本發(fā)明涉及一種牛腸粘膜依諾肝素鈉及其制備方法與應(yīng)用，屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

肝素(Heparin)是一種硫酸化酸性多糖酯類物質(zhì)，由動物結(jié)締組織的肥大細(xì)胞產(chǎn)生分泌，是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的抗凝抗栓藥物。依諾肝素鈉(Enoxaparin Sodium，ES)是一種低分子的肝素鈉鹽，是由大分子肝素經(jīng)解聚而來，是臨床上最為重要的肝素類抗凝劑之一，全球年銷售量超30億美元以上。目前，醫(yī)用肝素的主要來源是豬腸粘膜肝素，牛肝素和羊肝素(包括綿羊肝素和山羊肝素)在某些地區(qū)也有使用。不同來源的天然肝素，其分子結(jié)構(gòu)、二糖組成和理化性質(zhì)均有不同程度的差異，由不同天然肝素制備的低分子肝素，也必然存在相應(yīng)的由種屬帶來的分子結(jié)構(gòu)等的差異。

此外，不同于豬肝素，牛肝素和羊肝素具有清真性，穆斯林國家和地區(qū)對清真藥物有著強(qiáng)烈的需求。清真是穆斯林在中國流行的專用名稱，穆斯林教義對食品和藥品等有著明確的要求，哺乳動物中只允許食用牛、綿羊、山羊等反芻動物產(chǎn)品，禁食豬和狗等不反芻動物產(chǎn)品。全球穆斯林人口2013年突破16億，占全球69億人口的23％。在一些由穆斯林人口占多數(shù)的國家，如印度尼西亞、巴基斯坦、伊朗等等，符合穆斯林教義的清真藥品有著無可比擬的優(yōu)勢。因此，開發(fā)清真的牛、羊依諾肝素鈉，有著極為重要的作用。中國具有豐富的畜產(chǎn)品資源，豬、牛、綿羊、山羊等養(yǎng)殖和屠宰量均位居世界前列，易于制備牛、綿羊、山羊等的腸粘膜或肺依諾肝素鈉。

本發(fā)明人在之前的專利申請(申請公布號：CN 105131153 A)中，詳細(xì)描述了一種羊依諾肝素鈉及其制備方法，同時也提供了牛腸粘膜依諾肝素鈉和牛肺依諾肝素鈉以及他們的制備方法。經(jīng)不同來源肝素制備而得的依諾肝素鈉，都有近似的理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)抗凝活性，但同時又各有獨特的特點。本發(fā)明詳細(xì)介紹了牛腸粘膜依諾肝素鈉及其注射劑，包括其制備方法以及具體的理化、生物學(xué)特性研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種牛腸粘膜依諾肝素鈉，包括牛腸粘膜依諾肝素鈉的制備方法、注射劑及在抗凝抗栓和清真藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的，將通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)：

牛腸粘膜依諾肝素鈉，是以牛的腸粘膜肝素制備得到的。

所述牛腸粘膜依諾肝素鈉的二糖組成，呈現(xiàn)典型的物種、器官來源(牛腸粘膜)和地區(qū)特征，以肝素酶酶解后的SAX-HPLC分析，ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)的含量為15％-32％，具體來自中國內(nèi)地牛源制備的牛腸粘膜依諾肝素鈉為15％-24％，來自于南美的市售巴西牛腸粘膜肝素制備的牛腸粘膜依諾肝素鈉，其ΔⅢS含量為24％-32％，而ΔⅢS在(豬腸粘膜)依諾肝素鈉、羊腸粘膜依諾肝素鈉和牛肺依諾肝素鈉中僅分別是5.8％～7.8％、4.0％～6.0％和4.5％-5.5％。

所述牛腸粘膜依諾肝素鈉的生物學(xué)抗凝活性，參照USP39進(jìn)行分析，抗-Ⅹa活性折干后在90-125單位每毫克之間，抗-Ⅱa活性折干后在10-35單位每毫克之間，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在5-10之間。

