本發(fā)明涉及利用枯草芽孢桿菌高效表達磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)基因的方法。

(二)

背景技術(shù)：

磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)的種類很多，在細菌、原生動物、酵母、霉菌、植物、昆蟲和哺乳動物中均存在。在各個領(lǐng)域均有應(yīng)用：醫(yī)藥領(lǐng)域，主要作為疫苗用于預(yù)防各種病原菌的感染；食品領(lǐng)域，多用于面包烘培、奶制品加工、保健食品等；工業(yè)領(lǐng)域，主要用于油脂精煉、磷脂改性、動物飼料添加劑等。

雞球蟲病發(fā)病率高(50～70％)，致死率高(50～80％)，嚴重危害養(yǎng)殖業(yè)，每年因球蟲病造成的損失高達數(shù)十億美元?，F(xiàn)有雞球蟲病防治，主要依靠化學(xué)藥物，但存在耐藥性、藥物殘留等不足，若采用接種疫苗方式進行防治，又存在風(fēng)險較大、且研發(fā)困難的不足，而采用抗生素或中草藥，也存在耐藥性的問題，且效果一般。因此，亟需尋找一種新的抗球蟲藥物替代化學(xué)藥物來有效控制雞球蟲病。

細菌PI-PLC可裂解細胞膜表面糖基錨定蛋白，從而影響細胞膜表面上糖蛋白及碳水化合物的釋放，而球蟲等大多數(shù)致病性寄生蟲細胞膜表面抗原都是通過糖基錨定在細胞上的，PI-PLC能切斷錨定蛋白中肌醇磷脂與細胞膜的連接，使寄生蟲喪失入侵宿主細胞和在宿主細胞內(nèi)增殖的能力，因此PI-PLC顯示出顯著的抗球蟲感染特性。

PI-PLC的抗球蟲機理為新型抗球蟲藥的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。PI-PLC降低了球蟲因耐藥性加劇而爆發(fā)的風(fēng)險，避免養(yǎng)殖業(yè)因球蟲病復(fù) 發(fā)而造成的重大損失。PI-PLC廣泛分布于動植物以及微生物的體內(nèi)，本身就參與機體細胞的代謝和信息交流，不存在產(chǎn)生耐藥性及藥物殘留等問題。具有安全、無毒害作用。通過微生物異源表達，可以大量生產(chǎn)PI-PLC，降低抗球蟲藥的使用成本。

(三)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供利用枯草芽孢桿菌高效表達磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)基因的方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種利用枯草芽孢桿菌高效表達磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)基因的方法，所述方法包括：將SEQ ID No：1所示序列與pBE980a質(zhì)粒連接，構(gòu)建得到重組表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌EPI400中，篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌中，獲得重組基因工程菌進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，于培養(yǎng)液中獲得轉(zhuǎn)化后的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C。

SEQ ID No：1序列如下：

5’-gcgtcaagcgtgaacgaactggaaaattggagcaaatggatgcaaccgattcctgattcaatcccgcttgcgcgtattagcatccctggcacgcatgactctggaacatttaaattgcaaaacccgatcaaacaggtttggggcatgacacaagaatacgattttcgttatcagatggaccatggtgctcggatttttgatatcagaggccgcttaacggatgacaatacaatcgttttgcatcatggaccgttgtacttgtacgtgacgttgcatgaatttatcaacgaagcgaaacagtttttgaaagataacccttcagaaacaatcatcatgagcttgaaaaaagaatacgaagatatgaaaggcgctgaagactctttttcttccacgtttgagaaaaaatactttgtcgatcctatctttctgaaaacagaaggaaacatcaaacttggagacgccagaggtaaaattgtactgcttaaacgctattctggttccaacgaaccgggcggatacaacaacttttactggcctgataacgaaacgtttacaacgacagtgaatcaaaacgcaaatgttacagtgcaggataaatacaaagtctcctacgacgaaaaagtaaaaagcatcaaagatacgatggacgaaacaatgaataactctgaagatctgaaccatctttacatcaactttacgtcactttcaagcggtggcacagcttggaattctccgtattactatgcct cctacatcaaccctgaaatcgcaaactacatcaaacagaaaaatccggcacgcgtcggatgggtaatccaggattatattaatgaaaaatggagcccgttactgtatcaagaagtcatcagagcaaataaatccttaatcaaagaataa-3’。

