本發(fā)明屬于腫瘤免疫治療或診斷領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及抗間皮素全人抗體以及靶向間皮素的免疫效應(yīng)細(xì)胞。

背景技術(shù)：

免疫效應(yīng)細(xì)胞在腫瘤免疫應(yīng)答中的作用日益受到重視。基于免疫效應(yīng)細(xì)胞的過繼性免疫治療在部分腫瘤中取得了一定的效果，并且該種免疫治療方法可以克服抗體治療的上述缺陷，但在大多數(shù)腫瘤的療效仍不能令人滿意[Grupp SA，et al.Adoptive cellular therapy.Curr Top Microbiol Immunol.，2011；344:149-72.]。近年來，根據(jù)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)對靶細(xì)胞的識別特異性依賴于T淋巴細(xì)胞受體(T Cell Receptor，TCR)的發(fā)現(xiàn)，將針對腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原的抗體的scFv與T淋巴細(xì)胞受體的CD3ζ或FcεRIγ等胞內(nèi)信號激活基序融合成嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor，CAR)，并將其通過如慢病毒感染等方式基因修飾在T淋巴細(xì)胞表面。這種CAR T淋巴細(xì)胞能夠以主要組織兼容性復(fù)合物(Major Histocompatibility Complex，MHC)非限制性方式選擇性地將T淋巴細(xì)胞定向到腫瘤細(xì)胞并特異性地殺傷腫瘤。CAR T淋巴細(xì)胞是腫瘤免疫治療領(lǐng)域的一個(gè)新的免疫治療策略。CAR修飾的NK細(xì)胞或者NKT細(xì)胞也在臨床前研究中展示出抗腫瘤活性。

設(shè)計(jì)CAR修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞，特別T細(xì)胞時(shí)，所針對的抗原基因?qū)嶋H上是一種關(guān)鍵性的選擇，鑒于體內(nèi)基因表達(dá)的復(fù)雜性以及各種不可控因素，選擇到一個(gè)合適的用于CAR的基因是非常困難的。并且，很多腫瘤特異性的抗原，很難找到針對其的且適合于構(gòu)建CAR修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的特異性分子。

間皮素(mesothelin)是一個(gè)分子量為40-kDa的細(xì)胞表面糖蛋白。它在胰腺癌、卵巢癌以及胸腺間皮瘤等多種腫瘤中高表達(dá)。它在正常組織中，僅在胸膜、心包及腹膜的正常間皮細(xì)胞上表達(dá)。間皮素作為71kDa前體蛋白合成，其成熟部分在細(xì)胞表面上表達(dá)。該前體蛋白被弗林蛋白酶蛋白水解切割成31kDa脫落部分(稱作巨核細(xì)胞嵌合因子，或MPF)和40kDa間皮素部分)。后一種組分可經(jīng)GPI連接保持結(jié)合于細(xì)胞表面，也可經(jīng)由蛋白水解酶機(jī)制脫落。

針對間皮素為靶點(diǎn)的抗體或者其它靶向治療已經(jīng)有報(bào)道。其中CAR-T也有臨床研究的報(bào)道(Maus MV,Haas AR,Beatty GL,Albelda SM,Levine BL,Liu X,Zhao Y,Kalos M,June CH.T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans.Cancer Immunol Res.2013；1(1):26-31；Beatty GL,Haas AR,Maus MV,Torigian DA,Soulen MC,Plesa G,Chew A,Zhao Y,Levine BL,Albelda SM,Kalos M,June CH.Mesothelin-specific chimeric antigen receptor mRNA-engineered T cells induce anti-tumor activity in solid malignancies.Cancer Immunol Res.2014Feb；2(2):112-20)。但是，也發(fā)現(xiàn)用小鼠的抗人間皮素抗體所構(gòu)建的CAR-T在臨床中會出現(xiàn)抗鼠抗體及過敏等毒副作用。說明間皮素可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，但是抗體本身的屬性可能會影響其療效和毒副作用。因此，本領(lǐng)域仍然需要找到能夠克服由抗體所導(dǎo)致的療效不理想或產(chǎn)生毒副作用的問題的方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供抗間皮素全人抗體以及靶向間皮素的免疫效應(yīng)細(xì)胞。

在本發(fā)明的第一方面，提供可特異結(jié)合間皮素的全人抗體，該全人抗體選自：

(a)抗體，其包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列的CDR2、包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列的CDR3；

(b)抗體，其包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的CDR2、包含SEQ ID NO:53示氨基酸序列的CDR3；

(c)抗體，包含(a)所述抗體的重鏈可變區(qū)及(b)所述抗體的輕鏈可變區(qū)；

(d)抗體，包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列的CDR2、包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列的CDR3；

(e)抗體，包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列的CDR2、包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列的CDR3；

(f)包含(d)所述抗體的重鏈可變區(qū)及(e)所述抗體的輕鏈可變區(qū)；

(g)抗體，識別與(a)～(f)中任一項(xiàng)所述的抗體所識別的抗原決定部位相同的抗原決定部位。

在一個(gè)優(yōu)選例中，該全人抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:6中第1-123位所示；其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:6中第139-254位所示；或

該全人抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:8中第1-124位所示；其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:8中第140-247位所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的特異結(jié)合間皮素的全人抗體可以是：單鏈抗體(scFV)，單克隆抗體，結(jié)構(gòu)域抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)d片段，F(xiàn)v片段，F(xiàn)(ab’)₂片段和其衍生物，或其它形式的抗體；較佳地為單鏈抗體。

在本發(fā)明的另一方面，提供編碼所述的抗體的核酸。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，其包含所述的核酸。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種宿主細(xì)胞，其包含所述的表達(dá)載體或基因組中整合有所述的核酸。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的抗體的用途，用于制備特異性靶向表達(dá)間皮素的腫瘤細(xì)胞的靶向性藥物，抗體藥物偶聯(lián)物或多功能抗體；或用于制備診斷腫瘤的試劑，該腫瘤表達(dá)間皮素；或用于制備嵌合抗原受體修飾的免疫細(xì)胞。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的抗體的嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor，CAR)，所述的嵌合抗原受體包含順序連接的：本發(fā)明所述的抗體，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號區(qū)。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的胞內(nèi)信號區(qū)選自：CD3ζ，F(xiàn)cεRIγ，CD27，CD28，CD137，CD134，MyD88，CD40的胞內(nèi)信號區(qū)序列，或其組合。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的跨膜區(qū)包含CD8或CD28的跨膜區(qū)。

在另一優(yōu)選例中，所述的嵌合抗原受體包括如下的順序連接的抗體，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號區(qū)：

所述的抗體、CD8和CD3ζ；

所述的抗體、CD8、CD137和CD3ζ；

所述的抗體、CD28分子的跨膜區(qū)、CD28分子的胞內(nèi)信號區(qū)和CD3ζ；或

所述的抗體、CD28分子的跨膜區(qū)、CD28分子的胞內(nèi)信號區(qū)、CD137和CD3ζ。

在另一優(yōu)選例中，所述的抗體是單鏈抗體或結(jié)構(gòu)域抗體。

在另一優(yōu)選例中，所述的嵌合抗原受體具有：

SEQ ID NO:41或其中第22-353位所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:42或其中第22-454位所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:43或其中第22-498位所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:44或其中第22-501位所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:45或其中第22-543位所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:46或其中第22-346位所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:47或其中第22-447位所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:48或其中第22-491位所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:49或其中第22-494位所示的氨基酸序列；或