以上所述的牛腸粘膜依諾肝素鈉的制備方法，與本發(fā)明人在之前的專利申請(申請公布號：CN 105131153 A)主張的制備方法相同，包括如下步驟：

S1、原料牛腸粘膜肝素的預(yù)處理，是將牛腸粘膜肝素鈉粗品溶解于一定濃度鹽水中配制成溶液，對所述牛腸粘膜肝素溶液進(jìn)行脫色，精過濾，再在室溫下進(jìn)行醇沉精制，收集沉淀物，干燥獲得牛腸粘膜肝素。

S2、牛腸粘膜肝素季銨鹽的制備，是將S1中獲得的牛腸粘膜肝素鈉溶解配制成牛腸粘膜肝素水溶液，并與芐索氯銨水溶液進(jìn)行混合，過濾或離心獲得牛腸粘膜肝素季銨鹽，并進(jìn)行洗滌干燥；

S3、牛腸粘膜肝素芐酯的制備，是將S2中干燥得到的牛腸粘膜肝素季銨鹽與二氯甲烷及氯化芐按重量比例混合酯化，在酯化后的牛腸粘膜肝素季銨鹽中滴加醋酸鈉甲醇溶液，制得牛腸粘膜肝素芐基酯沉淀，將牛腸粘膜肝素芐基酯沉淀進(jìn)行過濾、洗滌、干燥，制得牛腸粘膜肝素芐基酯；

S4、牛腸粘膜依諾肝素鈉成品制得，是將S3中的牛腸粘膜肝素芐基酯進(jìn)行堿解聚、脫色、以酸中和至中性、醇沉淀，精制、干燥，得到牛腸粘膜依諾肝素鈉成品。

進(jìn)一步地，S1中采用質(zhì)量濃度為1％-3％的氯化鈉水溶液溶解牛腸粘膜肝素鈉粗品進(jìn)行脫色、過濾和精制，直至預(yù)處理后牛腸粘膜肝素鈉的水溶液澄清且色度不深于5號標(biāo)準(zhǔn)色；S1中醇沉精制的沉淀劑為甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮中的一種或幾種的組合。

進(jìn)一步地，S2中芐索氯銨與牛腸粘膜肝素鈉的重量比為2-5:1；S3中酯化溫度30-40℃，牛腸粘膜肝素季銨鹽、二氯甲烷、氯化芐的質(zhì)量比為1:3-10:1.1

進(jìn)一步地，S3中牛腸粘膜肝素芐基酯沉淀的洗滌包括如下步驟：

S31、在加入醋酸鈉甲醇溶液的牛腸粘膜肝素季銨鹽溶液中加入甲醇靜置沉降和分離制得牛腸粘膜肝素芐基酯；

S32、在分離后的牛腸粘膜肝素芐基酯中添加8％-12％的氯化鈉水溶液進(jìn)行復(fù)溶，所述氯化鈉水溶液與所述牛腸粘膜肝素季銨鹽重量比為0.5-2:1；

S33、對S32中獲得的溶液以60％-70％的甲醇終濃度進(jìn)行醇沉結(jié)晶；

S34、重復(fù)氯化鈉水溶液復(fù)溶和醇沉結(jié)晶2-5次至牛腸粘膜肝素芐基酯復(fù)溶不渾濁。

進(jìn)一步地，S4中采用氫氧化鈉溶液解聚，解聚溫度在30℃-70℃之間，保溫時間在0.5小時以上；S4中采用雙氧水脫色，室溫或以下加入0.1-1倍牛腸粘膜肝素芐基酯重量的30％雙氧水，氧化脫色10分鐘以上，直至反應(yīng)液顏色淺至Y6與GY6以下。

