

w是4-20，或者10-20，或者14-18，或者16

R1是離去基團(tuán)，當(dāng)所述?；瘎┡c游離胺反應(yīng)時，其可以促進(jìn)在連接于R1的羰基和所述胺之間形成酰胺鍵。

?；瘎┛梢允羌儗τ丑w形式，其中手性氨基酸部分的立體構(gòu)型是D或L型(或使用R/S術(shù)語時∶R或S型)，或可以是對映體的混合物形式(D和L/R和S)。在本發(fā)明的一方面，?；瘎┦菍τ丑w的混合物形式。在一方面，?；瘎┦羌儗τ丑w形式。在一方面，?；瘎┑氖中园被岵糠质荄型。在一方面，?；瘎┑氖中园被岵糠质荓型。

式I中的R1可以是當(dāng)?；瘎┡c游離胺反應(yīng)時能夠起到離去基團(tuán)作用、因而就可以在R1連接的羰基和胺之間形成酰胺鍵的任何基團(tuán)。例如，R1與R1相連接的羰基一起可以表示酸酐，羧酸鹵化物或酯。

在一方面，式I中的R1與R1相連接的羰基一起表示酯，例如活化的酯或活化的N-羥基酰亞胺酯(imide ester)。這些酯中的每一個構(gòu)成本發(fā)明的替代性方面。

活化的酯和活化的N-羥基酰亞胺酯(imide ester)作為在氨基、硫基和羥基的酰化中使用的官能團(tuán)在有機(jī)化學(xué)(特別是肽化學(xué))領(lǐng)域?yàn)榇蠹宜熘?。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“活化的酯或活化的N-羥基酰亞胺酯”是指羧基的酯官能化形式，其適合于將胺、優(yōu)選伯胺?；Ｓ纱藨?yīng)該理解，伯胺的酰化選擇性優(yōu)選對于羥基和硫基進(jìn)行?；?。尤其優(yōu)選活化的N-羥基酰亞胺酯。

術(shù)語“活化的”?；瘎┦侵甘褂贸Ｒ?guī)技術(shù)活化的?；瘎?，例如，如下面所描述：“Amide bond formation and peptide coupling”(Tetrahedron 61(46),10827-10852,2005)。

活化?；瘎┑睦影ǖ痪窒抻冢乎；龋；?，?；?，對稱酸酐，混合酸酐，使用常見的碳二亞胺(例如但不局限于：二異丙基碳二亞胺(DIPCDI)，N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，1-乙基-3-(3'-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC))活化的羧酸。此外包括的是(但不限于)使用上述碳二亞胺和添加劑(例如但不局限于：N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)，N-羥基苯并三唑(HOBt)，1-羥基-7-氮雜苯并三唑，6-氯-N-羥基苯并三唑(HOAt)，3-羥基-3,4-二氫-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(DhbtOH)或?qū)ο趸椒?PNP))的羧酸。還包括的是(但不限于)被下列脲陽離子鹽或膦鹽活化的羧酸：例如但不局限于：O-苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)，O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)，2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基銨六氟磷酸鹽(HCTU)，2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基銨四氟硼酸鹽(TCTU)，2-(1H-7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)，2-(3,4-二氫-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪-3-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HDBTU)，2-琥珀酰亞胺基-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HSTU)，N,N,N',N'-四甲基-O-(琥珀酰亞胺基)脲四氟硼酸鹽(TSTU)，2-(內(nèi)-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亞胺(dicarboxymido))-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HNTU)，1-苯并三唑氧基三-(二甲基氨基)磷六氟磷酸鹽(BOP)或苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷六氟磷酸鹽(PYBOP)。其它活化酯包括但不局限于下列的酯：N-羥基琥珀酰亞胺(NHS酯)，對硝基苯酚(PNP酯)，N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亞胺(HONB-酯)，N-五氟苯酚酯(PfP-酯)，2,4-二硝基苯基酯，4-硝基苯基酯，3-羥基-3,4-二氫-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HODhbt)，羰基二咪唑(CDI)或N-乙基-5-苯基異唑-3'-磺酸鹽(NEPIS)，優(yōu)選N-羥基琥珀酰亞胺酯、對硝基苯酚或HOBt酯或其衍生物，使用例如下列參考文獻(xiàn)中所描述的反應(yīng)條件∶Organic Synthesis on solid Phase(Florencio Zaragoza Wiley-VCH Verlag GmbH,D-69469Weinheim,2000),Novabiochem Catalog(Merck Biosciences 2006/2007)和Fmoc SolidPhase Peptide Synthesis(Edited by W.C.Chan and P.D.White,Oxford University Press,2000,ISBN 0-19-963724-5)。

相對于要被酰化的肽或蛋白的氨基數(shù)量，以稍微不足的數(shù)量、相等數(shù)量或稍微過量的數(shù)量使用式I的?；瘎Ｏ鄬τ诎凑赵摲椒ㄒ；姆磻?yīng)性親核官能團(tuán)(例如氨基)的數(shù)量，該比例可以例如是1:0.5，典型地是1:1至1:20，具有相等數(shù)量或過量的?；瘎?，或者相對于按照該方法?；姆磻?yīng)性親核官能團(tuán)(例如氨基)的數(shù)量，該比例是1:1.1至1:5。可以以固體形式將?；瘎┘尤氲椒磻?yīng)混合物中，或可以以溶液形式加入到反應(yīng)混合物中。當(dāng)以溶液形式加入?；瘎r，將其溶解在惰性溶劑中，其中術(shù)語“惰性”是指對?；瘎┦嵌栊缘?。通過加入酸可以提高(即穩(wěn)定化)?；瘎┑姆€(wěn)定性。

在該方法的一方面，以固體形式將酰化劑加入到反應(yīng)混合物中。

在該方法的一方面，用作步驟a)的起始原料的所述肽或蛋白具有至少80％，至少90％，至少93％，至少95％，或至少97％(利用HPLC測定)的肽或蛋白純度。

作為典型實(shí)例，使用肽或蛋白和式I的?；瘎?1:1至1:5摩爾比)進(jìn)行步驟(a)的反應(yīng)。典型地，在-10-30℃(例如0-30℃)將肽或蛋白預(yù)先溶解在水中，并使用堿金屬氫氧化物(例如氫氧化鈉或氫氧化鉀)或叔胺堿(例如三乙基胺或N,N-二異丙基乙胺)將pH值調(diào)節(jié)至目標(biāo)pH值水平?？梢允褂盟?例如鹽酸，磺酸或乙酸)進(jìn)一步調(diào)節(jié)PH值，但溫度優(yōu)選在上述范圍之內(nèi)?；蛘?，將肽或蛋白預(yù)先直接溶解在包含合適數(shù)量的相關(guān)酸或堿的水溶液中。隨后以固體或溶液形式加入?；瘎?。典型地，使反應(yīng)進(jìn)行完全(可以用HPLC監(jiān)控)，典型地可以從立刻和至多24小時之內(nèi)完成反應(yīng)，例如0.2-6小時，而后加入酸，例如鹽酸、磺酸或乙酸，達(dá)到pH6.5-9.0，例如pH7.5-8.0。典型地用離子交換色譜，HPLC，分離并純化產(chǎn)物，和/或在等電pH值下進(jìn)行沉淀。

本發(fā)明尤其適合于?；m于治療例如糖尿病的肽或蛋白(例如，胰高血糖素樣肽和胰島素)。

在一方面，要被?；碾幕虻鞍资且雀哐撬貥与?。

本文使用的術(shù)語“胰高血糖素樣肽”是指肽的胰高血糖素家族、exendins和其類似物。肽的胰高血糖素家族是通過胰高血糖素前原基因編碼的，并且包括具有高度同源性的三種小肽，即胰高血糖素(1-29)，GLP-1(1-37)和GLP-2(1-33)。Exendins是在蜥蜴中表達(dá)的肽，類似于GLP-1，是促胰島素分泌(insulinotropic)肽。exendins的例子是exendin-3和exendin-4。

本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)知道術(shù)語GLP-1、GLP-2、exendin-3和exendin-4。例如，本文使用的“GLP-1化合物”或“GLP-1肽”是指人GLP-1(7-37)、其促胰島素分泌(insulinotropic)類似物和其促胰島素分泌(insulinotropic)衍生物。GLP-1類似物的非限制性例子是：GLP-1(7-36)酰胺，Arg³⁴-GLP-1(7-37)，Aib⁸Arg³⁴-GLP-1(7-37)，Gly⁸-GLP-1(7-37)，Val⁸-GLP-1(7-36)-酰胺和Val⁸Asp²²-GLP-1(7-37)。GLP-1衍生物的非限制性例子是：去氨基-His⁷，Arg²⁶，Lys³⁴(N^ε-(γ-Glu(N^α-十六酰)))-GLP-1(7-37)，去氨基-His⁷，Arg²⁶，Lys³⁴(N^ε-辛酰)-GLP-1(7-37)，Arg^26,34，Lys³⁸(N^ε-(ω-羧基十五酰))-GLP-1(7-38)，Arg²⁶,34，Lys³⁶(N^ε-(γ-Glu(N^α-十六酰)))-GLP-1(7-36)和Arg³⁴，Lys²⁶(N^ε-(γ-Glu(N^α-十六酰)))-GLP-1(7-37)。