SEQ ID NO:50或其中第22-536位所示的氨基酸序列。

在本發(fā)明的另一方面，提供編碼所述的嵌合抗原受體的核酸。

在另一優(yōu)選例中，編碼所述的嵌合抗原受體的核酸具有：

SEQ ID NO:31或其中第473-1468位所述的核苷酸序列；

SEQ ID NO:32或其中第473-1771位所述的核苷酸序列；

SEQ ID NO:33或其中第473-1903位所述的核苷酸序列；

SEQ ID NO:34或其中第473-1912位所述的核苷酸序列；

SEQ ID NO:35或其中第473-2038位所述的核苷酸序列；

SEQ ID NO:36或其中第473-1447位所述的核苷酸序列；

SEQ ID NO:37或其中第473-1750位所述的核苷酸序列；

SEQ ID NO:38或其中第473-1882位所述的核苷酸序列；

SEQ ID NO:39或其中第473-1891位所述的核苷酸序列；

SEQ ID NO:40或其中第473-2017位所述的核苷酸序列。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，其包含所述的核酸。

在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體來源于慢病毒質(zhì)粒pWPT(或pWPT-eGFP)。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種病毒，所述的病毒包含所述載體。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的嵌合抗原受體、或所述的核酸、或所述的表達(dá)載體、或所述的病毒的用途，用于制備靶向表達(dá)間皮素的腫瘤細(xì)胞的基因修飾的免疫細(xì)胞。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的表達(dá)間皮素的腫瘤包括(但不限于)：胰腺癌、卵巢癌，胸腺間皮瘤。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種基因修飾的免疫細(xì)胞，其轉(zhuǎn)導(dǎo)有所述的核酸，或所述的表達(dá)載體或所述的病毒；或其表面表達(dá)所述的嵌合抗原受體。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的免疫細(xì)胞還攜帶外源的細(xì)胞因子的編碼序列；較佳地，所述的細(xì)胞因子包括：IL-12，IL-15或IL-21。

在另一優(yōu)選例中，所述的免疫細(xì)胞還表達(dá)另一種嵌合抗原受體，該受體不含有CD3ζ，但含有CD28的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域或者這兩者的組合。

在另一優(yōu)選例中，所述的免疫細(xì)胞還表達(dá)趨化因子受體；較佳地，所述的趨化因子受體包括：CCR2。

在另一優(yōu)選例中，所述的免疫細(xì)胞還表達(dá)能降低PD-1表達(dá)的siRNA或者阻斷PD-L1的蛋白。

在另一優(yōu)選例中，所述的免疫細(xì)胞還表達(dá)安全開關(guān)；較佳地，所述的安全開關(guān)包括：iCaspase-9，Truancated EGFR或RQR8。

在另一優(yōu)選例中，所述的免疫細(xì)胞包括：T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞或者NKT淋巴細(xì)胞。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的基因修飾的免疫細(xì)胞的用途，用于制備抑制腫瘤的藥物，所述的腫瘤是表達(dá)間皮素的腫瘤。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種多功能免疫輟合物，所述的多功能免疫輟合物包括：所述的抗體；以及與之連接(包括共價(jià)連接、偶聯(lián)、附著、吸附)的功能性分子；所述的功能性分子選自：靶向腫瘤表面標(biāo)志物的分子，抑制腫瘤的分子，靶向免疫細(xì)胞的表面標(biāo)志物的分子或可檢測標(biāo)記物。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的多功能免疫輟合物中，所述的靶向腫瘤表面標(biāo)志物的分子是結(jié)合腫瘤表面標(biāo)志物的抗體或配體；或所述的抑制腫瘤的分子是抗腫瘤的細(xì)胞因子或抗腫瘤的毒素；較佳地，所述的細(xì)胞因子包括(但不限于)：IL-12、IL-15、IFN-beta、TNF-alpha。

在另一優(yōu)選例中，所述的多功能免疫輟合物中，所述的可檢測標(biāo)記物包括：熒光標(biāo)記物、顯色標(biāo)記物。

在另一優(yōu)選例中，所述的多功能免疫輟合物中，所述的結(jié)合腫瘤表面標(biāo)志物的抗體是指：識別間皮素以外的其它抗原的抗體，所述的其它抗原包括：EGFR，EGFRvIII，mesothelin，HER2，EphA2，Her3，EpCAM，MUC1，MUC16，CEA，Claudin 18.2，葉酸受體，Claudin 6，CD3，WT1，NY-ESO-1，MAGE 3，ASGPR1或CDH16。

在另一優(yōu)選例中，所述的多功能免疫輟合物中，所述的靶向免疫細(xì)胞的表面標(biāo)志物的分子是結(jié)合T細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體，其與所述的抗體形成T細(xì)胞參與的雙功能抗體(Bispecific T cell engager，BiTE)。

在另一優(yōu)選例中，所述的多功能免疫輟合物中，所述的結(jié)合T細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體是抗CD3抗體。

在另一優(yōu)選例中，所述的抗CD3抗體是單鏈抗體(scFV)，單克隆抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)d片段，F(xiàn)v片段，F(xiàn)(ab’)₂片段和其衍生物，或其它形式的抗體；較佳地為單鏈抗體。

在另一優(yōu)選例中，所述的抗CD3抗體是人源化的，嵌合的，全人源的或鼠源的。

在另一優(yōu)選例中，所述的多功能免疫輟合物是融合多肽，本發(fā)明所述的抗體以及與之連接的功能性分子之間，還包括連接肽(接頭)。

在另一優(yōu)選例中，所述的連接肽的序列為(GlyGlyGlyGlySer)n，其中n為1到5的整數(shù)；更佳地，n＝3。

在另一優(yōu)選例中，所述的多功能免疫輟合物采用多肽給藥或基因給藥的方式。

在本發(fā)明的另一方面，提供編碼所述的多功能免疫輟合物的核酸。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多功能免疫輟合物的用途，用于制備抗腫瘤藥物，或用于制備診斷腫瘤的試劑，該腫瘤表達(dá)間皮素；或用于制備嵌合抗原受體修飾的免疫細(xì)胞；較佳地，所述免疫細(xì)胞包括：T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞或者NKT淋巴細(xì)胞。

在本發(fā)明的另一方面，提供藥物組合物(包括藥物或診斷試劑)，其包括：

所述的抗體或編碼該抗體的核酸；或

所述的免疫輟合物或編碼該輟合物的核酸；或

所述的嵌合抗原受體或編碼該嵌合抗原受體的核酸；或

所述的基因修飾的免疫細(xì)胞。

在本發(fā)明的另一方面，提供了能夠和本發(fā)明所述的抗體競爭結(jié)合間皮素的抗體。

在本發(fā)明的另一方面，提供了能夠結(jié)合如SEQ ID NO:66所示的間皮素表位的抗體。在一優(yōu)選例中，還提供了能結(jié)合SEQ ID NO：72所示的間皮素表位的抗體。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、在單噬菌體ELISA實(shí)驗(yàn)中抗體P1A6E和P3F2對人間皮素(hu-mesothelin)和對照BSA的結(jié)合情況?？贵wP1A6E和P3F2對人間皮素和陰性對照BSA的值證明篩選到的兩個(gè)抗體能特異性結(jié)合人間皮素。

圖2、ELISA實(shí)驗(yàn)檢測兩個(gè)不同的單鏈抗體P1A6E和P3F2對人間皮素及BSA的結(jié)合情況。

圖3、抗人間皮素的抗體的純化SDS-PAGE電泳圖。

圖4、單克隆抗體P1A6E和P3F2的SDS-PAGE電泳圖。

圖5、在Biacore中單克隆抗體P1A6E對不同濃度的人間皮素的結(jié)合曲線。

圖6、在Biacore中單克隆抗體P3F2對不同濃度的人間皮素的結(jié)合曲線。

圖7、通過熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)顯示的四種單鏈抗體(P1A6E，P3F2和對照抗體SS，C10)與PANC-1-MSLN細(xì)胞特異性結(jié)合的測定。