優(yōu)選地，所述S4中牛腸粘膜依諾肝素鈉成品的檢測，參照USP39中依諾肝素鈉的指標(biāo)進(jìn)行，且除去種源和較低的抗-Ⅱa活力外，其余指標(biāo)均符合USP39的放行指標(biāo)。

優(yōu)選地，所述S4中牛腸粘膜依諾肝素鈉成品的結(jié)構(gòu)分析，采用核磁共振氫譜(¹H-NMR)和核磁共振碳譜(¹³C-NMR)進(jìn)行分析，考察糖鏈上鏈接的碳-氫關(guān)系。所述牛腸粘膜依諾肝素鈉與來自豬腸粘膜的依諾肝素鈉，主體結(jié)構(gòu)一致，但也存在一定的差異，如在δ2.04ppm處的N-乙?；募谆?，數(shù)量積分上牛腸粘膜依諾肝素鈉要更少一些，說明牛腸粘膜依諾肝素糖鏈中N-乙?；揎椣鄬σ?。所述的核磁共振方法，更優(yōu)的方案是采用異核單量子關(guān)系-核磁共振(HSQC-NMR)等更高級的二維核磁分析，以此可以明確判斷一些具體糖鏈結(jié)構(gòu)上的差異。

優(yōu)選地，所述牛腸粘膜依諾肝素鈉，按照如以上所述的制備方法制得。

優(yōu)選地，所述牛腸粘膜依諾肝素鈉在防治與抗凝、抗栓有關(guān)疾病中的應(yīng)用，以及開發(fā)為清真抗凝抗栓藥物。

一種牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑，組分包括以上所述牛腸粘膜依諾肝素鈉和注射用水。

優(yōu)選地，所述牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑的制備方法，是將牛腸粘膜依諾肝素鈉以注射用水溶解，待完全溶解后補(bǔ)注射用水至一定的濃度，無菌過濾，灌裝至注射器、西林瓶或安瓿瓶等。

優(yōu)選地，所述牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑的活性濃度在10000抗-Ⅹa單位每毫升，優(yōu)選制成預(yù)灌封針，規(guī)格為4000抗-Ⅹa單位、6000抗-Ⅹa單位和10000抗-Ⅹa單位以及其他規(guī)格。

優(yōu)選地，所述牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑，在抗凝、抗栓及清真藥物中的應(yīng)用。

一種牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑，組分包括以上所述的牛腸粘膜依諾肝素鈉、注射用水和苯甲醇。

優(yōu)選地，所述牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑的制備方法，是將牛腸粘膜依諾肝素鈉以注射用水溶解，再加入苯甲醇，待完全溶解混勻后補(bǔ)注射用水至一定的濃度，無菌過濾，灌裝至西林瓶等。

優(yōu)選地，所述苯甲醇的濃度在1.35毫克每毫升至1.65毫克每毫升之間。

優(yōu)選地，以上所述牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑的活性濃度在10000抗-Ⅹa單位每毫升，優(yōu)選灌封成西林瓶，規(guī)格為30000抗-Ⅹa單位以及其他規(guī)格。

優(yōu)選地，所述牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑，在抗凝、抗栓及清真藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述牛腸粘膜依諾肝素鈉和牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑的抗凝作用，體內(nèi)試驗優(yōu)選兔進(jìn)行。優(yōu)選皮下注射給藥后，采集給藥前及給藥后各時間點的兔血液，用3.8％枸櫞酸鈉抗凝劑1:9抗凝，上機(jī)檢測對血凝常規(guī)的影響，包括但不限于APTT、TT和PT等，以及其他凝血因子的影響。

優(yōu)選地，所述牛腸粘膜依諾肝素鈉和牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑，在體內(nèi)抗凝試驗，表現(xiàn)出近似或等同于依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的效果。

