本發(fā)明屬于基因檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于單細(xì)胞全基因組重亞硫酸氫鹽測序的文庫構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：DNA甲基化(DNAmethylation)是真核生物基因組DNA的一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferase,DNMT)的作用下，將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基基團(tuán)共價(jià)結(jié)合到DNA分子的胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的過程。DNA甲基化在維持高等生物正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育、衰老以及人類腫瘤的發(fā)生等生物學(xué)過程中起著重要作用。在無脊椎動物中，基因組DNA甲基化通過調(diào)控基因的表達(dá)模式，參與調(diào)節(jié)機(jī)體對環(huán)境的適應(yīng)過程。因此，獲得全基因組范圍內(nèi)所有胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化數(shù)據(jù)，對于表觀遺傳學(xué)的時(shí)空特異性研究具有重要意義。現(xiàn)有的BisulfiteSequencing(重亞硫酸氫鹽測序)將基因組中未發(fā)生甲基化的C堿基轉(zhuǎn)換成U，經(jīng)PCR擴(kuò)增后變成T，與原本具有甲基化修飾的C堿基區(qū)分開來。Bisulfite處理與高通量測序技術(shù)相結(jié)合，可精確分析每一個(gè)C堿基的甲基化狀態(tài)，從而來繪制單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜，用于研究特定DNA區(qū)域甲基化與特定表型之間的關(guān)聯(lián)，為細(xì)胞分化、組織發(fā)育等基礎(chǔ)機(jī)制研究，以及動植物育種、人類健康與疾病研究奠定基礎(chǔ)。當(dāng)前普遍采用的方法是從大量的組織樣品中獲取基因組DNA進(jìn)行測序。但此傳統(tǒng)方法依賴于一次性總體分析數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)，往往會掩蓋特異組織中某些特化細(xì)胞具有生物學(xué)意義的甲基化修飾差異。并且，在健康組織或腫瘤等病變組織中，某些細(xì)胞的數(shù)量稀少，除了單細(xì)胞方法沒有任何其他的技術(shù)能夠?qū)λ鼈冞M(jìn)行分析。Sebastien等提出了單細(xì)胞全基因組重亞硫酸氫鹽測序技術(shù)，流程包括：(1)采集單細(xì)胞；(2)將采集的單細(xì)胞進(jìn)行裂解，得到裂解后的單細(xì)胞樣本；(3)將所述裂解后的單細(xì)胞樣本進(jìn)行重亞硫酸氫鹽處理，得到重亞硫酸氫鹽處理產(chǎn)物；(4)以上述的重亞硫酸氫鹽處理產(chǎn)物為模板，使用含生物素標(biāo)記的oligo1引物合成第一條鏈；(5)使用鏈霉親和素磁珠調(diào)取生物素標(biāo)記的第一條鏈；(6)以上述生物素標(biāo)記的第一條鏈為模板，使用oligo2引物合成第二條鏈；以及(7)以所述合成的第二條鏈作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而構(gòu)建二代測序用DNA文庫。但是，該方法做出的實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果中，數(shù)據(jù)的比對率(UniqueMappedRatio)較低。參考文獻(xiàn)[1]SébastienSmallwoodSA,LeeHJetal.2014.Single-cellgenome-widebisulfitesequencingforassessingepigeneticheterogeneity.Naturemethods,8,11(8):817-820.技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的在于提供一種單細(xì)胞全基因組重亞硫酸氫鹽測序的文庫構(gòu)建方法，以及用于測定單細(xì)胞基因組DNA樣本的甲基化位點(diǎn)的試劑盒。以提高數(shù)據(jù)比對率(UniqueMappedRatio)。1.