在一方面，按照本發(fā)明的胰高血糖素樣肽是二肽基氨肽酶IV保護(hù)的胰高血糖素樣肽。在另一個方面，按照本發(fā)明的GLP-1類似物是二肽基氨肽酶IV保護(hù)的GLP-1類似物。

本文使用的術(shù)語“二肽基氨肽酶IV保護(hù)的”是指比天然化合物(例如GLP-1(7-37))更耐受二肽基氨肽酶IV(DPP-IV)的胰高血糖素樣肽(例如GLP-1類似物)。通過例如天然化合物的突變和/或衍生，可以獲得這種保護(hù)。GLP-1化合物對由二肽基氨肽酶IV引起的降解的抗性是通過下列降解試驗(yàn)測定的∶

在37℃，在100μL的0.1M三乙胺-HCl緩沖液(pH7.4)中，用1μL純化二肽基氨肽酶IV(相當(dāng)于5mU的酶活性)培養(yǎng)GLP-1化合物的(5nmol)等分樣品10-180分鐘。通過加入5μL的10％三氟乙酸來終止酶反應(yīng)，肽降解產(chǎn)物使用HPLC分析進(jìn)行分離和定量。進(jìn)行這種分析的一個方法是∶按照Siegel等人Regul.Pept.1999；79:93-102和Mentlein等人Eur.J.Biochem.1993；214:829-35，將混合物施加到Vydac C18大孔徑(30nm孔，5μm顆粒)250x 4.6mm柱上，以1ml/min的流速洗脫，用乙腈/0.1％三氟乙酸混合物進(jìn)行線性階式梯度(0％乙腈，3min；0-24％乙腈，17min；24-48％乙腈，1min)?？梢酝ㄟ^220nm(肽鍵)或280nm(芳香族氨基酸)處它們的吸光度來監(jiān)控肽和它們的降解產(chǎn)物，并且通過將它們的峰面積(與標(biāo)準(zhǔn)樣品的面積相關(guān)聯(lián))進(jìn)行積分來定量。估算在培養(yǎng)期間的GLP-1化合物被二肽基氨肽酶IV水解的比例，培養(yǎng)期間會導(dǎo)致小于10％的GLP-1化合物被水解。

關(guān)于胰高血糖素樣肽，本文使用的術(shù)語“促胰島素分泌(insulinotropic)”是指在對血漿葡萄糖水平增加的響應(yīng)過程中刺激胰島素分泌的能力。促胰島素分泌(insulinotropic)的胰高血糖素樣肽是GLP-1受體的激動劑?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的體外或體內(nèi)試驗(yàn)來測定化合物的促胰島素分泌(insulinotropic)性能。下列體外試驗(yàn)可以用于測定化合物(例如，胰高血糖素樣肽)的促胰島素分泌(insulinotropic)特性。在下面試驗(yàn)中，優(yōu)選的促胰島素分泌(insulinotropic)化合物顯示出小于5nM的EC₅₀值，更優(yōu)選小于500pM的EC₅₀值。

在DMEM介質(zhì)中培育表達(dá)克隆人GLP-1受體的幼倉鼠腎臟(BHK)細(xì)胞(BHK 467-12A)，DMEM介質(zhì)中加入100IU/mL青霉素、100μL/mL鏈霉素、10％胎兒小牛血清和1mg/mL遺傳霉素G-418(Life Technologies)。通過在緩沖液(10mM Tris-HCl，30mM NaCl和1mM二硫蘇糖醇，pH7.4，另外包含5mg/mL亮肽素(Sigma)，5mg/L抑胃肽(Sigma)，100mg/L桿菌肽(Sigma)和16mg/L抑肽酶(Calbiochem-Novabiochem，La Jolla，CA))中均化來制備質(zhì)膜。在41％W/v蔗糖層上面將組織均漿離心。在緩沖液中稀釋兩個層之間的白色區(qū)域，并離心。在-80℃保存質(zhì)膜，直到使用為止。

通過測定cAMP(作為對促胰島素分泌(insulinotropic)肽或促胰島素分泌(insulinotropic)化合物的刺激的響應(yīng))，進(jìn)行功能性受體試驗(yàn)。在96孔微孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，總體積140mL，具有下列最終濃度∶50mM Tris-HCl，1mM EGTA，1.5mM MgSO₄，1.7mM ATP，20mMGTP，2mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，0.01％w/v Tween-20，pH7.4。將化合物在緩沖液中溶解并稀釋。每個實(shí)驗(yàn)都新制備GTP∶將2.5μg膜加入到每個孔中，并在室溫下、在暗處將該混合物培養(yǎng)90分鐘，同時搖動。通過加入25mL 0.5M HCl來終止反應(yīng)。利用閃爍近似測定法(RPA 542，Amersham，UK)測定形成的cAMP。給化合物繪制劑量-反應(yīng)曲線，并使用GraphPad Prism軟件計(jì)算EC₅₀值。

本文使用的術(shù)語“促胰島素分泌(insulinotropic)化合物的前體藥物”是指給予患者之后能夠轉(zhuǎn)變?yōu)榇僖葝u素分泌(insulinotropic)化合物的化學(xué)修飾的化合物。這種前體藥物典型地是促胰島素分泌(insulinotropic)化合物的氨基酸延伸形式或酯。

本文使用的術(shù)語“exendin-4化合物”定義為：exendin-4(1-39)、其促胰島素分泌(insulinotropic)片段、其促胰島素分泌(insulinotropic)類似物和其促胰島素分泌(insulinotropic)衍生物。exendin-4的促胰島素分泌(insulinotropic)片段是促胰島素分泌(insulinotropic)肽，其整個序列可以在exendin-4的序列中得到，并且已缺失至少一個端部氨基酸。exendin-4(1-39)的促胰島素分泌(insulinotropic)片段的例子是exendin-4(1-38)和exendin-4(1-31)?？梢岳帽绢I(lǐng)域眾所周知的體外或體內(nèi)試驗(yàn)來測定化合物的促胰島素分泌(insulinotropic)性能。例如，可以將化合物給予動物，并監(jiān)控隨時間變化的胰島素濃度。exendin-4(1-39)的促胰島素分泌(insulinotropic)類似物指的是相應(yīng)的分子，在這種分子中，一個或多個氨基酸殘基與其它氨基酸殘基交換，和/或，已從其上除去一個或多個氨基酸殘基，和/或，為其加上一個或多個氨基酸殘基，條件是，所述類似物是促胰島素分泌(insulinotropic)化合物，或是促胰島素分泌(insulinotropic)化合物的前體藥物。exendin-4(1-39)的促胰島素分泌(insulinotropic)類似物的例子是Ser²Asp³-exendin-4(1-39)，在其中，分別用絲氨酸和門冬氨酸替換2和3位的氨基酸殘基(這種特定類似物在本領(lǐng)域還稱為exendin-3)。exendin-4(1-39)和其類似物的促胰島素分泌(insulinotropic)衍生物是本領(lǐng)域技術(shù)人員所考慮的這些肽的衍生物，即，具有至少一個不存在于母體肽分子中的取代基，條件是，所述衍生物是促胰島素分泌(insulinotropic)化合物或是促胰島素分泌(insulinotropic)化合物的前體藥物。取代基的例子是酰胺，碳水化合物，烷基，酯和親脂性的取代基。exendin-4(1-39)和其類似物的促胰島素分泌(insulinotropic)衍生物的例子是Tyr³¹-exendin-4(1-31)-酰胺。

本文使用的術(shù)語“穩(wěn)定的exendin-4化合物”是指化學(xué)修飾的exendin-4(1-39)，即，顯示出至少10小時的體內(nèi)血漿消除半衰期(在人中，通過常規(guī)方法測定)的類似物或衍生物。

本文使用的術(shù)語“二肽基氨肽酶IV保護(hù)的exendin-4化合物”是指比exendin-4更耐受血漿肽酶二肽基氨肽酶IV(DPP-IV)的exendin-4化合物(利用二肽基氨肽酶IV保護(hù)的GLP-1化合物的定義下面所描述的試驗(yàn)來測定)。

GLP-1類似物可以是這樣的類似物，其中天然存在的在GLP-1(7-37)的34位的Lys已被Arg取代。

此外，本發(fā)明包括促胰島素分泌(insulinotropic)肽的前體或中間體的衍生物。

在本發(fā)明的一方面，胰高血糖素樣肽是促胰島素分泌(insulinotropic)肽。在進(jìn)一步方面，促胰島素分泌(insulinotropic)的胰高血糖素樣肽選自GLP-1，GLP-2，exendin-4，exendin-3和其類似物和衍生物。

基于蛋白的構(gòu)造穩(wěn)定性的藥物對于保持生物活性和對于使不可逆轉(zhuǎn)的結(jié)構(gòu)損失(由于變性和纖維化)最小化是重要的。尤其是，由于復(fù)雜的重折疊型式，大的促胰島素分泌(insulinotropic)肽和蛋白在構(gòu)型變化方面是不穩(wěn)定的。此外，具有已知纖維化歷史的促胰島素分泌肽，例如GLP-1，尤其對三級結(jié)構(gòu)的去穩(wěn)定作用敏感(即，形成融球態(tài))。