本發(fā)明突出效果為：提供了一種牛腸粘膜依諾肝素鈉以及它的注射劑，并采用實用、穩(wěn)定的方法制得，除了由種源特征性帶來的分子結(jié)構(gòu)(二糖組成)和抗凝血活性(較小的抗-Ⅱa活性)外，牛腸粘膜依諾肝素鈉均符合其他USP39依諾肝素鈉所列的質(zhì)量放行指標(biāo)。本發(fā)明填補(bǔ)了其他來源肝素在依諾肝素鈉制備上的空白，可開發(fā)為清真藥物。牛腸粘膜肝素鈉，原料簡便易得，質(zhì)量可控，可極大豐富市場中依諾肝素鈉的來源和產(chǎn)量，還可以促進(jìn)牛養(yǎng)殖和屠宰廢料(腸粘膜)的有效利用，經(jīng)濟(jì)潛力巨大。

以下便結(jié)合實施例附圖，對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步的詳述，以使本發(fā)明技術(shù)方案更易于理解、掌握。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例2所述牛腸粘膜依諾肝素鈉與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的分子量分布比較示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例2所述牛腸粘膜依諾肝素鈉的二糖譜及1,6-酐％示意圖。

圖3為本發(fā)明實施例2所述牛腸粘膜依諾肝素鈉的磺酸根和羧酸根比例示意圖。

圖4為本發(fā)明實施例2所述牛腸粘膜依諾肝素鈉與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的¹H-NMR對比示意圖。

圖5為本發(fā)明實施例2所述牛腸粘膜依諾肝素鈉與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的¹³C-NMR比較示意圖。

圖6為本發(fā)明實施例5所述牛腸粘膜依諾肝素鈉及其注射劑樣品與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品在兔體內(nèi)對APTT、PT和TT的影響以及抗-Ⅹa活性比較示意圖，其中(1)為對APTT的影響圖，(2)為對PT的影響圖，(3)為對TT的影響圖，(4)為抗-Ⅹa活性圖。

具體實施方式

本發(fā)明實施例描述了一種新來源的依諾肝素鈉——牛腸粘膜依諾肝素鈉及其注射劑，下面以具體實驗案例為例來說明具體實施方式，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實施例1

取巴西市售的牛腸粘膜肝素鈉，經(jīng)全綿羊血漿法抗凝活性折干后為156.3單位每毫克；按USP39規(guī)定的精品肝素鈉抗-Ⅹa和抗-Ⅱa活性測定方法，抗-Ⅹa活性折干后僅為120.1單位每毫克，抗-Ⅱa活性折干后為93.0單位每毫克，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例為1.29。

準(zhǔn)確稱取上述牛腸粘膜肝素鈉80克，溶解于800毫升水中；另將200克芐索氯銨，溶解于800毫升水中，配制成澄清的芐索氯銨水溶液；于充分?jǐn)嚢柘?，將芐索氯銨水溶液滴加至肝素水溶液中，30分鐘內(nèi)滴加完畢，繼續(xù)攪拌2小時。用高速離心機(jī)6000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，沉淀用1600毫升水重懸，繼續(xù)充分?jǐn)嚢?分鐘，再6000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。重復(fù)一次。沉淀的牛腸粘膜肝素季銨鹽，45℃鼓風(fēng)干燥10小時后，轉(zhuǎn)移至真空干燥箱，在60℃下真空干燥48小時。干燥后的牛腸粘膜肝素季銨鹽的干燥失重為0.5％，稱重為232.5克。

取上述干燥后的牛腸粘膜肝素季銨鹽200克于2升反應(yīng)瓶中，加入1300克二氯甲烷攪拌溶解，升溫至38℃，加入220克氯化芐，全程保溫30-40℃，反應(yīng)過夜(＝25小時)，轉(zhuǎn)移反應(yīng)液至5升瓶。另外，稱量160克醋酸鈉，溶解于1600毫升的甲醇中，在酯化反應(yīng)結(jié)束后滴加至反應(yīng)液中，此時產(chǎn)生不溶的牛腸粘膜肝素芐基酯沉淀。再加入3升甲醇，攪拌5分鐘，靜置過夜。小心地吸去上清液，下層沉降區(qū)混合物，用100目濾布抽濾，得到牛腸粘膜肝素芐基酯粗品。粗品再兩次以1.6升甲醇重懸，充分?jǐn)嚢柘礈旌蟪闉V。稱取20克氯化鈉并溶于160毫升水中，用該氯化鈉水