一種單細(xì)胞全基因組重亞硫酸氫鹽測序用文庫的構(gòu)建方法，該方法包括：步驟A：將單細(xì)胞進(jìn)行裂解，得到裂解后的單細(xì)胞樣本；步驟B：將所述裂解后的單細(xì)胞樣本進(jìn)行重亞硫酸氫鹽處理，加入tRNA進(jìn)行純化，得到純化后的重亞硫酸氫鹽處理產(chǎn)物；步驟C：以步驟B所述重亞硫酸氫鹽處理產(chǎn)物為模板，使用含生物素標(biāo)記的oligo1引物合成第一條鏈；步驟D：使用鏈霉親和素磁珠調(diào)取所述步驟C合成的生物素標(biāo)記的第一條鏈；步驟E：以步驟D所述調(diào)取的第一條鏈為模板，使用oligo2引物合成第二條鏈，獲得合成第二條鏈的產(chǎn)物；以及步驟F：以所述合成第二條鏈的產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而構(gòu)建二代測序用DNA文庫。2.根據(jù)項(xiàng)1所述的文庫構(gòu)建方法，其中步驟B中tRNA的使用量為10ng。3.根據(jù)項(xiàng)1所述的文庫構(gòu)建方法，其中所述單細(xì)胞來源于哺乳動物、植物和/或微生物。4.根據(jù)項(xiàng)1所述的文庫構(gòu)建方法，其中步驟C所述SEQIDNO：1引物序列：5'-(Biotin)TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNN-3'。5.根據(jù)項(xiàng)1所述的文庫構(gòu)建方法，其中在步驟D之前包括步驟E-1：消化單鏈DNA。6.根據(jù)項(xiàng)1所述的文庫構(gòu)建方法，其中步驟E使用所述SEQIDNO：2引物：5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNN-3'。7.根據(jù)項(xiàng)1所述的文庫構(gòu)建方法，其中，在所述步驟C中對消化處理后的體系進(jìn)行磁珠純化，得到純化的生物素標(biāo)記的第一條鏈；和/或在所述步驟D中，對所述PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化。8.根據(jù)項(xiàng)7所述的文庫構(gòu)建方法，其中磁珠純化使用量為0.8倍以上。9.根據(jù)項(xiàng)7所述的文庫構(gòu)建方法，其中磁珠純化使用0.9倍AmpureXP磁珠進(jìn)行。10.一種用于單細(xì)胞全基因組重亞硫酸氫鹽測序的文庫構(gòu)建的試劑盒，其包括選自下組中的至少一種或全部：用于對所述單細(xì)胞進(jìn)行裂解的試劑；用于對所述單細(xì)胞裂解樣本進(jìn)行重亞硫酸氫鹽處理試劑；用于對所述重亞硫酸氫鹽處理后產(chǎn)物第一條鏈合成的試劑；用于對所述合成第一條鏈進(jìn)行調(diào)取的試劑；用于對所述第一條鏈為模板合成第二條鏈的試劑；用于對所述第二條鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑。有益效果：本發(fā)明能夠從單細(xì)胞量起始量中，擴(kuò)增得到可供后續(xù)重亞硫酸氫鹽測序使用的高通量文庫，結(jié)果提高了數(shù)據(jù)比對率，擴(kuò)展了表觀遺傳學(xué)甲基化檢測的使用范圍，具有重要的生物學(xué)意義。附圖說明圖1為樣本Ser1安捷倫2100檢測結(jié)果圖2為樣本Ser2安捷倫2100檢測結(jié)果發(fā)明的具體實(shí)施方式需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明方法包括：步驟A：采集單細(xì)胞；步驟B：將采集的單細(xì)胞進(jìn)行裂解，得到裂解后的單細(xì)胞樣本；步驟C：將所述裂解后的單細(xì)胞樣本進(jìn)行重亞硫酸氫鹽處理，加入tRNA進(jìn)行純化，得到重亞硫酸氫鹽處理產(chǎn)物；步驟D：以上述重亞硫酸氫鹽處理產(chǎn)物為模板，使用含生物素標(biāo)記的oligo1引物合成第一條鏈；步驟E：使用鏈霉親和素磁珠調(diào)取生物素標(biāo)記的第一條鏈；步驟F：以步驟D所述調(diào)取的第一條鏈為模板，使用oligo2引物合成第二條鏈，獲得合成第二條鏈的產(chǎn)物；以及步驟G：以所述合成的第二條鏈作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而構(gòu)建二代測序用DNA文庫。在本發(fā)明所使用的單細(xì)胞可以源于哺乳動物、植物或/和微生物。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，哺乳動物可以為人和小鼠的至少一種，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，樣本為一個(gè)來自于小鼠MII期的卵母細(xì)胞。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在所述步驟C中，對單細(xì)胞樣本進(jìn)行重亞硫酸氫鹽處理加入tRNA，可提高最后測序結(jié)果的比對率。