最終表達的序列如下：

gcgtcaagcgtgaacgaactggaaaattggagcaaatggatgcaaccgattcctgattcaatcccgcttgcgcgtattagcatccctggcacgcatgactctggaacatttaaattgcaaaacccgatcaaacaggtttggggcatgacacaagaatacgattttcgttatcagatggaccatggtgctcggatttttgatatcagaggccgcttaacggatgacaatacaatcgttttgcatcatggaccgttgtacttgtacgtgacgttgcatgaatttatcaacgaagcgaaacagtttttgaaagataacccttcagaaacaatcatcatgagcttgaaaaaagaatacgaagatatgaaaggcgctgaagactctttttcttccacgtttgagaaaaaatactttgtcgatcctatctttctgaaaacagaaggaaacatcaaacttggagacgccagaggtaaaattgtactgcttaaacgctattctggttccaacgaaccgggcggatacaacaacttttactggcctgataacgaaacgtttacaacgacagtgaatcaaaacgcaaatgttacagtgcaggataaatacaaagtctcctacgacgaaaaagtaaaaagcatcaaagatacgatggacgaaacaatgaataactctgaagatctgaaccatctttacatcaactttacgtcactttcaagcggtggcacagcttggaattctccgtattactatgcctcctacatcaaccctgaaatcgcaaactacatcaaacagaaaaatccggcacgcgtcggatgggtaatccaggattatattaatgaaaaatggagcccgttactgtatcaagaagtcatcagagcaaataaatccttaatcaaagaataa

其編碼的氨基酸序列為：

assvnelenwskwmqpipdsiplarisipgthdsgtfklqnpikqvwgmtqeydfryqmdhgarifdirgrltddntivlhhgplylyvtlhefineakqflkdnpsetiimslkkeyedmkgaedsfsstfekkyfvdpiflktegniklgdargkivllkrysgsnepggynnfywpdnetftttvnqnanvtvqdkykvsydekvksikdtmdetmnnsedlnhlyinftslssggtawnspyyyasyinpeianyikqknparvgwviqdyinekwspllyqevirankslike(其中下劃線所示為載體上的信號肽)

具體的，所述方法如下：

(1)表達載體構(gòu)建：以SEQ ID No：2所示PI-PLC基因為模板，以P1/P2為引物進行PCR擴增：

引物P1：5’-GCCAAGCTTGCGTCAAGCGTGAAC GAACTGGAAAATTGG-3’；

引物P2：5’-GCCGGATCCTTACCCATCCGACGCGTGCCGGATTTTTCTGTT-3’；

(2)步驟(1)酶切、回收的目的基因與pBE980a質(zhì)粒連接，得到重組表達載體pBE980a PI-PLC；

(3)重組表達載體pBE980a PI-PLC轉(zhuǎn)入大腸桿菌EPI400感受態(tài)細胞，篩選獲得陽性克隆；EPI400電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞可以顯著降低各種常見的載體的拷貝數(shù),這樣就可以更容易地克隆不穩(wěn)定的DNA序列。EPI400感受態(tài)細胞在制備質(zhì)粒時需要加入L-阿拉伯糖進行誘導(dǎo)，接菌培養(yǎng)時按照2mmol/L的濃度加入L-阿拉伯糖。

(4)步驟(3)陽性克隆電轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，獲得重組基因工程菌；

(5)重組基因工程菌在含有10ug/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h以上，于培養(yǎng)基上清液獲得PI-PLC。

所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌WB600或枯草芽孢桿菌WB800。

SEQ ID No.2序列如下：

5’-ATGTCTAACAAAAAACTTATCCTGAAATTATTTATCTGCTCCACAATCTTTATTACATTTGTCTTTGCTCTGCATGACAAACGGGTGGTTGCAGCGTCAAGCGTGAACGAACTGGAAAATTGGAGCAAATGGATGC AACCGATTCCTGATTCAATCCCGCTTGCGCGTATTAGCATCCCTGGCACGCATGACTCTGGAACATTTAAATTGCAAAACCCGATCAAACAGGTTTGGGGCATGACACAAGAATACGATTTTCGTTATCAGATGGACCATGGTGCTCGGATTTTTGATATCAGAGGCCGCTTAACGGATGACAATACAATCGTTTTGCATCATGGACCGTTGTACTTGTACGTGACGTTGCATGAATTTATCAACGAAGCGAAACAGTTTTTGAAAGATAACCCTTCAGAAACAATCATCATGAGCTTGAAAAAAGAATACGAAGATATGAAAGGCGCTGAAGACTCTTTTTCTTCCACGTTTGAGAAAAAATACTTTGTCGATCCTATCTTTCTGAAAACAGAAGGAAACATCAAACTTGGAGACGCCAGAGGTAAAATTGTACTGCTTAAACGCTATTCTGGTTCCAACGAACCGGGCGGATACAACAACTTTTACTGGCCTGATAACGAAACGTTTACAACGACAGTGAATCAAAACGCAAATGTTACAGTGCAGGATAAATACAAAGTCTCCTACGACGAAAAAGTAAAAAGCATCAAAGATACGATGGACGAAACAATGAATAACTCTGAAGATCTGAACCATCTTTACATCAACTTTACGTCACTTTCAAGCGGTGGCACAGCTTGGAATTCTCCGTATTACTATGCCTCCTACATCAACCCTGAAATCGCAAACTACATCAAACAGAAAAATCCGGCACGCGTCGGATGGGTAATCCAGGATTATATTAATGAAAAATGGAGCCCGTTACTGTATCAAGAAGTCATCAGAGCAAATAAATCCTTAATCAAAGAATAA-3’。