在一方面，按照本發(fā)明的胰高血糖素樣肽的構(gòu)成性氨基酸可以選自遺傳密碼編碼的氨基酸，并且它們可以是天然氨基酸(不是遺傳密碼編碼的)以及合成氨基酸。非遺傳密碼編碼的天然氨基酸是例如羥脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，鳥氨酸，磷酸絲氨酸，D-丙氨酸和D-谷酰胺。合成氨基酸包括通過化學(xué)合成制備的氨基酸，即遺傳密碼編碼的氨基酸的D-異構(gòu)體，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸，Aib(α-氨基異丁酸)，Abu(α-氨基丁酸)，Tle(叔丁基甘氨酸)，β-丙氨酸，3-氨甲基苯甲酸，鄰氨基苯甲酸。

在本發(fā)明的一方面，按照本發(fā)明要?；囊雀哐撬貥与氖荊LP-1肽。在另一個方面，GLP-1肽選自∶

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)酰胺，

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，

[去氨基His7,Arg34]GLP-1-(7-37)，

[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，

[去氨基His7,Glu22Arg26,Arg 34,Phe(m-CF3)28]GLP-1-(7-37)酰胺，

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys，

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys，

[去氨基His7,Arg26,Arg34,]GLP-1-(7-37)-Lys，

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，

[去氨基His7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，

[去氨基His7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，

[Aib8,Lys20,Arg26,Glu30,Thr(O-benzyl)33,]GLP-1-(7-37)酰胺，

[Aib8,Glu22,Arg26,Lys30]GLP-1-(7-37),[Aib8,Glu22,Arg26,Lys 31]GLP-1-(7-37)，

[Aib8,Lys20,Arg26,2-萘丙氨酸28,Glu30,]GLP-1(7-37)酰胺，

[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,]GLP-1-(7-37)-Lys，

[Aib8,Lys20,Arg 26,2-萘丙氨酸12,Glu30,]GLP-1-(7-37)酰胺，

[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31,Arg34]GLP-1-(7-37)，

[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)，

[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-酰胺，

[Aib8,Lys18,Arg26,Arg34]GLP-1(7-37)，

[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，

[Aib8,Lys 26]GLP-1(7-37)酰胺，

[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-34)，

[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-35)，

[Aib8,Lys33,Arg34]GLP-1-(7-34)，

[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-36)酰胺，

[Aib8,Lys26,Arg34]GLP-1-(7-36)酰胺，

[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys，

[Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)酰胺，

[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，

[去氨基His7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，

[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)Lys，

[Aib8,Aib35]GLP-1-(7-37)，

Arg34GLP-1-(7-37)，

[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-((7-37)Lys，和

[Aib8,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)。

在一方面，?；囊雀哐撬貥与氖抢帽景l(fā)明方法獲得的。在另一個方面，利用本發(fā)明方法獲得的酰化的胰高血糖素樣肽是?；腉LP-1肽。在又一個方面，?；腉LP-1肽選自∶

N-ε26-[2-(2-(2-(2-[2-(2-[4-(15-羧基十五酰氨基)-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基]乙酰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-乙?；鵠[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，

N-ε26-[2-(2-(2-(2-[2-(2-[4-(16-羧基十六酰氨基)-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；?氨基)乙氧基)乙氧基)-乙?；鵠[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，

N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七酰氨基)-4(S)-羧基丁?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)-乙?；鵠[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，

N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(18-羧基十八酰氨基)-4(S)-羧基丁?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)-乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，

N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(19-羧基十九酰氨基)-4(S)-羧基丁?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)-乙?；鵠[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，

N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(20-羧基二十酰氨基)-4(S)-羧基丁?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)-乙?；鵠[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，

N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(20-羧基二十一酰(-carboxuneeicosanoyl)氨基)-4(S)-羧基丁?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)-乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，

N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七酰氨基)-4(R)-羧基丁?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)-乙?；鵠[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，

N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七酰氨基)-4(S)-羧基丙氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)-乙?；鵠[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽，

N-ε37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十六酰氨基)-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[去氨基His7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37](GLP-1-(7-37)酰胺，

N-ε37-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十六酰氨基)-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys 37](GLP-1-(7-37)酰胺，

N-ε37-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)酰胺，

N-ε36-(2-(2-(2-((2-[2-(2-(17-羧基十七酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Lys36]GLP-1-(7-37)Glu-酰胺，

N-ε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，和

N-ε31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙?；鵠[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31]GLP-1-(7-37)。

N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七酰-氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙?；被鵠乙氧基}乙氧基)-乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽GLP-1-(7-37)肽，

N-ε26-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙?；鵠Aib8,Arg34]GLP-1(7-37)肽。

本發(fā)明還尤其適于胰島素和其類似物的?；?。

在本發(fā)明的一方面，按照本發(fā)明要?；囊葝u素是人胰島素或人胰島素類似物。按照本發(fā)明的人胰島素類似物是這樣的人胰島素，與人胰島素相比，其中一個或多個氨基酸已經(jīng)被其它氨基酸殘基替代，被插入，被從胰島素中刪除和/或被添加。在一方面，相對于人胰島素的氨基酸序列，1和5個、1和4個、1和3個或1和2個之間的氨基酸已經(jīng)被替代、插入、刪除和/或添加。

按照本發(fā)明的胰島素類似物的例子是這種胰島素類似物：其中B鏈的28位中的Pro具有Asp、Lys、Leu、Val或Ala突變，和/或，在B29位的Lys具有Pro、Glu或Asp突變。此外，B3位的Asn可以具有Thr、Lys、Gln、Glu或Asp突變。A21位的氨基酸殘基可以具有Gly突變。B1位的氨基酸可以具有Glu突變。B16位的氨基酸可以具有Glu或His突變。胰島素類似物的進(jìn)一步例子是：缺失性類似物，例如人胰島素中的B30氨基酸缺失的類似物(des(B30)人胰島素)，人胰島素中的B1氨基酸缺失的胰島素類似物(des(B1)人胰島素)，des(B28-B30)人胰島素和des(B27)人胰島素。其中A鏈和/或B鏈具有N端延長的胰島素類似物和其中A鏈和/或B鏈具有C端延長的胰島素類似物，例如，兩個精氨酸殘基加到B鏈的C端，也是胰島素類似物的例子。進(jìn)一步實(shí)例是包含所提及突變的組合的胰島素類似物。胰島素類似物，其中在A14位的氨基酸是Asn、Gln、Glu、Arg、Asp、Gly和His，在B25位的氨基酸是His，并且其任選進(jìn)一步包含一個或多個額外的突變，是胰島素類似物的進(jìn)一步的例子。人胰島素的胰島素類似物，其中在A21位的氨基酸殘基是Gly，且其中該胰島素類似物在C端進(jìn)一步用兩個精氨酸殘基延長，也是胰島素類似物的例子。

在一方面，胰島素選自下面一組∶

人胰島素，

DesB30人胰島素，

AspB28人胰島素，

AspB28,desB30人胰島素，

LysB3,GluB29人胰島素，

LysB28,ProB29人胰島素，

GlyA21,ArgB31,ArgB32人胰島素，

GluA14,HisB25人胰島素，

HisA14,HisB25人胰島素，

GluA14,HisB25,desB30人胰島素，

HisA14,HisB25,desB30人胰島素，

GluA14,HisB25,desB27,desB28,desB29,desB30人胰島素，

GluA14,HisB25,GluB27,desB30人胰島素，

GluA14,HisB16,HisB25,desB30人胰島素，

HisA14,HisB16,HisB25,desB30人胰島素，

HisA8,GluA14,HisB25,GluB27,desB30人胰島素，

GluA14,HisB25,desB27,desB30人胰島素，

GluA14,GlyA21,HisB25,desB30人胰島素，

GluA14,HisB25,LysB27,desB28,desB29,desB30人胰島素，

HisA8,GluA14,GluB1,GluB16,HisB25,GluB27,desB30人胰島素，和

HisA8,GluA14,GluB16,HisB25,desB30人胰島素。

在一方面，酰化的胰島素肽是利用本發(fā)明方法獲得的。在另一個方面，利用本發(fā)明方法獲得的?；囊葝u素肽選自下面一組∶

A14E,B25H,B29K(N^ε十八烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙?；被鶀乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB30人胰島素(替代名稱∶A14E,B25H,B29K(N^ε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG)，desB30人胰島素)，

A14E,B16H,B25H,B29K(N^ε二十烷二?；?gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙?；被鶀乙氧基)乙氧基]乙?；?)，desB30人胰島素(替代名稱∶A14E,B16H,B25H,B29K(N^ε二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG)，desB30人胰島素)，

A14E,B25H,B29K((N^ε二十烷二?；?gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB27,desB30人胰島素(替代名稱∶A14E,B25H,B29K(N^ε二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB27,desB30人胰島素)，

A14E,B25H,B27K(N^ε十八烷二?；?gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙?；?)，desB28,desB29,desB30人胰島素(替代名稱∶A14E,B25H,B27K(N^ε十八烷二?；?gGlu-OEG-OEG),desB28,desB29,desB30人胰島素)，

A14E,B25H,B27E,B29K(N^ε二十烷二?；?gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙?；被鶀乙氧基)乙氧基]乙?；?)，desB30人胰島素(替代名稱∶A14E,B25H,B27E,B29K(N^ε二十烷二?；?gGlu-OEG-OEG),desB30人胰島素)，

A14E,B25H,desB27,B29K(N^ε十八烷二?；?gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙?；?)，desB30人胰島素(替代名稱∶A14E,B25H,desB27,B29K(N^ε十八烷二?；?gGlu-OEG-OEG),desB30人胰島素)，