圖8、通過熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)顯示的四種單克隆抗體(P1A6E，P3F2和對照抗體SS，C10)與PANC-1-MSLN細(xì)胞特異性結(jié)合的測定。

圖9、ELISA顯示抗體scFv-P1A6E-Fc和scFv-P3F2-Fc和區(qū)域R1，R2，R3的結(jié)合情況。

圖10、ELISA顯示抗體scFv-P1A6E-Fc和scFv-P3F2-Fc和區(qū)域R1A，R1B，R1C，R1AB，R1BC的結(jié)合情況。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人前期考察了許多種腫瘤特異性基因，發(fā)現(xiàn)這類基因中相當(dāng)大一部分也表達(dá)于部分組織的正常細(xì)胞中，較難應(yīng)用于嵌合抗原受體修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞技術(shù)；有的腫瘤特異性基因具有較好的腫瘤特異性表達(dá)特性，但是，基于其設(shè)計(jì)的CAR修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞沒有腫瘤細(xì)胞殺傷活性或者活性很低，這可能是因?yàn)樵摪悬c(diǎn)可以引發(fā)腫瘤細(xì)胞分泌對免疫效應(yīng)細(xì)胞起抑制作用的因子如PD-L1。

經(jīng)過反復(fù)考察和篩選，本發(fā)明人從諸多的候選分子中找到了間皮素作為設(shè)計(jì)CAR的靶點(diǎn)。本發(fā)明人研究證明，基于間皮素抗體制備的CAR修飾的T細(xì)胞確實(shí)可以選擇性地靶向間皮素陽性的腫瘤細(xì)胞，并且對于腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。本發(fā)明人認(rèn)為，相應(yīng)的CAR修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞，特別是T細(xì)胞應(yīng)該可以用于人體腫瘤的治療。

抗間皮素抗體

本發(fā)明人從全人源天然抗體庫中篩選獲得對于間皮素結(jié)合性能良好且適用于制備基因修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的特異性抗體，并且找到了其發(fā)揮結(jié)合性能的關(guān)鍵CDR區(qū)。

本發(fā)明的抗體可以是完整的免疫球蛋白分子，也可以是抗原結(jié)合片段，包括但不限于Fab片段，F(xiàn)d片段，F(xiàn)v片段，F(xiàn)(ab’)₂片段、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、結(jié)構(gòu)域抗體，二價(jià)單鏈抗體、單鏈?zhǔn)删w抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體。

抗體的抗原結(jié)合特性可由位于重鏈和輕鏈可變區(qū)的3個(gè)特定的區(qū)域來描述，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region，CDR)，所述的CDR區(qū)將可變區(qū)間隔成4個(gè)框架區(qū)域(FR)，4個(gè)FR的氨基酸序列相對比較保守，不直接參與結(jié)合反應(yīng)。這些CDR形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過其間的FR形成的β折疊在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近，重鏈上的CDR和相應(yīng)輕鏈上的CDR構(gòu)成了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^比較同類型的抗體的氨基酸序列來確定是哪些氨基酸構(gòu)成了FR或CDR區(qū)域。CDR區(qū)是免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列，本發(fā)明的抗體的CDR區(qū)是全新的。所述抗體可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六個(gè)CDR區(qū)。

本發(fā)明的另一方面包括本文所述抗體的功能變體，如果變體能與親代抗體競爭特異性結(jié)合間皮素，且其識別腫瘤細(xì)胞表達(dá)的間皮素的能力接近于本發(fā)明實(shí)施例中提供的具體的抗體。所述功能變體可以具有保守序列修飾，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。這些修飾可以通過本領(lǐng)域己知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入，例如定向誘變和隨機(jī)PCR介導(dǎo)的誘變，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。較佳地，序列的修飾發(fā)生在所述抗體的CDR區(qū)以外的區(qū)域上。

本發(fā)明的抗體可以被應(yīng)用于制備各種靶向性抗腫瘤藥物以及診斷腫瘤的藥物，特別是應(yīng)用于制備靶向間皮素的免疫效應(yīng)細(xì)胞。

嵌合抗原受體及基因修飾的免疫細(xì)胞

本發(fā)明提供了一種表達(dá)于免疫效應(yīng)細(xì)胞(免疫細(xì)胞)表面的嵌合抗原受體，所述的嵌合抗原受體包含順序連接的：胞外結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號區(qū)，其中所述胞外結(jié)合區(qū)包含本發(fā)明的抗體。將該嵌合抗原受體表達(dá)于免疫效應(yīng)細(xì)胞的表面，可使得免疫效應(yīng)細(xì)胞對表間皮素的腫瘤細(xì)胞具有高度特異性的細(xì)胞毒性作用。

如本文所用，所述的“免疫細(xì)胞”與“免疫效應(yīng)細(xì)胞”可互換使用，其包括：T淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞或NKT細(xì)胞等。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的嵌合抗原受體中，包含的抗體為單鏈抗體，其通過CD8鉸鏈區(qū)與CD8或者CD28的跨膜區(qū)相連接，跨膜區(qū)后緊接胞內(nèi)信號區(qū)。

本發(fā)明也包括編碼所述嵌合抗原受體的核酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。

嵌合抗原受體的跨膜區(qū)可以選自CD8或CD28等蛋白的跨膜區(qū)。人CD8蛋白是個(gè)異二聚體，由αβ或者γδ兩條鏈組成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，跨膜區(qū)選自CD8α或者CD28的跨膜區(qū)。此外，CD8α鉸鏈區(qū)(hinge)是一個(gè)柔性區(qū)域，因此，CD8或CD28和跨膜區(qū)加上鉸鏈區(qū)被用于將嵌合抗原受體CAR的靶點(diǎn)識別結(jié)構(gòu)域scFv和胞內(nèi)信號區(qū)連接起來。

胞內(nèi)信號區(qū)可以選自CD3ζ，F(xiàn)cεRIγ，CD27，CD28，CD137，CD134，MyD88，CD4蛋白的胞內(nèi)信號區(qū)，及其組合。CD3分子由五個(gè)亞單位組成，其中CD3ζ亞單位(又稱CD3zeta，簡稱Z)含有3個(gè)ITAM基序，該基序是TCR-CD3復(fù)合體中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)。CD3δZ是截短的不具有ITAM基序的CD3ζ序列，在實(shí)踐中一般作為陰性對照的構(gòu)建。FcεRIγ主要分布在肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面，其含有一個(gè)ITAM基序，在結(jié)構(gòu)、分布及功能上與CD3ζ類似。此外如前所述，CD28，CD137，CD134是共刺激信號分子，在與各自配體結(jié)合后其胞內(nèi)信號區(qū)段產(chǎn)生的共刺激作用引起免疫效應(yīng)細(xì)胞(主要是T淋巴細(xì)胞)的持續(xù)增殖，并能夠提高免疫效應(yīng)細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子的水平，同時(shí)提高CAR免疫效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)的存活周期和抗腫瘤效果。

本發(fā)明的嵌合抗原受體可以按如下方式順序連接：

本發(fā)明的抗體、CD8和CD3ζ；

本發(fā)明的抗體、CD8、CD137和CD3ζ；

本發(fā)明的抗體、CD28分子的跨膜區(qū)、CD28分子的胞內(nèi)信號區(qū)和CD3ζ；或

本發(fā)明的抗體、CD28分子的跨膜區(qū)、CD28分子的胞內(nèi)信號區(qū)、CD137和CD3ζ。

及其組合，其中相關(guān)嵌合抗原受體蛋白中CD28a代表CD28分子的跨膜區(qū)，CD28b代表CD28分子的胞內(nèi)信號區(qū)。上述各種嵌合抗原受體統(tǒng)稱為scFv(間皮素)-CAR。