其編碼的氨基酸序列：

assvnelenwskwmqpipdsiplarisipgthdsgtfklqnpikqvwgmtqeydfryqmdhgarifdirgrltddntivlhhgplylyvtlhefineakqflkdnpsetiimslkkeyedmkgaedsfsstfekkyfvdpiflktegniklgdargkivllkrysgsnepggynnfywpdnetftttvnqnanvtvqdkykvsydekvksikdtmdetmnnsedlnhlyinftslssggtawnspyyyasyi npeianyikqknparvgwviqdyinekwspllyqevirankslike(下劃線部分為去除的31個前導(dǎo)肽)

上述基因為從NCBI數(shù)據(jù)庫中得到的一段蠟狀芽胞桿菌PI-PLC基因(Genbank:M30809.1)，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性，在保證氨基酸序列不變的前提下，優(yōu)化設(shè)計并合成的PI-PLC目的基因，該基因可在大腸桿菌中的異源高表達，且重組蛋白顯示磷脂酶活性較高，由于條件致病菌大腸桿菌可能會導(dǎo)致動物感染治病，不是一種安全的表達宿主菌，不能直接喂養(yǎng)動物，未批注用于飼料，無法產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，因此有必要建立起的能夠產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的表達系統(tǒng)。

在基因工程中，枯草芽孢桿菌是廣泛使用的表達系統(tǒng)，它沒有致病性、是國家批準可以使用的宿主菌，并且具有很強的向胞外分泌蛋白能力，但異源蛋白的表達往往很低，為實現(xiàn)PI-PLC基因在枯草芽孢桿菌中的異源高表達，發(fā)明人進行了多次嘗試，前后歷時一年多，最終發(fā)現(xiàn)采用大腸桿菌EPI400(其他大腸桿菌表達不了)，且去掉PI-PLC基因的31個前導(dǎo)肽，利用特定載體pBE980a上(為穿梭質(zhì)粒，可以在大腸桿菌和芽孢桿菌中復(fù)制)的序列進行胞外分泌表達，才能獲得正確的克隆。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明構(gòu)建了磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)的枯草芽孢桿菌穩(wěn)定表達系統(tǒng)，成功實現(xiàn)了PI-PLC基因在枯草芽孢桿菌中的異源高表達，為后續(xù)PI-PLC的批量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

(四)附圖說明

圖1為質(zhì)粒pBE980a圖譜；

圖2為重組質(zhì)粒pBE980a PI-PLC圖譜；

圖3為PI-PLC酶活性檢測結(jié)果。

(五)具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：

實施例1：

1、PI-PLC基因的優(yōu)化與合成

從NCBI數(shù)據(jù)庫中得到的一段蠟狀芽胞桿菌PI-PLC基因(Genbank:M30809.1)，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性，在保證氨基酸序列不變的前提下，優(yōu)化設(shè)計并合成的PI-PLC目的基因(SEQ ID No.2)，由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

2、目的基因片段的獲得與鑒定

具體步驟：以SEQ ID No：2所示PI-PLC基因為模板，以P1/P2為引物進行PCR擴增：

引物P1：5’-GCCAAGCTTGCGTCAAGCGTGAAC GAACTGGAAAATTGG-3’；

引物P2：5’-GCCGGATCCTTACCCATCCGACGCGTGCCGGATTTTTCTGTT-3’；以合成基因PI-PLC為模板，以p1/p2為引物進行PCR擴增。