因此為了更好地顯現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果，優(yōu)選使用5～20ng的tRNA，更優(yōu)選10ng的tRNA。在本實(shí)施例中使用10ngtRNA，對于所述步驟C中采用的重亞硫酸氫鹽處理體系及反應(yīng)條件沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適宜選擇能夠在重亞硫酸氫鹽處理過程中使用的那些體系及反應(yīng)條件。在第一條鏈合成反應(yīng)完畢后，體系中還會有一些DNA以單鏈形式存在，例如未用完的含生物素標(biāo)記的oligo1引物。在所述步驟E中，使用核酸外切酶消化這些單鏈DNA，將其降解。所述消化的反應(yīng)條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)選擇能夠在scBS方法中使用的那些消化的反應(yīng)條件。然后，在所述步驟E中，使用鏈霉親和素磁珠調(diào)取生物素標(biāo)記的第一條鏈。這里，對于所述鏈霉親和素磁珠的種類沒有特殊限制，例如可以是M280磁珠(Invitrogen公司)。對于用于調(diào)取的條件沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇能夠在scBS方法中使用的那些用于調(diào)取的條件。接下來，在所述步驟F中，以調(diào)取到的生物素標(biāo)記的第一條鏈為模板，使用oligo2引物合成第二條鏈。對于所述步驟F中采用的第二條鏈的合成體系及反應(yīng)條件沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適宜選擇能夠在scBS方法中使用的那些第二條鏈的合成體系及反應(yīng)條件。例如，可以采用如下體系：再接下來，在所述步驟G中，以所述第二條鏈作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而構(gòu)建二代測序用DNA文庫。對于所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適宜選擇能夠在scBS方法中使用的那些PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件。在另一方面中，本發(fā)明還提供一種用于單細(xì)胞全基因組重亞硫酸氫鹽測序的文庫構(gòu)建的試劑盒(本發(fā)明的試劑盒)，其可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。本發(fā)明的試劑盒必須包含用于對重亞硫酸氫鹽處理的試劑，該試劑包括tRNA，其使用量為5～20ng，優(yōu)選10ng。用于對所述單細(xì)胞進(jìn)行裂解的試劑，如無鈣鎂PBS緩沖液、LysisBuffer、2％SDS、蛋白酶K等；用于對所述重亞硫酸氫鹽處理后產(chǎn)物第一條鏈合成的試劑，如Oligo1、10×BlueBuffer、Klenowexo-、dNTPs、核酸外切酶I、AmpureXP磁珠等；用于對所述合成第一條鏈進(jìn)行調(diào)取的試劑，如M-280磁珠、BeadBindingBuffer、BeadWashBuffer等；用于對所述第一條鏈為模板合成第二條鏈的試劑，如dNTPs、Oligo2、10×BlueBuffer等；用于對所述第二條鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑，如公共引物、Index、HiFiUracilMix等。除了采用所述tRNA、AmpureXP磁珠、Oligo1引物、Oligo2引物、公共引物、Index引物以外，本發(fā)明的試劑盒中所包含的試劑裝置等可以與現(xiàn)有的scBS建庫方法的試劑相同。實(shí)施例1以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的實(shí)施例是用于解釋本發(fā)明，而非用于限定本發(fā)明。1.采集單細(xì)胞單細(xì)胞以0.5μL以內(nèi)體積收集到0.2mL薄壁PCR管中，其中包含1μL無鈣鎂PBS緩沖液。采集的單細(xì)胞按照下面的形式進(jìn)行命名。2.裂解細(xì)胞配制LysisBuffer10mMTris-Cl(pH7.4)，2％SDS。0.2mL離心管中的單細(xì)胞樣品，體積約為1μL，無需轉(zhuǎn)管，直接將11.5μLLysisBuffer及0.5μL蛋白酶K加入管中，輕微震蕩混勻后稍加離心。在PCR儀上37℃反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后補(bǔ)ddH2O至總體積20μL。3.重亞硫酸氫鹽處理使用EZDNAMethylation-GoldKit對2所得樣本進(jìn)行Bisulfite處理。