本發(fā)明還提供了包含上述編碼表達(dá)于免疫效應(yīng)細(xì)胞表面的嵌合抗原受體蛋白的核酸的載體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的載體是一種慢病毒質(zhì)粒載體pWPT-eGFP。該質(zhì)粒屬于第三代自滅活慢病毒載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)共有三個(gè)質(zhì)粒即編碼蛋白Gag/Pol、編碼Rev蛋白的包裝質(zhì)粒psPAX2；編碼VSV-G蛋白的包膜質(zhì)粒PMD2.G；及空載體pWPT-eGFP，其可以用于重組引入目的核酸序列，即編碼CAR的核酸序列?？蛰d體pWPT-eGFP中由延長因子-1α(elongation factor-1α，EF-1α)啟動(dòng)子調(diào)控增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)的表達(dá)。而包含編碼CAR的目的核酸序列的重組表達(dá)載體pWPT-eGFP-F2A-CAR是通過由來自口蹄疫病毒(food-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)的核糖體跳躍序列(ribosomal skipping sequence 2A)(簡稱F2A)實(shí)現(xiàn)eGFP與CAR的共表達(dá)的。應(yīng)理解，其它表達(dá)載體也是可用的。

本發(fā)明還包括包含上述載體的病毒。本發(fā)明的病毒包括包裝后的具有感染力的病毒，也包括包含包裝為具有感染力的病毒所必需成分的待包裝的病毒。本領(lǐng)域內(nèi)已知的其它可用于將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入免疫效應(yīng)細(xì)胞的病毒及其對應(yīng)的質(zhì)粒載體也可用于本發(fā)明。

本發(fā)明還提供了基因修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞，其被轉(zhuǎn)導(dǎo)有本發(fā)明的核酸或被轉(zhuǎn)導(dǎo)有本發(fā)明的上述包含所述含有該核酸的重組質(zhì)粒，或包含該質(zhì)粒的病毒。本領(lǐng)域常規(guī)的核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，包括非病毒和病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法都可以用于本發(fā)明?；诜遣《镜霓D(zhuǎn)導(dǎo)方法包括電穿孔法和轉(zhuǎn)座子法。近期Amaxa公司研發(fā)的Nucleofector核轉(zhuǎn)染儀能夠直接將外源基因?qū)爰?xì)胞核獲得目的基因的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，基于睡美人轉(zhuǎn)座子(Sleeping Beauty system)或PiggyBac轉(zhuǎn)座子等轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較普通電穿孔有較大提高，將nucleofector轉(zhuǎn)染儀與睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用已有報(bào)道[Davies JK.，et al.Combining CD19redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.Cancer Res，2010，70(10):OF1-10.]，該方法既具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率又能夠?qū)崿F(xiàn)目的基因的定點(diǎn)整合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)現(xiàn)嵌合抗原受體基因修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法是基于病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。該方法具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，外源基因能夠穩(wěn)定表達(dá)，且可以縮短體外培養(yǎng)免疫效應(yīng)細(xì)胞到達(dá)臨床級數(shù)量的時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。在該轉(zhuǎn)基因免疫效應(yīng)細(xì)胞表面，轉(zhuǎn)導(dǎo)的核酸通過轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)在其表面。通過對各種不同的培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的免疫效應(yīng)細(xì)胞具有高度特異性的腫瘤細(xì)胞殺傷效果(亦稱細(xì)胞毒性)。因此本發(fā)明的編碼嵌合抗原受體蛋白的核酸，包含該核酸的質(zhì)粒，包含該質(zhì)粒的病毒和轉(zhuǎn)導(dǎo)有上述核酸，質(zhì)?；虿《镜霓D(zhuǎn)基因免疫效應(yīng)細(xì)胞可以有效地用于腫瘤的免疫治療。

本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞還可以攜帶外源的細(xì)胞因子的編碼序列；所述的細(xì)胞因子包括但不限于：IL-12，IL-15或IL-21等。這些細(xì)胞因子具有免疫調(diào)節(jié)或抗腫瘤的活性，能增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞及活化的NK細(xì)胞的功能，或直接發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，這些細(xì)胞因子的運(yùn)用有助于所述的免疫細(xì)胞更好地發(fā)揮作用。

本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞還可以表達(dá)除了上述嵌合抗原受體以外的另一種嵌合抗原受體，該受體不含有CD3ζ，但含有CD28的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域或者這兩者的組合。

本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞還可以表達(dá)趨化因子受體；所述的趨化因子受體包括但不限于CCR2。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所述的CCR2趨化因子受體可以使得體內(nèi)的CCR2與之競爭性結(jié)合，對于阻斷腫瘤的轉(zhuǎn)移是有利的。

本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞還可以表達(dá)能降低PD-1表達(dá)的siRNA或者阻斷PD-L1的蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，競爭性阻斷PD-L1與其受體PD-1的相互作用，有利于恢復(fù)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)，從而抑制腫瘤生長。

本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞還可以表達(dá)安全開關(guān)；較佳地，所述的安全開關(guān)包括：iCaspase-9，Truancated EGFR或RQR8。

免疫輟合物

本發(fā)明還提供了多功能免疫綴合物，其包含本文所述抗體以及進(jìn)一步包含至少一種其它類型的功能性分子。所述的功能性分子選自但不限于：靶向腫瘤表面標(biāo)志物的分子，抑制腫瘤的分子，靶向免疫細(xì)胞的表面標(biāo)志物的分子或可檢測標(biāo)記物。所述抗體與所述功能性分子可以通過共價(jià)連接、偶聯(lián)、附著、交聯(lián)等方式構(gòu)成輟合物。

作為一種優(yōu)選方式，所述免疫綴合物可包含：本發(fā)明的抗體以及至少一種靶向腫瘤表面標(biāo)志物的分子或抑制腫瘤的分子。所述的抑制腫瘤的分子可以是抗腫瘤的細(xì)胞因子，或抗腫瘤的毒素；較佳地，所述的細(xì)胞因子包括(但不限于)：IL-12、IL-15、IFN-beta、TNF-alpha。所述的靶向腫瘤表面標(biāo)志物的分子例如可以與本發(fā)明的抗體協(xié)同作用，更精準(zhǔn)地靶向腫瘤細(xì)胞。

作為一種優(yōu)選方式，所述免疫綴合物可包含：本發(fā)明的抗體以及可檢測標(biāo)記物。所述的可檢測標(biāo)記物包括但不限于：熒光標(biāo)記物、顯色標(biāo)記物；如：酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料，生物發(fā)光材料、放射性材料、正電子發(fā)射金屬以及非放射性順磁性金屬離子。也可包含一個(gè)以上的標(biāo)記物。為了檢測和/或分析和/或診斷目的用于標(biāo)記抗體的標(biāo)記依賴于使用的特定檢測/分析/診斷技術(shù)和/或方法例如免疫組織化學(xué)染色(組織)樣品、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)等。對于本領(lǐng)域已知的檢測/分析/診斷技術(shù)和/或方法合適的標(biāo)記為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。

作為一種優(yōu)選方式，所述免疫綴合物可包含：本發(fā)明的抗體以及靶向免疫細(xì)胞的表面標(biāo)志物的分子。所述靶向免疫細(xì)胞的表面標(biāo)志物的分子可識別免疫細(xì)胞，其攜帶本發(fā)明的抗體達(dá)到免疫細(xì)胞，同時(shí)本發(fā)明的抗體可將免疫細(xì)胞靶向于腫瘤細(xì)胞，從而引發(fā)免疫細(xì)胞特異性地殺傷腫瘤。