溶液溶解上述固體，再以1.6升的甲醇醇沉，沉淀物以離心機(jī)6000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘收獲。重復(fù)鹽水溶再甲醇醇沉3次，沉淀轉(zhuǎn)移至真空干燥箱，60℃真空干燥50小時。所得的牛腸粘膜肝素芐基酯稱重60.2克，干燥失重為3.3％，酯化度折干后為12.8％。

取上述牛腸粘膜肝素芐基酯50克，溶于1.25升水中，加熱至60℃，保溫60±1℃30分鐘以上。另外準(zhǔn)確稱取6.25克50％氫氧化鈉溶液，加入上述保溫的水溶液中，繼續(xù)攪拌保溫60±2℃，反應(yīng)90分鐘。將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入25克30％雙氧水，氧化脫色30分鐘。用稀鹽酸調(diào)pH至7.0，0.22微米過濾反應(yīng)液。濾液加125克氯化鈉，攪拌確保氯化鈉全溶，調(diào)pH至6.0，再0.22微米精過濾。加入3升甲醇醇沉，沉淀物經(jīng)400目過濾。沉淀物再以3升甲醇重懸攪拌30分鐘，抽濾取沉淀。沉淀溶于120克水后，轉(zhuǎn)移至凍干瓶，真空凍干30小時。凍干粉稱重后裝袋，密封送檢。

最終收獲牛腸粘膜依諾肝素鈉30.4克，按初始投料計重量收率56.0％，干燥失重為4.2％。均重分子量為4431，分子量<2000部分的比例為15.7％，2000<分子量<8000部分的比例為72.8％，分子量>8000部分的比例為12.5％；1,6-酐環(huán)糖鏈占總糖鏈為22.0％?？?Ⅹa活性折干后為95.2單位每毫克，抗-Ⅱa活性折干后為19.5單位每毫克，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例為4.9；1.0克產(chǎn)品溶于10毫升水的溶液，澄清且色度不深于6號標(biāo)準(zhǔn)色；1.0克產(chǎn)品溶于10毫升水的溶液，pH為6.76；鈉含量折干后為12.1％；氮含量折干后為2.0％；水溶液在232納米波長有最大吸收，折干后231納米特征吸收為16.2；磺酸根/羧酸根比例為2.8；有關(guān)物質(zhì)芐醇含量折干后不大于0.1％，芐銨鹽含量折干后不大于0.1％；重金屬殘留不大于30ppm；溶劑殘留中甲醇為210ppm；細(xì)菌內(nèi)毒素含量，每抗-Ⅹa單位活性依諾肝素鈉小于0.01細(xì)菌內(nèi)毒素單位(EU)。以上牛腸粘膜依諾肝素鈉的所有指標(biāo)，除了抗-Ⅱa活力偏低外，均符合USP39依諾肝素鈉的放行標(biāo)準(zhǔn)。

實施例2

牛腸粘膜肝素鈉，由蘇州特瑞藥業(yè)有限公司提供，提取和純化自中國東北肉牛屠宰后的小腸粘膜。準(zhǔn)確稱取3.0千克，經(jīng)全綿羊血漿法抗凝活性折干后為156.3單位每毫克；按USP39規(guī)定的精品肝素鈉抗-Ⅹa和抗-Ⅱa活性測定方法，抗-Ⅹa活性折干后為139.1單位每毫克，抗-Ⅱa活性折干后為130.0單位每毫克，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例為1.07