A14E,B25H,B29K((N^ε二十烷二?；?gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB30人胰島素(替代名稱∶A14E,B25H,B29K((N^ε二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG),desB30人胰島素)，

A14E,B16H,B25H,B29K(N^ε十八烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙?；被鶀乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB30人胰島素(替代名稱∶A14E,B16H,B25H,B29K(N^ε十八烷二?；?gGlu-OEG-OEG),desB30人胰島素)，和

A14E,A21G,B25H,B29K(N^ε十八烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙?；?)，desB30人胰島素(替代名稱∶A14E,A21G,B25H,B29K(N^ε十八烷二?；?gGlu-OEG-OEG),desB30人胰島素)。

肽和蛋白的制備方法在本領(lǐng)域?yàn)榇蠹宜熘?。肽或蛋白可以例如通過傳統(tǒng)的肽合成方法制備，例如，使用t-Boc或Fmoc化學(xué)過程或其它沿用已久的技術(shù)的固相肽合成，參見例如Greene and Wuts,“Protective Groups in Organic Synthesis”,John Wiley&Sons,1999,“Organic Synthesis on solid Phase”,Florencio Zaragoza Wiley-VCH Verlag GmbH,D-69469Weinheim,2000,“Novabiochem Catalog”,Merck Biosciences 2006/2007和“FmocSolid Phase Peptide Synthesis”,Edited by W.C.Chan and P.D.White,Oxford University Press,2000,ISBN 0-19-963724-5。肽或蛋白也可以利用下列方法制備：包括，在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在能夠使肽或蛋白進(jìn)行表達(dá)的條件下，將包含編碼肽或蛋白并且能夠表達(dá)肽或蛋白的DNA序列的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。對于包含非天然氨基酸殘基的肽或蛋白，應(yīng)該修飾重組細(xì)胞，這樣就可以使非天然的氨基酸結(jié)合進(jìn)該肽或蛋白中，例如，通過使用tRNA突變體。

下面是本發(fā)明所進(jìn)一步包括的方面的非限制性列表∶

1.選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性的親核官能團(tuán)，該方法包括∶

a)在水介質(zhì)中，使具有至少兩個反應(yīng)性親核官能團(tuán)的肽或蛋白與通式I的?；瘎┓磻?yīng)

其中

n是1-6

m是1-2

w是4-20

R1是離去基團(tuán)，當(dāng)所述酰化劑與游離胺反應(yīng)時，其可以促進(jìn)在R1連接的羰基和所述胺之間形成酰胺鍵。

其中水介質(zhì)的pH值在pH8至pH14之間；和

b)分離N-?；碾幕虻鞍?，

其中，獲得N-?；碾幕虻鞍祝浒辽僖粋€沒有被?；騼H僅被部分酰化的反應(yīng)性親核官能團(tuán)。

2.按照方面1的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中所述反應(yīng)性親核官能團(tuán)選自∶羥基，硫醇基和氨基。

3.按照方面1或2的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中所述反應(yīng)性親核官能團(tuán)是氨基。

4.按照方面1-3的任一項(xiàng)的選擇性?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中獲得N-酰化的肽或蛋白，其中?；饔冒l(fā)生在賴氨酸的ε-位，并且肽或蛋白的至少一個游離氨基沒有被?；?/p>

5.按照方面1-4的任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中式I中的R1與R1相連接的羰基一起表示酯。

6.按照方面1-4的任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中式I中的R1與R1相連接的羰基一起表示活化的酯。

7.按照方面1-4的任一項(xiàng)的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中式I中的R1與R1相連接的羰基一起表示活化的N-羥基酰亞胺酯。

8.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中n是1-5，或者1-2、1-3或1-4，或者2。

9.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中m是1-2，或者2。

10.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中w是4-20，或者10-20，或者14-18，或者14，或者16，或者18。

11.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中含水的反應(yīng)混合物的pH值在pH9和pH13之間。

12.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中含水的反應(yīng)混合物的pH值在pH10和pH12之間。

13.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中含水的反應(yīng)混合物的pH值在pH10.5和pH11.5之間。

14.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中含水的反應(yīng)混合物的pH值在pH11和pH12之間。

15.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中含水的反應(yīng)混合物的pH值在pH11.5和pH12之間。

16.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中含水的反應(yīng)混合物的pH值大約為pH11.5。

17.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中含水的反應(yīng)混合物的pH值在pH11和pH12之間，例如，在pH11.0和11.5之間，或在pH11.0和11.3之間。

18.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中含水的反應(yīng)混合物的pH值大約為pH11.3。

19.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中在酰化過程期間的反應(yīng)混合物的溫度在-5℃和50℃之間，例如在0℃和50℃之間。

20.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中在?；^程期間的反應(yīng)混合物的溫度在10℃和30℃之間，例如，大約20℃或室溫。

21.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中在?；^程期間的反應(yīng)混合物的溫度在0℃和5℃之間，例如，在2和5℃之間。

22.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中在攪拌或攪動下、在0分鐘和480分鐘之間的期間內(nèi)將?；噭┘尤氲椒磻?yīng)混合物中。

23.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中在30和60分鐘之間的期間內(nèi)加入所述試劑。

24.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中在加入?；噭┲?，使酰化混合物在0和24小時之間保持反應(yīng)。

25.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中在加入?；噭┲螅⒓赐ㄟ^將pH值調(diào)節(jié)至pH6.5-9.0來終止反應(yīng)，例如，調(diào)節(jié)至例如pH7.5-8.0。

26.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中在加入酰化試劑之后，使酰化混合物在30和60分鐘之間保持反應(yīng)。

27.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中肽或蛋白以至少5.0mg/ml的濃度存在于反應(yīng)混合物中。

28.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中肽或蛋白的濃度在10.0mg/ml和20.0mg/ml之間。

29.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中肽或蛋白的濃度是大約12.5mg/ml。

30.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中肽或蛋白的濃度是大約20mg/ml。

31.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中反應(yīng)混合物包含緩沖液。

32.按照方面31的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中反應(yīng)混合物包含選自下列的緩沖液：磷酸鹽緩沖液，碳酸鈉緩沖液，Bicine緩沖液(N,N-二(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液)，HEPPS緩沖液(3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸緩沖液)，HEPES緩沖液(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸緩沖液)，MOPS緩沖液(3-(N-嗎啉基)丙磺酸緩沖液)或TEA緩沖液(三乙胺緩沖液)。

33.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中反應(yīng)混合物包含緩沖液，其是磷酸鹽緩沖液。

34.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中以固體形式將酰化試劑加入到溶液中。

35.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中以溶液形式加入?；噭撊芤喊芙庠诙栊匀軇┲械孽；噭?。

36.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中惰性溶劑選自N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺和乙腈。

37.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中以10mg/ml和250mg/ml之間的濃度將?；噭┘尤氲椒磻?yīng)混合物中。

38.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中步驟(a)的反應(yīng)是使用1:1至1:5摩爾比的蛋白和式I的?；瘎﹣磉M(jìn)行的。

39.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中將肽或蛋白預(yù)先溶解在-10至30℃的水溶液中，并使用堿金屬氫氧化物、堿金屬碳酸鹽或叔胺堿將pH值調(diào)節(jié)至目標(biāo)水平，而后加入酰化劑。

40.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中要被?；碾幕虻鞍资沁m合于治療糖尿病的肽或蛋白。

41.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中要被?；碾幕虻鞍资沁m合于治療肥胖癥的肽或蛋白。

42.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中要被?；碾幕虻鞍资且雀哐撬貥与幕蛞葝u素。

43.按照方面42的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中要被?；碾幕虻鞍资且雀哐撬貥与?。

44.按照方面43的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中胰高血糖素樣肽是二肽基氨肽酶IV保護(hù)的胰高血糖素樣肽。

45.按照方面43或44的任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中胰高血糖素樣肽選自胰高血糖素肽，GLP-1肽，GLP-2肽，exendin-3肽和exendin-4肽。

46.按照方面45的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中胰高血糖素樣肽是GLP-1肽。

47.按照方面46的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中GLP-1肽選自∶

GLP-1(7-37),GLP-1(7-36)酰胺，Gly8-GLP-1(7-37)，Val8-GLP-1(7-36)-酰胺和[Val8Asp22]-GLP-1(7-37)，

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)酰胺，

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，

[去氨基His7,Arg34]GLP-1-(7-37),[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，

[去氨基His7,Glu22Arg26,Arg 34,Phe(m-CF3)28]GLP-1-(7-37)酰胺，

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys，

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys，

[去氨基His7,Arg26,Arg34,]GLP-1-(7-37)-Lys，

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，

[去氨基His7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，

[去氨基His7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)，[Aib8,Lys20,Arg26,Glu30,Thr(O-芐基)33,]GLP-1-(7-37)酰胺，[Aib8,Glu22,Arg26,Lys30]GLP-1-(7-37)，[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31]GLP-1-(7-37)，[Aib8,Lys20,Arg26,2-萘丙氨酸28,Glu30,]GLP-1(7-37)酰胺，[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,]GLP-1-(7-37)-Lys，[Aib8,Lys20,Arg 26,2-萘丙氨酸12,Glu30,]GLP-1-(7-37)酰胺，[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31,Arg34]GLP-1-(7-37)，[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)，[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-酰胺，[Aib8,Lys18,Arg26,Arg34]GLP-1(7-37)，[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，[Aib8,Lys 26]GLP-1(7-37)酰胺，[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-34)，[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-35)，[Aib8,Lys33,Arg34]GLP-1-(7-34)，[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-36)酰胺，[Aib8,Lys26,Arg34]GLP-1-(7-36)酰胺，[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys，[Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)酰胺，[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，