作為通過直接或間接(例如通過接頭)綴合而化學(xué)產(chǎn)生免疫綴合物的一種方式，所述免疫綴合物可以作為融合蛋白而產(chǎn)生，所述融合蛋白包含本發(fā)明的抗體及合適的其它蛋白。融合蛋白可以通過本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生，例如通過構(gòu)建核酸分子以及隨后表達(dá)所述核酸分子而重組產(chǎn)生，所述核酸分子包含符合讀框的編碼抗體的核苷酸序列以及編碼合適標(biāo)記的核苷酸序列。

本發(fā)明另一方面提供了編碼本發(fā)明的至少一種抗體、其功能變體或者免疫綴合物的核酸分子。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。

本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

藥物組合物

本發(fā)明的抗體、包含該抗體的免疫輟合物以及基因修飾的免疫細(xì)胞可以應(yīng)用于制備藥物組合物或診斷試劑。所述的組合物除了包括有效量的所述抗體、免疫輟合物或免疫細(xì)胞，還可包含藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)分子本體和組合物適當(dāng)?shù)亟o予動(dòng)物或人時(shí)，它們不會產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)。

可作為藥學(xué)上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。

本發(fā)明的組合物可根據(jù)需要制成各種劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進(jìn)行施用。給藥方式例如可以采用注射或其它治療方式。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1、間皮素穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建

1.1質(zhì)粒載體的構(gòu)建

本實(shí)施例使用的載體系統(tǒng)屬于第三代自滅活慢病毒載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)共有三個(gè)質(zhì)粒即編碼蛋白Gag/Pol、編碼Rev蛋白的包裝質(zhì)粒psPAX2；編碼VSV-G蛋白的包膜質(zhì)粒PMD2.G及基于空載體pWPT(購自Addgene公司)的編碼目的基因人間皮素胞外區(qū)域和跨膜區(qū)域的重組質(zhì)粒pWPT-MSLN。

根據(jù)Genbank登錄號NM_005823，使用基于PCR搭橋的基因合成方法，合成包含信號肽、Flag tag、人間皮素胞外區(qū)域和跨膜區(qū)域的目的基因片段(SEQ ID NO:1(核苷酸)，2(氨基酸))，通過引物對pWmslnF(SEQ ID NO:3，GCTTACGCGTCCTAGCGCTACCGGTCGCCACC ATGAGGGCCTGGATC)和pWmslnR(SEQ ID NO:4，CGAGGTCGAC CTAGGCCAGGGTGGAGGCTAGGAGCAGTGCCAGGACGG)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為預(yù)變性：94℃，4min；變性：94℃，30s；退火：58℃，30s；延伸：68℃，80s；30個(gè)循環(huán)。獲得的片段理論大小為1113bp，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳確認(rèn)與理論大小一致。其中在開放閱讀框的上下游引入MluI和SalI酶切位點(diǎn)。上述獲得的目的基因由MluI和SalI雙酶切，連入同樣雙酶切的pWPT載體中，構(gòu)建成功的慢病毒載體pWPT-MSLN，經(jīng)MluI和SalI酶切鑒定及序列測定正確后進(jìn)行慢病毒包裝。

1.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒

以6×10⁶的密度接種培養(yǎng)至第6～10代的293T細(xì)胞(ATCC：CRL-11268)于10cm培養(yǎng)皿中，37℃，5％CO₂培養(yǎng)過夜準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)基為含10％胎牛血清(Sigma公司)的DMEM(Invitrogen公司)，次日，在轉(zhuǎn)染前約2小時(shí)更換培養(yǎng)液為無血清DMEM。

轉(zhuǎn)染的步驟如下：

1)將5μg目的基因質(zhì)粒pWPT-MSLN，分別與7.5μg包裝質(zhì)粒PAX2和2.5μg包膜質(zhì)粒pMD2.G，溶入500μL MillQ水中，混勻，

2)逐滴加入62μL 2.5M CaCl₂(Sigma公司)，以1200rpm/min vortex混勻，

3)最后逐滴加入500μL 2×HBS(280mM NaCl,10mM KCl，1.5mM Na₂HPO₄-,12mM葡萄糖，50mM Hepes(Sigma公司)，pH7.05,0.22μM過濾除菌)，1200rpm/min振蕩混勻10s，

4)立即逐滴加入培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，37℃，5％CO₂，培養(yǎng)4～6h后，更換為含10％胎牛血清的DMEM。

在轉(zhuǎn)染48h或72h后，離心除去細(xì)胞碎片，然后用0.45μm濾器(Millipore公司)過濾收集病毒。

1.3重組慢病毒感染PANC-1細(xì)胞

將上述收集的病毒液經(jīng)濃縮滴定后，分別感染鋪于6cm平皿內(nèi)的細(xì)胞PANC-1(購自ATCC)。感染三天后收集細(xì)胞，取部分混合克隆，使用細(xì)胞裂解液裂解后，取40μg細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后對凝膠電泳進(jìn)行免疫印跡，并用小鼠抗Flag-tag抗體染色。PBS洗滌后，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠抗體孵育，洗滌后使用ECL試劑顯色，最后進(jìn)行顯影。Western blot結(jié)果顯示，在感染了人間皮素MSLN的PANC-1細(xì)胞(即PANC-1-MSLN)中可檢測到分子量大小約38kDa的條帶，而未感染的空細(xì)胞中未檢測到相應(yīng)的條帶。其余的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存一部分，并用于下一步實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例2、人間皮素抗原的制備

根據(jù)Genbank登錄號NM_005823，使用基于PCR搭橋的基因合成方法，合成人間皮素基因片段(SEQ ID NO:1第88-942位(核苷酸)，(SEQ ID NO:12第30-314位(氨基酸))，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物通過NheI/BglII插入到質(zhì)粒載體pCMV-V5(該載體在多克隆位點(diǎn)下游融合表達(dá)6×His標(biāo)簽，購自上海銳勁生物技術(shù)有限公司)，并轉(zhuǎn)化于宿主菌TOP10中，挑取克隆通過PCR鑒定陽性克隆并通過測序確認(rèn)，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒V5-MSLN。

將上述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生長良好的HEK-293F細(xì)胞，37℃，5％CO₂，125rpm搖床連續(xù)培養(yǎng)7天，4000rpm離心10min，去除沉淀，收集上清，并用0.45μm濾膜過濾，將處理好的樣品以HisTrap(購自GE)親和層析柱進(jìn)行純化，最終獲得純化的人間皮素蛋白，鑒定結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例3、人間皮素單鏈抗體的篩選

3.1基于噬菌體展示的人間皮素特異性結(jié)合抗體的篩選

利用噬菌體展示技術(shù)，從全人源天然抗體庫中篩選人間皮素特異性抗體。為此目的，在400ml 2×YT/氨芐青霉素培養(yǎng)基接種噬菌體展示全人源單鏈抗體天然庫的甘油菌(購自上海銳勁生物技術(shù)有限公司)，使細(xì)胞密度達(dá)到OD₆₀₀＝0.1，在37℃和200rpm條件下振蕩培養(yǎng)直至細(xì)胞密度達(dá)到OD₆₀₀＝0.5。用10¹²pfu的M13KO7輔助噬菌體(購自Invitrogen)感染，在30℃和50rpm條件下培養(yǎng)30分鐘。加入50mg/l卡那霉素后在37℃和200rpm條件下振蕩培養(yǎng)30分鐘后，通過離心(15分鐘，1600×g，4℃)分離沉淀，重懸于400ml 2×YT/氨芐青霉素/卡那霉素培養(yǎng)基，在37℃和200rpm條件下振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。最后細(xì)胞通過離心(20分鐘，5000×g，4℃)分離沉淀并丟棄，上清用0.45μm規(guī)格濾膜過濾后，加入1/4體積20％(w/v)PEG8000、2.5M NaCl溶液并在冰浴中保溫1小時(shí)沉淀噬菌體顆粒。隨后離心沉淀(20分鐘，8000×g，4℃)，棄上清，將噬菌體重懸于25ml預(yù)冷PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，8mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄)中，離心(5分鐘，20000×g，4℃)。向上清液加入1/4體積20％(w/v)PEG8000、2.5M NaCl溶液，并冰浴30分鐘再次沉淀噬菌體顆粒。離心沉淀(30分鐘，20000×g，4℃)，再次將噬菌體沉淀重懸于2ml預(yù)冷PBS中，在冰上保持30分鐘并離心(30分鐘，17000×g，4℃)。上清液與含4％(w/v)BSA的PBS溶液以1:1混合，置于旋轉(zhuǎn)混合器上，室溫下保溫30分鐘，然后直接用于篩選。