制備牛腸粘膜依諾肝素鈉的過程同實施例一，僅試劑使用量上的差異。最終獲得牛腸粘膜依諾肝素鈉1683.1克，按初始投料計重量收率56.1％。干燥失重為3.2％；1.0克產(chǎn)品溶于10毫升水的溶液，澄清且色度不深于6號標(biāo)準(zhǔn)色；1.0克產(chǎn)品溶于10毫升水的溶液，pH為6.9；鈉含量折干后為11.8％；氮含量折干后為2.1％；水溶液在232納米波長有最大吸收，折干后231納米特征吸收為16.0；磺酸根/羧酸根比例為2.5；有關(guān)物質(zhì)芐醇含量折干后不大于0.1％，芐銨鹽含量折干后不大于0.1％；重金屬殘留不大于30ppm；溶劑殘留中甲醇為240ppm；細(xì)菌內(nèi)毒素含量，每抗-Ⅹa單位活性依諾肝素鈉小于0.01細(xì)菌內(nèi)毒素單位。以上所有牛腸粘膜依諾肝素鈉的測試結(jié)果，均符合USP39依諾肝素鈉的放行標(biāo)準(zhǔn)。

牛腸粘膜依諾肝素鈉重均分子量及分子量分布分析：

牛腸粘膜依諾肝素鈉的分子量分布，參照USP39方法進(jìn)行，結(jié)果如附圖1和表1所列。

表1：牛腸粘膜依諾肝素鈉樣品的重均分子量及分子量分布

表格中的牛腸粘膜依諾肝素鈉(RX0025-JCJ-003)來自于實施例二所制備的產(chǎn)品。

結(jié)果可以看出，實施例二中制備的牛腸粘膜依諾肝素鈉，其均重分子量和分子量分布與來源于豬腸粘膜的依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品非常接近，符合USP39技術(shù)指標(biāo)的要求。

牛腸粘膜依諾肝素鈉二糖和1,6-酐含量分析：

牛腸粘膜依諾肝素鈉的二糖組成分析，遵照USP32附錄<207>“依諾肝素鈉的1,6-酐衍生物檢查”進(jìn)行。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的二糖組成和1,6-酐分析結(jié)果見圖2和表2。

表2：牛腸粘膜依諾肝素鈉與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的二糖組成比例及1,6-酐％

從圖2和表2可以看出，實施例二制備的牛腸粘膜依諾肝素鈉依諾肝素鈉呈現(xiàn)出典型的牛腸粘膜肝素特征，與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的二糖相比，其主要二糖ΔⅢS的含量要更高，達(dá)到17.08％，值得注意的是，二糖組成和百分含量并非USP39和EP8.6的放行指標(biāo)。同時，本工藝制備的牛腸粘膜依諾肝素鈉的1,6-酐百分含量與標(biāo)準(zhǔn)品幾乎相同，為19.5％，符合USP39要求的15％-25％的指標(biāo)。

牛腸粘膜依諾肝素鈉的磺酸根羧酸根比例分析：

牛腸粘膜依諾肝素鈉的磺酸根羧酸根比例分析，方法遵照USP39進(jìn)行，計算磺酸根和羧酸根的摩爾比，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，牛腸粘膜依諾肝素鈉的磺酸根和羧酸根的摩爾比是2.5，稍高于通常的豬腸粘膜依諾肝素鈉(2.2)一致。該項測試反映糖鏈上的磺酸根修飾程度，說明兩者的磺酸根修飾也較為接近。測試結(jié)果都在USP39的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)(大于1.8)之內(nèi)，牛腸粘膜依諾肝素鈉的磺酸根和羧酸根比例符合其規(guī)定。