[去氨基His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，

[去氨基His7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)酰胺，[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)Lys，[Aib8,Aib35]GLP-1-(7-37)，Arg34GLP-1-(7-37)，[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-((7-37)Lys和[Aib8,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)。

48.按照方面42的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中要被?；碾幕虻鞍资且葝u素。

49.按照方面48的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中胰島素是人胰島素或人胰島素類似物，其中人胰島素類似物是這樣的人胰島素：與人胰島素相比，1和5個之間的氨基酸已經(jīng)被其它氨基酸殘基替代、被插入、從胰島素上刪除和/或被添加。

50.按照方面49的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中胰島素選自∶

人胰島素,DesB30人胰島素，AspB28人胰島素，AspB28,desB30人胰島素，LysB3,GluB29人胰島素，LysB28,ProB29人胰島素，GlyA21,ArgB31,ArgB32人胰島素，GluA14,HisB25人胰島素，HisA14,HisB25人胰島素，GluA14,HisB25,desB30人胰島素，HisA14,HisB25,desB30人胰島素，GluA14,HisB25,desB27,desB28,desB29,desB30人胰島素，GluA14,HisB25,GluB27,desB30人胰島素，GluA14,HisB16,HisB25,desB30人胰島素，HisA14,HisB16,HisB25,desB30人胰島素，HisA8,GluA14,HisB25,GluB27,desB30人胰島素，HisA8,GluA14,GluB1,GluB16,HisB25,GluB27,desB30人胰島素，和HisA8,GluA14,GluB16,HisB25,desB30人胰島素。

51.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地酰化肽或蛋白中的一個氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有兩個或多個反應(yīng)性親核官能團(tuán)，其中獲得N-?；碾幕虻鞍?，其包含至少一個沒有被酰化的游離氨基。

52.按照前述方面任一項(xiàng)的選擇性地?；幕虻鞍字械囊粋€氨基的方法，其中要被?；碾幕虻鞍拙哂袃蓚€游離氨基，并且僅僅一個氨基被?；?/p>

實(shí)施例

實(shí)施例1∶1,18-十八烷二酸單芐基酯的制備

將1,18-十八烷二酸(75g，0.24mol)、對甲苯磺酸一水合物(2.27g，11.9mmol)和苯甲醇(20.7g，0.19mol)的甲苯(2.75L)溶液回流加熱3小時。在回流期間，通過共沸蒸餾除去水。加入硅藻土(25g)，并將混合物冷卻至40℃，額外攪拌1小時。通過硅膠塞過濾來純化混合物，使用甲苯作為流動相。收集包含1,18-十八烷二酸一芐基酯的餾份，并在75℃真空蒸餾，以減少體積。將溶液冷卻至50℃，加入庚烷，并將混合物冷卻至35℃。一旦結(jié)晶，用15分鐘時間額外加入庚烷，并最終將混合物冷卻至10℃，額外保持1小時。過濾收集產(chǎn)物，用庚烷洗滌，真空干燥。1,18-十八烷二酸一芐基酯的產(chǎn)率是34g(35％)。

實(shí)施例2∶18-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-18-氧代十八烷酸芐基酯的制備

將1,18-十八烷二酸一芐基酯(120g，0.3mol)、N-羥基琥珀酰亞胺(41g，0.36mol)和N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(74g，0.36mol)溶解在NMP(1200mL)中，并加熱到60℃，保持2.5小時。將反應(yīng)混合物冷卻至25℃，過濾除去沉淀，并用水(4.7L)洗滌。用2-丙醇(1250mL)將粗品沉淀重結(jié)晶，得到18-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-18-氧代十八烷酸芐基酯。產(chǎn)率138g(92％)。

實(shí)施例3∶18-({(1S)-1-[(芐氧基)羰基]-4-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-4-氧代丁基}氨基)-18-氧代十八烷酸芐基酯的制備

將18-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-18-氧代十八烷酸芐基酯(30g，60mmol)和L-谷氨酸α-芐基酯(15g，62.8mmol)溶解在NMP中，并在50℃加熱4小時。在25℃，加入水(700ml)、KHSO₄(100ml，0.5M水溶液)和乙酸乙酯(220ml)。用KHSO₄(水溶液，150ml，0.17M)洗滌有機(jī)相兩次，真空蒸發(fā)。將該混合物再溶解在NMP(225ml)中，加入N-羥基琥珀酰亞胺(11g，95.7mmol)和N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(16g，77.7mmol)，并將溶液攪拌16小時。過濾除去沉淀，并用水(1L)洗滌。用2-丙醇將粗品沉淀重結(jié)晶，得到18-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-18-氧代十八烷酸芐基酯。產(chǎn)率32.7g(76％)。

實(shí)施例4∶(22S)-22-羧基-1-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1,10,19,24-四氧代-3,6,12,15-四氧雜-9,18,23-三氮雜四十一烷-41-酸(化合物1)的制備

將18-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-18-氧代十八烷酸芐基酯(100g，138.7mmol)和17-氨基-10-氧代-3,6,12,15-四氧雜-9-氮雜十七烷-1-酸(44.9g，145.6mmol)懸浮在乙腈(1L)中。加入三乙胺(20.8ml，150mmol)，并將混合物攪拌16小時。加入水(3L)、KHSO₄(0.5M水溶液，1L)和乙酸乙酯(1L)。真空蒸發(fā)有機(jī)相，并與甲苯(2x300ml)共同蒸發(fā)兩次。加入N-羥基琥珀酰亞胺(17.6g，153mmol)、1-乙基-3-(3'-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(31.9g，166.5mmol)和2-丙醇(1L)，并將溶液攪拌16小時。加入二氯甲烷(1L)、水(3L)和KHSO₄(0.5M水溶液，1L)。收集有機(jī)相，用MgSO₄干燥，過濾，真空蒸發(fā)，并與甲苯(2x300ml)共同蒸發(fā)兩次。加入2-丙醇(1300ml)和Pd/C(14g)，并將混合物氫化2小時。將混合物加熱至39℃，過濾。將溶液冷卻，并過濾收集沉淀。產(chǎn)率100g(87％)。

實(shí)施例5∶分析HPLC

下列HPLC梯度用于分析所獲得的?；a(chǎn)物

緩沖液A∶1800ml Milli-Q水，200ml乙腈和2ml H₃PO₄

緩沖液B∶1800ml乙腈，200ml Milli-Q水和2ml H₃PO₄

柱∶Jupiter 4μProteo 90A kolonne fra Phenomenex。

表5.1給出梯度

表5.1

實(shí)施例6∶用22-羧基-1-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1,10,19,24-四氧代-3,6,12,15-四氧雜-9,18,23-三氮雜四十一烷-41-酸(化合物1)?；痆Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1(7-37)

常規(guī)實(shí)驗(yàn)∶在配備磁性攪拌棒的圓底燒瓶中加入肽中間體[Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1(7-37)肽和MilliQ水，形成具有表6.1所給出的濃度的懸浮液。將該圓底燒瓶浸入裝有水的大容器(2L)中，通過Julabo HL-4加熱循環(huán)器將其調(diào)節(jié)至20度的固定溫度。用2個獨(dú)立的IUPAC標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(pH9.18和12.45)校準(zhǔn)Radiometer PHM290恒pH控制器，并且與Radiometer ABU901自動滴定儀(2ml)(配備NaOH水溶液(0.1M))連接。將電極浸到混合物中(典型地，pH＝2.5)。加入4M NaOH，達(dá)到固定的pH給定值(參見表6.1的pH值詳細(xì)說明)。用1H-NMR(帶有內(nèi)標(biāo))評估?；瘎?化合物1)，而后使用。給注射泵安裝注射器，其中包含10％w/w?；瘎┑腘MP溶液(相對于肽中間體，大約3eq)，并用60分鐘連續(xù)地逐滴加入到肽中間體的溶液中(即，大約1eq?；瘎?20分鐘)。用PHM290控制器將pH值固定到給定值。經(jīng)過合適間隔獲取多個IPC，并用HPLC(260nm，實(shí)施例5)分析，表6.1中給出了％面積。

表6.1

*在20℃測定pH值。

實(shí)施例7∶用22-羧基-1-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1,10,19,24-四氧代-3,6,12,15-四氧雜-9,18,23-三氮雜四十一烷-41-酸(化合物2)酰化[Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1(7-37)