利用上述噬菌體抗體庫，針對生物素標(biāo)記的人間皮素重組蛋白實(shí)施了四輪定向篩選，篩選方案如下：該噬菌體抗體庫與生物素標(biāo)記的抗人間皮素，在室溫下保溫2小時(shí)，然后與經(jīng)封閉液2％(w/v)BSA(牛血清白蛋白)封閉過的鏈霉親和素磁珠MyOne C1(購自Invitrogen)在室溫下保溫30分鐘。隨后用PBST(含0.1％吐溫-20)緩沖液洗滌磁珠,除去非特異性結(jié)合或結(jié)合能力較弱的噬菌體。結(jié)合能力強(qiáng)的噬菌體，則用甘氨酸-鹽酸(pH 2.2)從磁珠上洗脫下來，用Tris中和液(pH 9.1)中和后，用于感染處于對數(shù)生長中期的大腸桿菌ER2738，并被用于下一輪篩選。在四輪篩選中，磁珠的用量分別為50μl、20μl、10μl和10μl，生物素標(biāo)記的人間皮素濃度分別為100nM、10nM、5nM和1nM,PBST的洗滌次數(shù)分別為10次、10次、15次和20次。

3.2人間皮素特異性結(jié)合抗體的鑒定

從第四輪篩選所得的克隆中隨機(jī)挑選96個(gè)，并用單噬菌體ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))分析其與人間皮素的結(jié)合能力。為此目的，每個(gè)單菌落接種300μl 2×YT/氨芐青霉素培養(yǎng)基(含2％葡萄糖)于96孔深孔培養(yǎng)板，并在37℃和250rpm下振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。用20μl培養(yǎng)物接種到500μl 2×YT/氨芐青霉素培養(yǎng)基(含0.1％葡萄糖)，在37℃和250rpm下振蕩培養(yǎng)1.5小時(shí)。準(zhǔn)備輔助噬菌體溶液，取75μl的M13KO7(滴度為3×10¹²pfu/ml)混入到15ml 2×YT培養(yǎng)基中，50μl/孔加到培養(yǎng)板中。在37℃和150rpm條件培養(yǎng)30分鐘，然后加入準(zhǔn)備好的卡那霉素溶液50μl/孔(取180μl的50mg/ml卡那霉素，加入到15ml 2×YT培養(yǎng)基)，在37℃和250rpm下振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。最后離心沉淀細(xì)胞(30分鐘，5000×g，4℃)，上清轉(zhuǎn)移到新的96孔深孔培養(yǎng)板。

為進(jìn)行單噬菌體ELISA，在96孔MediSorp ELISA板(購自Nunc)上分別使用100ng/孔抗原人間皮素以及陰性對照蛋白BSA(100μl/孔)，在4℃包被過夜。每個(gè)孔用含2％BSA(w/v)的PBST封閉。隨后用PBST清洗孔三次并排凈。然后加入100μl/孔上面制備的每種噬菌體溶液到板上各孔中。37℃保溫2小時(shí)后，用PBST洗滌三次。為了檢測結(jié)合的噬菌體，將抗M13抗體過氧化物歧化酶偶聯(lián)物(購自GE Healthcare)以1:5000稀釋于PBST中，并取100μl加到每個(gè)孔中。37℃保溫1小時(shí)后用PBST漂洗孔三次，然后用PBS漂洗三次。最后吸取50μl TMB底物加入到孔中，并在室溫下顯色10分鐘，隨后加入每孔50μl的2M H₂SO₄終止顯色反應(yīng)。用酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio-Rad)在450nm測量消光值。結(jié)合測序分析，觀察到兩個(gè)不同的單鏈抗體P1A6E(SEQ ID NO:5(核苷酸)，6(氨基酸))和P3F2(SEQ ID NO:7(核苷酸)，8(氨基酸))，在ELISA實(shí)驗(yàn)中對人間皮素(hu-mesothelin)結(jié)合信號較強(qiáng)，對BSA無結(jié)合(圖2)。

SEQ ID NO:5(核苷酸)

caggtacagctggaacagtcaggtctaggactggtgaagccctcgcagaccctctctctcacctgtgccatctccggggacactgtctctagcgacagtgctgcttggaactggatcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtttaatgattatgcagtatctgtgaaaggtcgaataaccatcaactcagacacatccaagaaccagttctccctgcagttgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattattgtgcaagaagtaatagttactactactacgctatggacgtctggggccaaggcaccctggtcaccgtctcgagtggtggaggcggttcaggcggaggtggttctggcggtggcggatcgcaggctgtgctgactcagccgtcttccctctctgcatctcctggagcatcagccagtctcacctgcaccttgcgcagtggcatcaatgttggtatctacaggatatactggtaccaacagaggccagggagtcctccccagattctcctgacttacaaatcagactcagataagtaccagggctctggagtccccagtcgcttctctggatccaaagatgcttcggccaatgcagggattttactcatctctgggctccagtctgaagatgaggctgactattactgcatgatttggcacagcggcggttgggtgttcggcggagggaccaaggtcaccgtcctaggt

SEQ ID NO:6(氨基酸)

QVQLEQSGLGLVKPSQTLSLTCAISGDTVSSDSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWFNDYAVSVKGRITINSDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSNSYYYYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGIYRIYWYQQRPGSPPQILLTYKSDSDKYQGSGVPSRFSGSKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGGWVFGGGTKVTVLG

其中，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:6中第1-123位所示；其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:6中第139-254位所示。

其中，輕鏈CDR1氨基酸序列為TLRSGINVGIYRIY(SEQ ID NO:51)，輕鏈CDR2氨基酸序列為YKSDSDKYQGS(SEQ ID NO:52)，輕鏈CDR3氨基酸序列為MIWHSGGWV(SEQ ID NO:53)；重鏈CDR1氨基酸序列為GDTVSSDSAAWN(SEQ ID NO:54)，重鏈CDR2氨基酸序列為RTYYRSKWFNDYAVSVKG(SEQ ID NO:55)，重鏈CDR3氨基酸序列為SNSYYYYAMDV(SEQ ID NO:56)。

SEQ ID NO:7(核苷酸)

cagatgcagctagtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagtagtcggagtgggactacggtggtaaatcatgatgcttttgatatctgggggaaagggaccacggtcaccgtctcgagtggtggaggcggttcaggcggaggtggttctggcggtggcggatcggacatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcgtctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagccaggtcattagccgtgctttagcctggtatcaacaaacaccagggaaacctcctaaactcctgatctatgatgcctccaatttgcagagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagccgcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagtttaatagttaccctctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaacgt

SEQ ID NO:8(氨基酸)

QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASSRSGTTVVNHDAFDIWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQVISRALAWYQQTPGKPPKLLIYDASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKLEIKR

其中，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:8中第1-124位所示；其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:8中第140-247位所示。