牛腸粘膜依諾肝素鈉的核磁氫譜(¹H-NMR)分析：

牛腸粘膜依諾肝素鈉的核磁氫譜分析，設(shè)備用蘇州大學(xué)分析測試中心的600MHz核磁共振譜儀，以3-三甲基硅基丙酸鈉-d4(TSP)定零點。

待測樣品溶液配制：牛腸粘膜依諾肝素鈉(實施例一)和依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品，各準(zhǔn)確各稱取20毫克左右，按重以氘水(D₂O)溶解成20毫克每毫升左右的濃度，滴加1-2滴TSP，震蕩混勻后0.22微米過濾送檢，結(jié)果如圖4所示，其中，δ3.4ppm為甲醇?xì)埩舻募谆鶜浞澹?.7ppm為水氫峰。

結(jié)果顯示，實施例一制備的牛腸粘膜依諾肝素鈉的氫譜與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品較為一致，但在δ2.04ppm處的氮-乙酰基的甲基峰，牛腸粘膜依諾肝素鈉的積分含量要低一些，說明牛腸粘膜依諾肝素鈉中，氮-乙酰基修飾更少，相應(yīng)地，其氮-磺酸基修飾就更多。通常，更多的磺酸基修飾可以帶來更高的抗凝活性。USP39對依諾肝素沒有要求氫譜測試。

牛腸粘膜依諾肝素鈉核磁碳譜(¹⁴C-NMR)分析：

牛腸粘膜依諾肝素鈉的的核磁碳譜分析，設(shè)備用蘇州大學(xué)分析測試中心的600MHz核磁共振譜儀，方法遵照USP39進(jìn)行。

待測樣品溶液配制：牛腸粘膜依諾肝素鈉(實施例二)和依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品，各準(zhǔn)確各稱取200毫克，加入0.2毫升氘水(D₂O)和0.8毫升純水溶清，再滴加50微升氘代甲醇，震蕩混勻后0.22微米過濾送檢，結(jié)果如圖5所示，其中，δ50ppm為甲醇?xì)埩舻募谆挤濉?/p>

結(jié)果顯示，同氫譜一致，實施例一制備的牛腸粘膜依諾肝素鈉碳骨架與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品一致，但一些具體的位置，如δ24.9ppm的氮-乙?；募谆迹坑幸欢ǖ牟町?。該牛腸粘膜依諾肝素鈉的碳譜，雖然差異明顯，但該差異項不在USP39的要求中，因此結(jié)果符合USP39對該項指標(biāo)的規(guī)定。

牛腸粘膜依諾肝素鈉抗-Ⅹa、抗-Ⅱa活力和全綿羊血漿法活力對比分析：

牛腸粘膜依諾肝素鈉的抗-Ⅹa和抗-Ⅱa的活性測定遵照USP39進(jìn)行，來源于實施例1的牛腸粘膜依諾肝素鈉與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的各活性對比如下表3。

表3：牛腸粘膜依諾肝素鈉樣品的抗凝活力對比

結(jié)果顯示：牛腸粘膜依諾肝素鈉和依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品相比，全綿羊血漿法的抗凝血活力低了～10％，抗-Ⅹa活力較高，達(dá)到了120.2單位每毫克，而抗-Ⅱa活力則非常低，僅15.9單位每毫克，以此得到的抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在7.6，其抗-Ⅱa活力和比例，偏出了USP39對依諾肝素鈉的指標(biāo)要求。

綜合以上所有測試的結(jié)果，實施例2制備的牛腸粘膜依諾肝素鈉樣品與豬腸粘膜依諾肝素鈉相比，除了種源不同和抗-Ⅱa活力偏低外，其余的各項都符合USP39對依諾肝素鈉的放行指標(biāo)要求，比對EP8.6要求的依諾肝素鈉放行指標(biāo)，也是完全符合的。

實施例3

牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑1的制備

按活性計算并準(zhǔn)確稱取牛腸粘膜依諾肝素鈉粉末171.9克(干燥失重3.2％，折干后120.2抗-Ⅹa單位每毫克，共0.2億抗-Ⅹa單位)，以冷卻的注射用水溶解并定容至2000毫升，兩級0.2微米過濾器無菌過濾進(jìn)A級潔凈區(qū)，并以灌封機(jī)灌封至1毫升玻璃注射器中，規(guī)格為6000單位(或0.6毫升)，去除損耗，共收獲牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑1成品1830支。