將[Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1(7-37)肽(10.0g，2.94mmol)懸浮在水中，達(dá)到濃度大約15g/L，用NaOH(1M水溶液)將pH值調(diào)節(jié)至11.25，并加入水，使最終肽濃度為大約12.5g/L。將酰化劑22-羧基-1-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1,10,19,24-四氧代-3,6,12,15-四氧雜-9,18,23-三氮雜四十一烷-41-酸(化合物1，3.7g，4.41mmol)溶解在NMP(10％w/v)中，并逐步加入到水溶液中。在反應(yīng)期間，通過連續(xù)加入NaOH(1M水溶液)，使pH值在11.1和11.3之間保持不變。在反應(yīng)期間，取出樣品，并用RP HPLC(按照實(shí)施例5的梯度)分析。加入?；瘎┻^程結(jié)束之后，額外攪拌反應(yīng)混合物60分鐘，而后通過加入硫酸(1M水溶液)將pH值調(diào)節(jié)至大約7.5。HPLC(260nm，實(shí)施例5)，面積％：92.6％，產(chǎn)率(用帶標(biāo)準(zhǔn)品的試驗(yàn)滴定法)：91.5％。

實(shí)施例8∶用22-羧基-1-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1,10,19,24-四氧代-3,6,12,15-四氧雜-9,18,23-三氮雜四十一烷-41-酸(化合物1)?；痆Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1(7-37)

實(shí)驗(yàn)∶向配備磁性攪拌棒的圓底燒瓶中加入肽中間體[Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1(7-37)肽(234mg，0.069mmol)和MilliQ水(18.3ml)，形成懸浮液。用2個獨(dú)立的IUPAC標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(pH9.18和12.45)將pH計(jì)校準(zhǔn)，并浸入到溶液中。加入Et₃N，直到pH10為止。用1H-NMR(帶有內(nèi)標(biāo))評估化合物1，而后使用。給注射泵安裝注射器，其中包含10％w/w?；瘎?化合物1，120mg，0.144mmol)的NMP溶液，并將該溶液連續(xù)地逐滴加入到肽中間體溶液中。在加入期間，使pH值保持在9.8和10.4之間。用AcOH將pH值調(diào)節(jié)至7.2，并用HPLC(260nm)分析，下表給出了％面積。

實(shí)施例9∶1,16-十六烷二酸一芐基酯的制備

將十六烷二酸(20.0g，69.8mmol)和Dowex^R懸浮在正辛烷中，并加熱至回流。加入甲酸芐酯(22.0g，162mmol)。6小時之后，額外加入甲酸芐酯(22.0g，162mmol)。繼續(xù)加熱50小時。在80℃過濾反應(yīng)混合物。將濾液冷卻至20℃，并過濾收集沉淀。將粗品(20.2g)懸浮在二氯甲烷(220ml)中，在20℃保持4小時。過濾懸浮液，并在20-30℃將濾液真空至干燥。用2-丙醇(140ml)將得到的固體(13.9g)重結(jié)晶。

將產(chǎn)物過濾分離，在30-40℃減壓干燥至恒重。產(chǎn)率∶10.2g(39％)白色物質(zhì)。

實(shí)施例10∶(S)-2-(15-芐氧羰基-十五酰氨基)-戊二酸5-芐基酯1-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯的制備

在35-40℃，將1,16-十六烷二酸一芐基酯(20.0g，53.1mmol)溶解在丙酮中。加入N-羥基琥珀酰亞胺(6.42g，55.8mmol)。向得到的溶液中加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(12.1g，58.4mmol)。在35℃，將反應(yīng)混合物攪拌3-4小時。向得到的懸浮液中加入三乙胺(7.40ml，53.1mmol)和L-谷氨酸α-芐基酯(12.6g/53.1mmol)。在35-40℃，將反應(yīng)混合物攪拌8-16小時。將反應(yīng)混合物冷卻至20-25℃。加入甲磺酸(3.45ml，53.1mmol)和DCC(12.1g，53.1mmol)。在20-25℃，將反應(yīng)混合物攪拌8-16小時。過濾反應(yīng)混合物，并將濾液真空干燥。在水(100ml)和甲苯(200ml)之間分配殘余物。通過蒸出水來干燥甲苯相。將硅膠(20g)加入到殘余物中。將懸浮液在20-25℃攪拌30分鐘，隨后過濾。通過減壓蒸發(fā)，將濾液的體積減少到大約100-120ml。在15-30分鐘期間內(nèi)加入正庚烷(150ml)。將得到的懸浮液攪拌2小時。將產(chǎn)物過濾分離，在20-25℃減壓干燥至恒重。產(chǎn)率21g(58％)白色物質(zhì)。

實(shí)施例11∶(22S)-22-羧基-1-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1,10,19,24-四氧代-3,6,12,15-四氧雜-9,18,23-三氮雜三十九烷-39-酸(化合物2)的制備

將(S)-2-(15-芐氧羰基-十五酰氨基)-戊二酸5-芐基酯1-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(4g，5.77mmol)和17-氨基-10-氧代-3,6,12,15-四氧雜-9-氮雜十七烷-1-酸(1.8g，5.95mmol)懸浮在NMP(20ml)中，并將該混合物攪拌16小時。加入N-羥基琥珀酰亞胺(0.94g，8.12mmol)和N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(2.15，10mmol)，并將得到的溶液攪拌大約16小時。加入水(150ml)和乙酸乙酯(30ml)，收集有機(jī)相，用MgSO₄干燥，真空蒸發(fā)。將該半固體再溶解在丙酮中，加入Pd/C(0.5g)，并將該混合物氫化2小時。過濾該混合物，并真空蒸發(fā)。產(chǎn)率3.69g(88％)。

實(shí)施例12∶用化合物2選擇性地?；痆Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1(7-37)

如實(shí)施例6所述，按照常規(guī)?；椒ㄖ兴枋龅姆椒ㄟM(jìn)行?；?。

使用的條件是∶

實(shí)施例13∶酰化劑化合物3-5的固相合成。

使用下述步驟，在固相上合成化合物3-5∶

加載∶在配備中心機(jī)械teflon涂層的攪拌器的固相肽反應(yīng)器中，將2-氯三苯甲基氯樹脂在DCM中溶脹。加入Fmoc-8-氨基-3,6-二烷酸(1eq)和DIPEA(1.1eq)的DCM溶液，并將得到的混合物在室溫?cái)嚢?6小時。排出樹脂，用DCM:MeOH:DIPEA(80:15:5)的混合物封蓋樹脂上未反應(yīng)的位點(diǎn)，并隨后用DCM和NMP洗滌。

伸長∶

1)脫保護(hù)過程∶將樹脂上的Fmoc-基團(tuán)脫保護(hù)；用哌啶/NMP(20％溶液)處理樹脂，并用NMP洗滌。

2)隨后的偶合過程∶將氨基酸或18-({(1S)-1-[(芐氧基)羰基]-4-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-4-氧代丁基}氨基)-18-氧代十八烷酸芐基酯(2eq，與原始樹脂載量相比)溶解在NMP中。用N-羥基苯并三唑(HOBt)和N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIPCDI)將氨基酸預(yù)活化15-30分鐘，或?qū)被岬溺牾啺孵セ?8-({(1S)-1-[(芐氧基)羰基]-4-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-4-氧代丁基}氨基)-18-氧代十八烷酸芐基酯溶解在NMP中，而后加入到樹脂中。任選，30至60分鐘之后，加入DIPEA，并在室溫下將該混合物攪拌1小時至16小時之間。如果游離胺的試驗(yàn)是陰性(Kaiser試驗(yàn))，偶合循環(huán)完成，用NMP洗滌樹脂，并準(zhǔn)備移到連續(xù)的循環(huán)步驟中。

裂解過程∶用DCM:MeOH(1:1)、DCM洗滌樹脂，并用DCM:TIPS:TFA(95.5:2.5:2)的混合物處理10分鐘，將裂解混合物排到DIPEA中，獲得pH>7的溶液。重復(fù)該裂解處理。用枸櫞酸(10％水溶液，3X)、鹽水(1X)洗滌粗品溶液，用MgSO₄干燥，真空蒸發(fā)。將油狀殘余物與甲苯共同蒸發(fā)兩次。

活化∶將得到的殘余物和N-羥基琥珀酰亞胺(1.1eq)溶解在EtOAc中。加入N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(1.3eq)，并將混合物攪拌大約16小時。過濾該混合物，并真空蒸發(fā)。

叔丁基酯的脫保護(hù)∶將半固體溶解在TFA和DCM中，攪拌2小時，隨后真空蒸發(fā)，并與甲苯共同蒸發(fā)兩次，而后用2-丙醇重結(jié)晶。

芐基酯的脫保護(hù)∶將半固體溶解在2-丙醇中，加入Pd/C，并將得到的混合物氫化2小時，加熱到45℃，過濾，冷卻至5℃。過濾收集得到的晶體。

實(shí)施例14∶化合物3的制備∶19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲?；?十九烷酸

按照實(shí)施例13所描述的一般方法，在固相上制備該化合物，使用1,20-二十烷二酸一叔丁基酯、N-(9-芴甲氧羰基)-L-谷胺酸α-叔丁基酯和8-(9-芴甲氧羰基-氨基)-3,6-二氧雜辛酸。

實(shí)施例15∶用化合物3選擇性地?；痆Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1(7-37)肽

如實(shí)施例6所述，按照常規(guī)酰化方法中所描述的方法進(jìn)行?；?。

使用的條件是∶

實(shí)施例16∶制備化合物4：17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-丙基氨基甲?；?-十七酸

按照實(shí)施例13所描述的一般方法，在固體載體上制備該化合物，使用18-({(1S)-1-[(芐氧基)羰基]-4-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-4-氧代丁基}氨基)-18-氧代十八烷酸芐基酯和8-(9-芴甲氧羰基-氨基)-3,6-二氧雜辛酸。