向步驟2樣本所在的PCR管中加入130μLCTConversionReagent混勻，在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序如下：98℃10分鐘,64℃2.5小時(shí)，4℃保存。添加600μLM-BindingBuffer到Zymo-SpinICColumn中，并將該吸附柱放入試劑盒所提供的CollectionTube中，將帶有樣本的所有反應(yīng)液共150μL加入吸附柱內(nèi)，加入10ngtRNA混勻，12000rpm離心30秒，棄去流出液。添加200μLM-WashBuffer到柱中，并將該吸附柱放入原CollectionTube中，12000rpm離心30秒，棄去流出液。添加200μLM-DesulphonationBuffer到柱中，并將該吸附柱放入原CollectionTube中，室溫20℃-30℃放置15-20分鐘，12000rpm離心30秒，棄去流出液。添加200μLM-WashBuffer到柱中，并將該吸附柱放入原CollectionTube中，12000rpm離心30秒，棄去流出液。重復(fù)進(jìn)行一次。添加18.5μLM-ElutionBuffer到柱中，并將該吸附柱放入1.5mL離心管中，12000rpm離心30秒，收集DNA溶液。4.一鏈合成4.1按照下表中前4種試劑混勻后，在PCR儀上置于65℃反應(yīng)3分鐘，降至4℃后，加入56UVazymeKlenowexo-，執(zhí)行程序：4℃5分鐘，每15秒升溫1℃至37℃，37℃30分鐘。一鏈合成所需引物oligo1序列：5'-(Biotin)TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNN-3'4.2一鏈合成第2輪，將上步驟4.1中反應(yīng)液立即置于95℃反應(yīng)1分鐘后，立即置于冰上；加入下表反應(yīng)液共2.5μL，執(zhí)行程序4℃5分鐘，每15秒升溫1℃至37℃，37℃30分鐘。4.3重復(fù)步驟4.2共3次，至此總體積變?yōu)?5μL(一鏈合成共5輪)。4.4消化單鏈DNA。加入2μL(40U)核酸外切酶I(NEBExonucleaseI)、4.11μLNEBExoIBuffer，37℃反應(yīng)1小時(shí)。使用0.9倍AmpureXP磁珠純化，樣品溶解于30μL洗脫緩沖液EB中。5.M-280磁珠釣取5.1M-280磁珠準(zhǔn)備：磁珠置于室溫30分鐘，每個(gè)樣品使用20μL磁珠進(jìn)行清洗。將每管20μLM-280磁珠置于磁力架上，吸棄上清，取50μLBeadBindingBuffer重懸磁珠，振蕩混勻，輕微離心，清洗2次，磁珠溶于30μLBeadBindingBuffer中。5.2M-280磁珠釣取：將30μL樣品與上步30μL磁珠混勻，20℃反應(yīng)15分鐘，恒溫振蕩混勻儀，每2分鐘以600rpm轉(zhuǎn)速震蕩15秒。5.3釣取樣品的清洗：將步驟5.2反應(yīng)液置于磁力架上，吸棄上清后，使用200μLBeadWashBuffer重懸振蕩清洗2次，200μLBufferEB重懸振蕩清洗2次，最終置于磁力架上，棄上清。6.二鏈合成配制二鏈合成反應(yīng)Mix：二鏈合成所需引物oligo2序列：5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNN-3'使用二鏈合成反應(yīng)Mix溶解步驟5.3中的磁珠，將帶磁珠的反應(yīng)液轉(zhuǎn)入0.2mLPCR管中，置于PCR儀上95℃，反應(yīng)45秒后，立即轉(zhuǎn)移至冰上，加入3.7μLKlenowexo-(100U)，總體積50μL。執(zhí)行程序4℃5分鐘；每15秒升溫1℃升溫至37℃，37℃90分鐘。7.PCR擴(kuò)增將6反應(yīng)液用BufferEB重懸清洗后，棄上清，樣本GT1使用公共引物及GT1-Index；樣本GT2使用公共引物及GT1-Index；樣本N使用公共引物及N-Index，使用下表PCR混合液50μL重懸磁珠，其中將6反應(yīng)液用BufferEB重懸清洗后，棄上清，使用下表PCR混合液50μL重懸磁珠；執(zhí)行程序：95℃2分鐘；(94℃80秒，65℃30秒，72℃30秒)×13循環(huán)；72℃3分鐘；4℃保存。使用0.9倍AmpureXP磁珠進(jìn)行純化，溶解于25μL洗脫緩沖液EB中，即為最終文庫。使用引物序列如下：8.文庫質(zhì)控文庫構(gòu)建完成后，使用安捷倫2100生物分析儀對所構(gòu)建的文庫進(jìn)行質(zhì)檢。如圖1，2所示，所構(gòu)建的文庫的片段主要分布在200～500bp之間，且峰值出現(xiàn)在300bp左右。文庫質(zhì)檢合格。對比例1按照Sebastien等提出的構(gòu)建單細(xì)胞全基因組重亞硫酸氫鹽測序文庫方法進(jìn)行，不同地方在于(1)在第3步重亞硫酸氫鹽處理中不加入tRNA；(2)在磁珠純化步驟中使用的磁珠規(guī)格為0.8倍AmpureXP。