其中，輕鏈CDR1氨基酸序列為RASQVISRALA(SEQ ID NO:57)，輕鏈CDR2氨基酸序列為DASNLQS(SEQ ID NO:58)，輕鏈CDR3氨基酸序列為QQFNSYPLT(SEQ ID NO:59)；重鏈CDR1氨基酸序列為GYTFTSYYMH(SEQ ID NO:60)，重鏈CDR2氨基酸序列為IINPSGGSTSYAQKFQG(SEQ ID NO:61)，重鏈CDR3氨基酸序列為SRSGTTVVNHDAFDI(SEQ ID NO:62)。

實(shí)施例4、單鏈抗體和單克隆抗體的制備

4.1人間皮素單鏈抗體的制備

使用引物對V5-P1A6E-F(SEQ ID NO:9)和V5-P1A6E-R(SEQ ID NO:10)從所得克隆中擴(kuò)增出scFv-P1A6E片段；使用引物對V5-P3F2-F(SEQ ID NO:11)和V5-P3F2-R(SEQ ID NO:12)擴(kuò)增出scFv-P3F2片段，通過NheI/BamHI雙酶切，以T4DNA連接酶于同樣以NheI/BamHI雙酶切載體質(zhì)粒pCMV-V5-Fc(該載體在多克隆位點(diǎn)下游融合表達(dá)人抗體IgG1的Fc片段，以下簡稱V5-Fc，購自上海銳勁生物技術(shù)有限公司)連接并轉(zhuǎn)化于宿主菌TOP10中，挑取克隆通過PCR鑒定陽性克隆并通過測序確認(rèn)，分別獲得V5-scFv-P1A6E-Fc和V5-scFv-P3F2-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒。

SEQ ID NO:9：ACAGTGCTAGCACAGGTACAGCTGGAACAG；

SEQ ID NO:10：TTGTCGGATCCACCTAGGACGGTGACC；

SEQ ID NO:11：ACAGTGCTAGCACAGATGCAGCTAGTGC；

SEQ ID NO:12：TTGTCGGATCCACGTTTGATCTCCAGC。

將上述表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染生長良好的HEK-293F細(xì)胞，37℃，5％CO₂，125rpm搖床連續(xù)培養(yǎng)7天，4000rpm離心10min，去除沉淀，收集上清，并用0.45μm濾膜過濾，將處理好的樣品以protein A(購自GE)親和柱進(jìn)行親和純化，最終獲得純化的抗體-Fc融合蛋白scFv-P1A6E-Fc和scFv-P3F2-Fc，鑒定結(jié)果如圖3所示。

4.2人間皮素單克隆抗體的制備

在本實(shí)施例中，單克隆抗體的表達(dá)使用雙質(zhì)粒系統(tǒng)，需要分別把抗體重鏈可變區(qū)基因構(gòu)建到包含了人IgG1CH基因的pIH質(zhì)粒，把抗體輕鏈可變區(qū)基因構(gòu)建到包含了人IgG CL基因的pIK質(zhì)粒(質(zhì)粒購自上海銳勁生物技術(shù)有限公司)。

使用引物對P1A6E-HF(SEQ ID NO:13，gcctttcctggtttcctgtctcaggtacagctggaacagtc)和P1A6E-HR(SEQ ID NO:14，GATGGGCCCTTGGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAG)從模板質(zhì)粒V5-scFv-P1A6E-Fc中擴(kuò)增出VH-P1A6E片段。使用引物對HF1F(SEQ ID NO:15，ggctaactagagaacccactgc)和HF1R(SEQ ID NO:16，AGACAGGAAACCAGGAAAGGC)從模板質(zhì)粒pIH中擴(kuò)增出HF1片段；使用引物對HF3F(SEQ ID NO:17，gcctccaccaagggcccatc)和HF3R(SEQ ID NO:18，gacaatcttagcgcagaagtc)從模板質(zhì)粒pIH中擴(kuò)增出HF3片段。三個(gè)片段等摩爾比混合后進(jìn)行拼接PCR，片段回收后經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI/NotI雙酶切，以T4DNA連接酶于同樣以NheI/NotI雙酶切載體質(zhì)粒pIH連接并轉(zhuǎn)化于宿主菌TOP10中，挑取克隆通過PCR鑒定陽性克隆并通過測序確認(rèn)，獲得pIH-P1A6E真核表達(dá)質(zhì)粒。以同樣的方式也獲得了pIH-P3F2真核表達(dá)質(zhì)粒。

為獲得pIK-P1A6E真核表達(dá)質(zhì)粒，使用引物對P1A6E-LF(SEQ ID NO:19，ctttggtttccaggtgcaagatgtcaggctgtgctgactcag)和P1A6E-LR(SEQ ID NO:20，GAAGACAGATGGT GCAGCCACCGTACCTAGGACGGTGACCTTG)從模板質(zhì)粒V5-scFv-P1A6E-Fc中擴(kuò)增出VL-P1A6E片段；使用引物對LF1F(SEQ ID NO:21，ggctaactagagaacccactgc)和LF1R(SEQ ID NO:22，ACATCTTGCACCTGGAAACCAAAG)從模板質(zhì)粒pIK中擴(kuò)增出LF1片段；使用引物對LF3F(SEQ ID NO:23，acggtggctgcaccatctgtcttc)和LF3R(SEQ ID NO:24，GACAATCTTAGCGCAGAAGTC)從模板質(zhì)粒pIK中擴(kuò)增出LF3片段。三個(gè)片段等摩爾比混合后進(jìn)行拼接PCR，片段回收后經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRV/NotI雙酶切，以T4DNA連接酶于同樣以EcoRV/NotI雙酶切載體質(zhì)粒pIK連接并轉(zhuǎn)化于宿主菌TOP10中，挑取克隆通過PCR鑒定陽性克隆并通過測序確認(rèn)。以同樣的方式也獲得了pIK-P3F2真核表達(dá)質(zhì)粒。

將表達(dá)質(zhì)粒pIH-P1A6E和pIK-P1A6E等摩爾混合，pIH-P3F2和pIK-P3F2等摩爾混合，分別轉(zhuǎn)染生長良好的HEK-293F細(xì)胞，37℃，5％CO₂，125rpm搖床連續(xù)培養(yǎng)7天，4000rpm離心10min，去除沉淀，收集上清，并用0.45μm濾膜過濾，將處理好的樣品以protein A(購自GE)親和柱進(jìn)行親和純化，最終獲得純化的重組單克隆抗體P1A6E和P3F2，鑒定結(jié)果如圖4所示。

實(shí)施例5、人間皮素抗體的親和力

為定量分析抗體與人間皮素的結(jié)合，使用Biacore T200系統(tǒng)(購自GE)通過捕獲法分別測量了P1A6E和P3F2單鏈抗體和單克隆抗體的親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。根據(jù)制造商的說明，用NHS/EDC偶聯(lián)通過伯氨基將抗人IgG(Fc)的抗體(購自GE)偶聯(lián)到傳感器芯片CM5的羧甲基葡聚糖表面。測量在25℃、30μl/min、1×HBS-EP+工作緩沖液中進(jìn)行，再生條件為3M MgCl₂、10μl/min作用30秒。在每一輪測試循環(huán)中，待測試抗體首先被捕獲到芯片上，一定濃度的分析物(人間皮素)流過芯片表面，由于產(chǎn)生SPR信號，人間皮素與被捕獲的抗體的相互作用可以被檢測。檢測信號被定義為共振單位(RU)，對時(shí)間(單位為秒)作圖可以得到相應(yīng)的結(jié)合曲線和解離曲線。在不同的測試循環(huán)中，人間皮素的濃度分別為10nM、20nM、40nM、80nM和160nM。用Biacore T200evaluation software評估所得作用曲線，并計(jì)算親和力KD值。圖5和圖6分別顯示了單克隆抗體P1A6E和P3F2在Biacore親和力測定實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)力學(xué)曲線。P1A6E和P3F2的單鏈抗體和單克隆抗體分別對人間皮素的結(jié)合數(shù)據(jù)總結(jié)在表1中。