實(shí)施例17∶用化合物4選擇性地?；痆Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1(7-37)肽

如實(shí)施例6所述，按照常規(guī)酰化方法中所描述的方法進(jìn)行?；?。

使用的條件是∶

實(shí)施例18∶制備化合物5：17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲?；鶀-甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲?；鶀-甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲?；鶀-丙基氨基甲酰基)-十七烷酸

按照實(shí)施例13所描述的一般方法，在固體載體上制備該化合物，使用18-({(1S)-1-[(芐氧基)羰基]-4-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-4-氧代丁基}氨基)-18-氧代十八烷酸芐基酯和8-(9-芴甲氧羰基-氨基)-3,6-二氧雜辛酸。

實(shí)施例19∶用化合物5選擇性地酰化[Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1(7-37)肽

如實(shí)施例6所述，按照常規(guī)酰化方法中所描述的方法進(jìn)行?；?。

使用的條件是∶

實(shí)施例20∶化合物6的制備

如實(shí)施例14所述，制備該化合物。

實(shí)施例21∶用化合物6選擇性地?；痆Aib⁸，Arg³⁴]GLP-1(7-37)

如實(shí)施例6所述，按照常規(guī)酰化方法中所描述的方法進(jìn)行?；?。

使用的條件是∶

實(shí)施例22∶(S)-2-(15-羧基-十五酰氨基)-戊二酸5-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯的制備

將(S)-2-(15-芐氧羰基-十五酰氨基)-戊二酸5-芐基酯1-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(5.0g，7.3mmol)溶解在包含三氟乙酸(95μl)的丙酮(95ml)中。加入10％鈀/碳(0.50g)。在攪拌下，在30-35℃，加入氫氣。當(dāng)氫的消耗終止時，過濾反應(yīng)混合物。將濾液冷卻至20℃，在15-30分鐘期間內(nèi)加入正庚烷(140ml)。將得到的懸浮液冷卻至0-5℃，保持2-3小時。將產(chǎn)物過濾分離，在20-25℃減壓干燥至恒重。產(chǎn)率3g(84％)白色物質(zhì)。

通過質(zhì)子NMR(Bruker 600MHz)分析產(chǎn)物，使用丙酮-d6作為溶劑。

用1D光譜進(jìn)行質(zhì)子NMR歸屬(內(nèi)標(biāo)是TMS，在δ0.0ppm)∶

實(shí)施例23∶用(S)-2-(15-羧基十五酰氨基)戊二酸5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯?；艘葝u素的B29位賴氨酸中的desB30ε-氨基

將4g的desB30人胰島素懸浮在64g凈化水中。加入1.85ml三乙基胺(TEA)，以便溶解desB30人胰島素，并將pH值提高至11.4-12.0。將溶液冷卻至2-5℃。

將448mg的l-2-(15-羧基-十五酰氨基)-戊二酸5-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯溶解在用10μl 5％硫酸穩(wěn)定的3.5g NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)中。

將desB30人胰島素溶液攪拌，并用20分鐘時間加入(S)-2-(15-羧基-十五酰氨基)戊二酸5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯溶液，同時保持低溫。

加入(S)-2-(15-羧基-十五酰氨基)戊二酸5-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯之后，用2.5重量的由下列組成的溶液稀釋反應(yīng)混合物∶三-羥甲基氨基甲烷(20mmol/kg)，乙酸銨(30mmol/kg)，乙醇42.5％w/w，其余的為凈化水，pH7.5。

稀釋之后，通過慢慢地加入1M乙酸將pH值調(diào)節(jié)至7.5，同時攪拌。

HPLC分析證明，形成72.11％Lys^B29(Nε-十六烷二?；?γ-谷氨酰)des(B30)人胰島素，14.22％殘余物為desB30人胰島素。

實(shí)施例24∶用15-[3-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基)-丙基氨基甲?；鵠十五酸?；艘葝u素B29位賴氨酸中的desB30ε-氨基

將35g的desB30人胰島素懸浮在539g冷卻的14mM EDTA中。將該溶液冷卻至2-5℃。加入15.6g 4M NaOH和21.9g三乙基胺(TEA)，以便溶解desB30人胰島素，并將pH值提高至12.7。

將4.1g的15-[3-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基)-丙基氨基甲?；鵠十五酸溶解在用10μl 5％硫酸穩(wěn)定的82.1g NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)中。

將該desB30人胰島素溶液攪拌，并用20分鐘時間加入15-[3-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基)-丙基氨基甲?；鵠十五酸溶液，同時保持低溫。

加入15-(3-羧基丙基氨基甲?；?十五酸芐基酯之后，用2.5重量的由下列組成的溶液稀釋反應(yīng)混合物∶三-羥甲基氨基甲烷(20mmol/kg)，乙酸銨(30mmol/kg)，乙醇42.5％w/w，其余的為凈化水，pH7.0。

稀釋之后，通過慢慢地加入1M乙酸將pH值調(diào)節(jié)至7.6，同時攪拌，并使溫度升高至室溫。

HPLC分析證明，形成68.1％Lys^B29(Nε-十六烷二?；?γ-谷氨酰)des(B30)人胰島素。

實(shí)施例25∶分析HPLC

將150X 4.6mm I.D.柱填充辛基二甲基甲硅烷基取代的硅膠(具有大約的孔徑，大約3.5μm的粒徑)，并在40℃、用由下列組成的混合物平衡(流速1ml/min)：1)20mMNaH₂PO₄.H₂O和100mmol Na₂SO₄的緩沖液，用NaOH調(diào)節(jié)至pH5.9(在緩沖水溶液中)，和2)包含42.8％w/w乙腈的乙腈溶劑，以便產(chǎn)生25％(w/w)乙腈。

當(dāng)分析時，大約20分鐘之后，Lys^B29(Nε-十六烷二酰基-γ-谷氨酰)des(B30)人胰島素從柱中排出。當(dāng)分析時，大約6分鐘之后，desB30人胰島素從柱中排出。

實(shí)施例26∶液相方法制備19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲?；?十九烷酸(替代名稱∶二十烷二?；?gGlu-OEG-OEG-OSu)。

LCMS方法(LCMS)∶

從Waters Alliance HT HPLC系統(tǒng)中洗脫之后，用Waters Micromass ZQ質(zhì)譜儀鑒定樣品的質(zhì)譜。

洗脫液∶

A：0.1％三氟乙酸，在水中

B：0.1％三氟乙酸，在乙腈中

柱∶Phenomenex,Jupiter C450X 4.60mm,id:5μm

梯度∶10％-90％B，用7.5min，1.0ml/min

柱∶Phenomenex,Jupiter 5μC450x 4.60mm

LC方法∶10-90％B 10min:A:0.1％CH₃CN B:CH₃CN:

0-7.5min:10-90％B

7.5-8.5min:90-10％B

8.5-9.5min 10％B

流速:1ml/min

9.5-10.00min 10％B

流速:0.1ml/min

二十烷二酸叔丁基酯N-羥基琥珀酰亞胺酯∶

將二十烷二酸單-叔丁基酯(5g，12.54mmol)和TSTU(4.53g，15.05mmol)在THF(50ml)中混合，加入DIPEA(2.62ml)，并將得到的渾濁混合物在室溫?cái)嚢?小時，然后加入DMF(30mL)，產(chǎn)生澄清溶液，將其進(jìn)一步攪拌過夜。將得到的混合物蒸發(fā)幾乎至干，并將殘余物與冷乙腈混合，產(chǎn)生沉淀。將其過濾并真空干燥過夜，得到6.01g(97％)二十烷二酸叔丁基酯N-羥基琥珀酰亞胺酯。

MS(電噴霧)∶m/z:440(M-56(tBu)).

(S)-2-(19-叔丁氧羰基十九酰氨基)戊二酸1-叔丁基酯

將二十烷二酸叔丁基酯2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(6.01g，12.124mmol)溶解在THF(150ml)中，并與H-Glu-OtBu(2.71g，13.33mmol)在DMF/水(1/1，40mL)中的漿液混合。這會產(chǎn)生膠狀的溶液，將其加熱，得到澄清溶液，將其在室溫下攪拌3小時。然后蒸發(fā)該溶液，加入100mL水，并將該混合物加熱至60℃，產(chǎn)生溶液，其冷卻后結(jié)晶。用乙腈將沉淀重結(jié)晶，并將晶體真空干燥。產(chǎn)率6.82g(96％)。

MS((電噴霧)∶m/z 584(M+1).

(S)-2-(19-叔丁氧羰基十九酰氨基)戊二酸1-叔丁基酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯

將(S)-2-(19-叔丁氧羰基十九酰氨基)戊二酸1-叔丁基酯(6.52g，11.17mmol)溶解在THF(100ml)中，加入DIPEA(2.14ml)，而后加入TSTU(3.70g，12.29mmol)的乙腈(25ml)溶液。將該混合物在室溫?cái)嚢柽^夜，然后蒸發(fā)，產(chǎn)生淡褐色的殘余物，將其用乙腈重結(jié)晶。在5℃冷卻過夜后，形成粉末。將其溶解在THF中，用MgSO₄干燥，過濾，蒸干，得到6.17g(81％)標(biāo)題化合物。

MS((電噴霧)∶m/z:681(M+1).