最終得到的文庫命名為Ser1、Ser2。表1展示了GT1、GT2、Ser1、Ser2、N、這五個(gè)文庫的數(shù)據(jù)分析結(jié)果?？芍獙τ趥鹘y(tǒng)的單細(xì)胞中重亞硫酸氫鹽測序方法，采用本發(fā)明的方法構(gòu)建的文庫在比對率(UniqueMappedRatio)方面的優(yōu)勢。表1樣品的比對率統(tǒng)計(jì)SampleGT1GT2Ser1Ser2NCleanReads15,423,79219,375,36015,447,64115，544，73412,726,610UniqueMappedReads4,212,8146,209,5342，825，0973，980，61775,022UniqueMappedRatio(％)27.33218.325.60.6InsertSize(bp)163.19158.65——158.48ErrorRate(％)5.821.69——1.94DupRatio(％)23.099.7828.832.634.68CleanReads：過濾后的Reads數(shù)；UniqueMappedReads：唯一比對到基因組上的Reads數(shù)；UniqueMappedRatio(％)：唯一比對到基因組上的Reads數(shù)占CleanReads的百分比；InsertSize(bp)：插入片段的大?。籈rrorRate(％)：Lambda基因組上被測成C的次數(shù)/C位點(diǎn)總測序次數(shù)(在得到全基因組所有堿基比對信息后計(jì)算得到的)，其中轉(zhuǎn)化率＝100(％)-ErrorRate(％)。DupRatio(％)：Reads1Reads2有重復(fù)的Reads比例。還需要說明的是，在可實(shí)施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，在本說明書中作為某一技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的任一技術(shù)特征或技術(shù)特征的組合同樣也可以適用于其它技術(shù)方案；并且，在可實(shí)施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，作為不同技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的技術(shù)特征之間也可以以任意方式進(jìn)行組合，來構(gòu)成其它技術(shù)方案。本發(fā)明也包含在上述情況下通過組合而得到的技術(shù)方案，并且這些技術(shù)方案相當(dāng)于記載在本說明書中。上述說明示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進(jìn)行改動。而本領(lǐng)域技術(shù)人員所進(jìn)行的改動和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，能夠適用于單細(xì)胞樣本的重亞硫酸氫鹽測序用文庫的構(gòu)建方法及建庫試劑盒。序列表<110>安諾優(yōu)達(dá)基因科技（北京）有限公司<120>用于單細(xì)胞全基因組重亞硫酸氫鹽測序的文庫構(gòu)建方法<130>30CN<160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>Oligo1引物tacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnnn43<210>2<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>Oligo2引物gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctnnnnnnnnn43<210>3<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>公共引物aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac45<210>4<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>GT1-Indexcaagcagaagacggcatacgagatgttaacctgtgactggagttc45<210>5<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>GT2-Indexcaagcagaagacggcatacgagatgttgcaacgtgactggagttc45<210>6<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>N-Indexcaagcagaagacggcatacgagattaattgaggtgactggagttc45當(dāng)前第1頁1 2 3