PCR擴增體系為：模板1μL，上下游引物各1μL，2×super HIFI-MIXⅡ25μL，滅菌的雙蒸水20μL。

PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸60s，32個循環(huán)后72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。

3、重組質(zhì)粒pBE980a PI-PLC的構(gòu)建

具體步驟：基因PI-PLC經(jīng)過PCR獲得了含有HindIII和BamHI粘性 末端的產(chǎn)物(SEQ ID No.1)，通過與含有相同粘性末端的載體質(zhì)粒pBE980a(由中科院天津生物技術(shù)研究所宋詼老師饋贈，質(zhì)粒圖譜見圖1)連接，獲得重組質(zhì)粒pBE980a PI-PLC(圖譜參見圖2)。

4、重組質(zhì)粒pBE980a PI-PLC在大腸桿菌中的克隆

具體步驟：提取正確的重組質(zhì)粒pBE980a PI-PLC，轉(zhuǎn)到表達宿主菌大腸桿菌EPI400電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞(F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dlacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(ara,leu)7697galU galKλ-rpsL(StrR)nupG trfA tonA pcnB4dhfr，購自Epicentre Biotechnologies公司)，挑選單克隆，進行測序分析，測序結(jié)果顯示為陽性克隆。

5、轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌

感受態(tài)細胞制備：分別取枯草芽孢桿菌WB600(購于BioVector質(zhì)粒載體菌種細胞基因保藏中心)和枯草芽孢桿菌WB800(購于BioVector質(zhì)粒載體菌種細胞基因保藏中心)單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)基中200rpm/min振蕩培養(yǎng)過夜。將活化好的單菌落接種于生長培養(yǎng)基中(LB+0.5M山梨醇)中，過夜培養(yǎng)。將菌種按1/16的接種量接種于生長培養(yǎng)基(LB+0.5M山梨醇)，37℃搖床振蕩培養(yǎng)至OD600nm在0.85～0.95左右。用冰水浴冷卻培養(yǎng)物10min，于4℃，5000rpm，離心5min收集菌體。反復(fù)用冰冷的電擊緩沖液(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油)洗滌細胞收集物4次。用原培養(yǎng)液1/40體積的電擊緩沖液重新懸浮細胞收集物，40微升的分裝一個EP管中，放入-80℃保存。

分別取枯草芽孢桿菌WB600和枯草芽孢桿菌WB800感受態(tài)細胞40ulmL，加入1～2μL重組質(zhì)粒，進行電轉(zhuǎn)化：電擊條件2.0KV，1mm，電擊1次。電擊完畢后取出杯子立即加入1ml RM(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃，200rpm，復(fù)蘇3h后，涂板。37℃，過夜培養(yǎng)。 挑選陽性克隆進行質(zhì)粒提取，測序正確，獲得重組基因工程菌。

6、誘導(dǎo)培養(yǎng)：

重組基因工程菌在含有10ug/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)48h，于培養(yǎng)基上清液獲得PI-PLC。

7、PI-PLC酶活性檢測：

PI-PLC水解磷酸肌醇磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的不溶于水的二?；视?，在平板上顯示乳白色暈圈。取10mL含有PIPLC表達載體的重組菌菌液，在PI-李斯特氏菌顯色平板點樣，并以同樣方法取枯草芽孢桿菌WB600和WB800作為對照，37℃溫育12h。觀察結(jié)果，如果重組蛋白有酶活性，會在PI-李斯特氏菌顯色平板顯示乳白色暈圈，反之沒有活性。結(jié)果參見圖3。

8、酶聯(lián)反應(yīng)定量測定菌液中PI-PLC的含量

具體步驟：

①待測樣品的處理：將誘導(dǎo)表達后的重組菌菌液，置于冰上超聲波破碎至澄清8000r/min離心10min，收集上清；

②標(biāo)準品的稀釋：試劑盒提供原倍PI-PLC標(biāo)準品一支，按照下列圖表在1.5mL離心管中進行稀釋。

③加樣：分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準品準確加樣50μL， 待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

④溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30min。

⑤配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

⑥洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

⑦加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外。

⑧溫育：操作同3。

⑨洗滌：操作同5。

⑩顯色：每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。

終止：每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。

測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15min以內(nèi)進行。

計算以標(biāo)準物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準物的濃度與OD值計算出標(biāo)準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

結(jié)果參見圖3，顯示按上述方法誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌表達PI-PLC，最終測得誘導(dǎo)后培養(yǎng)液(上清液)中PI-PLC的濃度為9.4mg/L。