19-{(S)-1-叔丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基乙氧基)乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲?；鶀十九烷酸叔丁基酯(替代名稱∶^tBu-二十烷二?；?gGlu(O^tBu)-OEG-OEG-OH)

向2-(19-叔丁氧羰基十九酰氨基)戊二酸1-叔丁基酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(2.50g)和[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙?；被鶀乙氧基)乙氧基]乙酸(替代名稱∶H-OEG-OEG-OH)(1.47g)的乙醇(40ml)溶液中加入DIPEA(1.26ml)。將該混合物在室溫下攪拌過夜，而后真空濃縮。向殘余物中加入0.1N HCl水溶液(150ml)和乙酸乙酯(200ml)。分離各層，用乙酸乙酯(100ml)提取水層。用水和鹽水洗滌合并的有機(jī)層，干燥(硫酸鎂)，真空濃縮，得到油，其靜置時結(jié)晶。產(chǎn)率96％(3.1g)。LCMS∶理論質(zhì)量∶874.2。實(shí)測值∶874.49。

19-((S)-1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲?；?十九烷酸叔丁基酯(替代名稱∶^tBu-二十烷二酰基-gGlu(O^tBu)-OEG-OEG-OSu)

向19-{(S)-1-叔丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基乙氧基)乙基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲?；鵠丙基氨基甲?；鶀十九烷酸叔丁基酯(3.1g)的乙腈(50ml)溶液中加入TSTU(1.39g)和DIPEA(0.91ml)。將該混合物在室溫下攪拌過夜，而后真空濃縮。向殘余物中加入0.1N HCl水溶液(100ml)和乙酸乙酯(200ml)。分離各層，用乙酸乙酯(50ml)提取水層。用水和鹽水洗滌合并的有機(jī)層，干燥(硫酸鎂)，真空濃縮，得到油。產(chǎn)率99％(3.4g)。

LCMS∶理論質(zhì)量∶971.2，實(shí)測值∶971.8。

19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲?；?十九烷酸(替代名稱∶二十烷二?；?gGlu-OEG-OEG-OSu)

將19-((S)-1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲酰基)十九烷酸叔丁基酯(3.4g)在TFA(75ml)中攪拌45分鐘，而后真空濃縮。將殘余物與甲苯共同濃縮3次，得到固體。將殘余物在2-丙醇中結(jié)晶，過濾，得到白色晶體化合物。產(chǎn)率80％(2.4g)。LCMS∶理論質(zhì)量∶859.03，實(shí)測值∶859.44。

或者，可以如下制備?；噭菏褂霉滔喾椒?，制備中間體19-((S)-1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲?；?十九烷酸叔丁基酯(替代名稱∶tBu-二十烷二?；?gGlu(OtBu)-OEG-OEG-OH)，如WO 2009/022005所述，而后活化為N-羥基琥珀酰亞胺酯，并進(jìn)行TFA裂解(上面最后二個步驟)。

實(shí)施例27∶使用試劑19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲?；?十九烷酸(替代名稱∶二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu)?；疉14E，B25H，desB27，desB30人胰島素A14E，B25H，B29K((N(eps)二十烷二?；?gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙?；被鶀乙氧基)乙氧基]乙酰基))，desB27，desB30人胰島素(替代名稱∶A14E，B25H，B29K(Nε二十烷二?；?gGlu-OEG-OEG)，desB27，desB30人胰島素)的制備

將1g(0.18mmol)A14E，B25H，desB27，desB30人胰島素溶解在碳酸鈉水溶液(100mM，35mL)中。用1N NaOH將pH值從10.29調(diào)節(jié)至10.45。加入溶解在NMP(3.3mL)中的19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲酰基)十九烷酸(替代名稱∶二十烷二?；?gGlu-OEG-OEG-OSu)(190mg，0.22mmol)。將混合物在室溫下攪拌50分鐘。加入水(50mL)，并用1N鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至4.4。離心分離沉淀，將上清液傾析。

沉淀產(chǎn)物的HPLC-MS顯示：26.9％的胰島素沒有變化，61.7％單酰化的目標(biāo)產(chǎn)物(B29-?；?和11％二?；漠a(chǎn)物。使用這種HPLC-MS方法，沒有痕量的A1-單?；漠a(chǎn)物(在B29?；漠a(chǎn)物之前洗脫)∶

隨后將沉淀溶解在包含1％TFA的水和乙腈中，通過RP HPLC純化(柱∶Phenomenex，Gemini，5μ，C18，110A，250x30mm)。收集純餾份，并冷凍干燥。將冷凍干燥粉末溶解在水中，使用0.1N NaOH將pH值調(diào)節(jié)至8.0。冷凍干燥，得到標(biāo)題胰島素。

產(chǎn)物的HPLC-MS顯示：僅僅有單?；哪繕?biāo)產(chǎn)物(B29-?；?，純度100％。

實(shí)施例28∶在pH11.5和室溫下，使用試劑17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲酰基)十七酸(替代名稱∶十八烷酸二?；?gGlu-OEG-OEG-OSu)?；疉14E，B25H，desB30人胰島素

A14E，B25H，B29K((N^ε十八烷二?；?gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙?；?)，desB30人胰島素(替代名稱∶A14E，B25H，B29K(N^ε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG)，desB30人胰島素)的制備

在室溫下，將A14E，B25H，desB30人胰島素溶解在水中，達(dá)到20g/l的濃度。加入固體磷酸鈉，濃度達(dá)到15mM，并用NaOH將pH值調(diào)節(jié)至11.5。將酰化試劑(十八烷二?；?gGlu-OEG-OEG-OSu)溶解在NMP中，達(dá)到0.2g/ml的濃度，并在攪動下逐步加入到胰島素溶液中。在反應(yīng)期間，通過連續(xù)地加入NaOH使pH值保持11.5不變。在反應(yīng)期間，取出樣品，并通過RP-HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果如下表28.1所示。

表28.1∶B29MA和A1MA分別是在B29K位和A1的N端氨基單?；乃儆浄?。同樣，二?；暮偷目s寫是DA。

實(shí)施例29∶在2℃，在pH11.25、11.50和11.75下，使用試劑17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲?；?十七酸(替代名稱∶十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu)?；疉14E，B25H，desB30人胰島素

A14E，B25H，B29K((N^ε十八烷二?；?gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙?；?)，desB30人胰島素(替代名稱∶A14E，B25H，B29K(N^ε十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG)，desB30人胰島素)的制備

在2℃，在3個不同的實(shí)驗(yàn)中，將A14E，B25H，desB30人胰島素溶解在水中，達(dá)到20g/l的濃度，并用NaOH分別將pH值調(diào)節(jié)至11.25、11.50和11.75。將?；噭?十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu)溶解在NMP中，達(dá)到0.2g/ml的濃度，并在攪動下逐步加入到胰島素溶液中。在反應(yīng)期間，通過連續(xù)地加入NaOH使pH值在各自相應(yīng)的pH值下保持不變。在反應(yīng)期間，取出樣品，并通過RP-HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果分別如下表29.1、29.2和29.3所示。

表29.1∶pH11.25?；?/p>

表29.2∶pH11.50酰化

表29.3∶pH11.75?；?/p>

實(shí)施例30∶在pH11.5和室溫下，使用試劑17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲?；?十七酸(替代名稱∶十八烷二?；?gGlu-OEG-OEG-OSu)?；疉14E，B16H，B25H，desB30人胰島素

A14E，B16H，B25H，B29K((N^ε十八烷二酰基-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙?；被鶀乙氧基)乙氧基]乙?；?)，desB30人胰島素(替代名稱∶A14E，B16H，B25H，B29K(N^ε十八烷二?；?gGlu-OEG-OEG)，desB30人胰島素)的制備

在室溫下，將A14E，B16H，B25H，desB30人胰島素溶解在水中，達(dá)到20g/l的濃度。加入固體磷酸鈉和EDTA，分別達(dá)到15mM和4mM的濃度。用NaOH將pH值調(diào)節(jié)至11.5。將?；噭?十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu)溶解在NMP中，達(dá)到0.2g/ml的濃度，并在攪動下逐步加入到胰島素溶液中。在反應(yīng)期間，通過連續(xù)地加入NaOH使pH值保持11.5不變。在反應(yīng)期間，取出樣品，并通過RP-HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果如下表30.1所示。

表30.1∶

實(shí)施例31∶在pH11.5和室溫下，使用試劑19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲?；?十九烷酸(替代名稱∶二十烷二?；?gGlu-OEG-OEG-OSu)?；疉14E，B25H，desB30人胰島素

A14E，B25H，B29K((N^ε二十烷二?；?gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙?；?)，desB30人胰島素(替代名稱∶A14E，B25H，B29K(N^ε二十烷二?；?gGlu-OEG-OEG)，desB30人胰島素)的制備

在室溫下，將A14E，B25H，desB30人胰島素溶解在水中，達(dá)到20g/l的濃度。加入固體磷酸鈉和EDTA，分別達(dá)到15mM和4mM的濃度。用NaOH將pH值調(diào)節(jié)至11.5。將?；噭?二十烷二?；?γGLU-OEG-OEG)溶解在NMP中，達(dá)到0.2g/ml的濃度，并在攪動下逐步加入到胰島素溶液中。在反應(yīng)期間，通過連續(xù)地加入NaOH使pH值保持11.5不變。在反應(yīng)期間，取出樣品，并通過RP-HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果如下表31.1所示。

表31.1∶