實施例4

牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑2的制備

按活性計算并準(zhǔn)確稱取牛腸粘膜依諾肝素鈉粉末286.3克(干燥失重3.2％，折干后120.2抗-Ⅹa單位每毫克，共0.3億抗-Ⅹa單位)，以冷卻的注射用水溶解，加入45.0克苯甲醇，攪拌均勻，再以冷卻的注射用水定容至3000毫升，兩級0.2微米過濾器無菌過濾進(jìn)A級潔凈區(qū)，并以灌封機(jī)灌封至5毫升西林瓶中，規(guī)格為30000單位(或3.0毫升)，去除損耗，共收獲牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑2成品870瓶。

實施例5

牛腸粘膜依諾肝素鈉與牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑的家兔體內(nèi)抗凝試驗

一、實驗內(nèi)容：

供試樣品：牛腸粘膜依諾肝素鈉樣品(實施例二所述，批號：RX0025-JCJ-003)，牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑1(實施例三所述)，牛腸粘膜依諾肝素鈉注射劑2(實施例四所述)，依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品為臨床市售藥品(克賽，批號：24459)。配制：牛腸粘膜依諾肝素鈉樣品以生理鹽水配制成100毫克每毫升濃度，并0.2微米過濾待用，其他注射劑直接用于注射。

實驗方法：選取日本大白兔2-3千克，根據(jù)體重分別在前背部近上肢處皮下注射給藥。注射劑量：2毫克每千克(或200單位每千克)。于給藥前及給藥后每0.5小時-1小時分別采血，采血2毫升，用3.8％枸櫞酸鈉抗凝劑1：9抗凝，上機(jī)檢測。測定儀器：全自動血凝儀(Stago Compact)和血小板聚集儀(普利生LBY-NJ4)?？鼓囼灒簻y定包括抗-Ⅹa活性、活化部分凝血酶時間(APTT)和凝血酶時間(TT)等常規(guī)凝血全套。

二、實驗結(jié)果與分析：

1)APTT：

實驗結(jié)果如附圖6(1)所示，從圖中可以看出：與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品相比，牛腸粘膜依諾肝素鈉及其注射劑均能顯著延長APTT，牛腸粘膜依諾肝素鈉及其注射劑對APTT延長作用相當(dāng)，均比依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品稍弱一些；所有組別在兔體內(nèi)達(dá)到APTT最大值時間相近，衰減時間也相近，揭示牛腸粘膜依諾肝素鈉及其注射劑在兔體內(nèi)與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品是一致的。

2)PT：

實驗結(jié)果如附圖6(2)所示，從圖中可以看出：各組樣品在兔體內(nèi)均對PT影響較小，無顯著延長作用。

3)TT：

實驗結(jié)果如附圖6(3)所示，從圖中可以看出：牛腸粘膜依諾肝素鈉及其注射劑均能顯著延長TT，但比依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品稍弱；在兔體內(nèi)達(dá)到TT最大值的時間，牛腸粘膜依諾肝素鈉及其注射劑與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品相近，衰減時間也相當(dāng)。

4)抗-Xa活性：

實驗結(jié)果如附圖6(4)所示，從圖中可以看出：各組皮下注射后，兔血漿中肝素的抗-Ⅹa活性，其吸收和代謝(或衰減)曲線均一致，都是在大約2小時至4小時達(dá)到吸收峰值，在8小時幾乎全部衰減。

所有以上數(shù)據(jù)揭示，牛腸粘膜依諾肝素鈉及其注射劑，在兔體內(nèi)有著良好的抗凝效果，且與依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)。

本發(fā)明尚有多種實施方式，凡采用等同變換或者等效變換而形成的所有技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。