表1、P1A6E和P3F2的單鏈抗體和單克隆抗體對人間皮素的親和力參數(shù)

實(shí)施例6、人間皮素抗體的細(xì)胞結(jié)合特性(單鏈抗體及單克隆抗體)

通過熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)(Guava 8HT，由Millipore公司提供)分析抗體scFv-P1A6E-Fc和scFv-P3F2-Fc各自與細(xì)胞表面的mesothelin的結(jié)合能力。

具體方法如下：

1)取對數(shù)生長期的細(xì)胞PANC-1-MSLN和PANC-1分別接種到6cm平皿中，接種細(xì)胞密度約為90％，37℃孵箱過夜培養(yǎng)。

2)使用10mM的EDTA消化細(xì)胞，200g×5min離心收集細(xì)胞。以1×10⁶～1×10⁷/mL的濃度重懸于1％含小牛血清的磷酸鹽緩沖液(NBS PBS)中，按100ul/管的量加入流式專用管中。

3)200g×5min離心，棄上清。

4)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入待測抗體P1A6E和P3F2，同時(shí)兩個(gè)陽性對照組加入抗體ss和C10(購自上海銳勁生物技術(shù)有限公司)作為陽性對照，另一個(gè)對照組為不加抗體的PBS空白對照。各抗體的終濃度均為20μg/ml，每管加入100ul。冰浴，45分鐘。

5)每管加入2ml 1％NBS PBS，以200g×5min離心，共二遍。

6)棄上清，加入1:100稀釋的羊抗人抗體-FITC(來自上海業(yè)力生物科技有限公司)，每管加入100ul。冰浴，45分鐘。

7)每管加入2ml 1％NBS PBS，以200g×5min離心，共二遍。

8)棄上清，重懸于300ul 1％NBS PBS中，流式細(xì)胞儀檢測。

9)應(yīng)用流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析軟件Flowjo7.6分析數(shù)據(jù)。

流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，四種抗體P1A6E和P3F2、以及對照抗體SS和C10，無論是單鏈抗體形式(圖7)還是單克隆全抗形式(圖8，其熒光峰在PANC-1-MSLN細(xì)胞上與空白對照(PBS)相比有顯著的差異(圖7B，圖8B)，在PANC-1細(xì)胞上無明顯差別(圖7A，圖8A)，表明其都可以特異識別人間皮素穩(wěn)定表達(dá)的PANC-1-MSLN細(xì)胞，但是與人間皮素表達(dá)陰性的PANC-1細(xì)胞不結(jié)合，表明這四個(gè)抗體可以特異性識別人間皮素?？贵wP1A6E和P3F2的熒光峰明顯強(qiáng)于對照抗體SS和C10，表明P1A6E和P3F2對PANC-1-MSLN細(xì)胞的結(jié)合效率要高于SS和C10。

實(shí)施例7、含有人間皮素抗體的CAR T的制備

構(gòu)建嵌合抗原受體，本發(fā)明示例的嵌合抗原受體各部分的連接順序如表2。

表2

注：CD28a代表CD28分子的跨膜區(qū)，CD28b代表CD28分子的胞內(nèi)信號區(qū)。

本實(shí)施例中使用的慢病毒質(zhì)粒載體系統(tǒng)屬于第三代慢病毒四質(zhì)粒系統(tǒng)，該系統(tǒng)共有四個(gè)質(zhì)粒即編碼VSV-G蛋白的包膜質(zhì)粒pCMV-VSV-G(購自addgene)、編碼Rev蛋白的包裝質(zhì)粒pRSV-Rev(購自addgene)、編碼Gal和Pol的pMDLg/pRRE(購自addgene)及基于空載體pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(購自addgene)的編碼目的基因CAR的重組表達(dá)載體。所有CAR的基因載體啟動(dòng)子均利用已經(jīng)公開的專利201310164725.X中的載體上延長因子-1α(elongation factor-1α，EF-1α)。構(gòu)建具體方法如下：

(1)獲得啟動(dòng)子片段：利用專利201310164725.X中的載體pWPT-eGFP-F2A-CAR，引物pwpxlF(SEQ ID NO:25，5’-gcaggggaaagaatagtaga ca-3’)和pWPT-MluIR(SEQ ID NO:26，5’-aggccagcggcaggagcaaggcggtcactggtaaggccatggtggcgaccggtagc-3’)，PCR擴(kuò)增出帶有啟動(dòng)子EF-1α的片段。

(2)獲得目的CAR片段：分別利用前述獲得V5-scFv-P1A6E-Fc和V5-scFv-P3F2-Fc為模板，引物P1A6E-F(SEQ ID NO:27，5’-ctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtacagc tggaaca-3’)和引物SEQ ID NO:28，P1A6E-R(5’-gcggcgctggcgtcgtggtacctaggacggtgacc-3’)；引物P3F2-F(SEQ ID NO:29，5’ctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcagatgcagctagt gca-3’)和P3F2-R(SEQ ID NO:30，5’gcggcgctggcgtcgtggtacgtttgatctccag-3’)，擴(kuò)增出目的CAR片段P1A6E部分和P3F2部分

(3)通過PCR分別獲得CAR的第一代、第二代、第三代的共有序列和陰性對照序列：分別以室專利201310164725.X中的pWPT-eGFP-F2A-GPC3-δZ、pWPT-eGFP-F2A-GPC3-Z、pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z、pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28BBZ為模板，以引物HF(SEQ ID NO:63，5’accacgacgccagcgccgcgaccac)和引物pwpxlR(SEQ ID NO:64，5’-tagcgtaaaaggagcaacatag)，分別獲得片段CD8-CD3δzeta(δZ)、CD8-CD3zeta(Z)、CD28a-CD28b-CD3zeta(28Z)和CD28a-CD28b-CD137-CD3zeta(28BBZ)序列。

(4)參考專利US 8,911,993 B2(COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF CANCER)中的BBZ序列，使用基于PCR搭橋的基因合成方法，合成共有序列CD8-CD137-CD3zeta(BBZ)片段部分。

(5)將上述獲得的啟動(dòng)子片段、目的CAR片段分別與共有序列片段CD8-CD3δzeta(δZ)、CD8-CD3zeta(Z)、CD8-CD137-CD3zeta(BBZ)、CD28a-CD28b-CD3zeta(28Z)和CD28a-CD28b-CD137-CD3zeta(28BBZ)序列部分常規(guī)搭橋后，再用引物pwpxlF和pwpxlR擴(kuò)增，獲得含有EF-1α和目的基因CAT的片段，分別稱為：

P1A6E-δZ(SEQ ID NO:31)；

P1A6E-Z(SEQ ID NO:32)；

P1A6E-BBZ(SEQ ID NO:33)；

P1A6E-28Z(SEQ ID NO:34)；

P1A6E-28BBZ(SEQ ID NO:35)。

P3F2-δZ(SEQ ID NO:36)；

P3F2-Z(SEQ ID NO:37)；

P3F2-BBZ(SEQ ID NO:38)；

P3F2-28Z(SEQ ID NO:39)；

P3F2-28BBZ(SEQ ID NO:40)。

(6)將上述步驟中獲得的帶有啟動(dòng)子和目的基因CAR的片段，通過ClaI和SalI雙酶切后連接于同樣酶切的載體pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE中，從而構(gòu)建表達(dá)各嵌合抗原受體的慢病毒載體。構(gòu)建成功的載體經(jīng)Mlu和Sal酶切鑒定正確后測序核對，可以準(zhǔn)備用于慢病毒包裝。

得到的含有各目的CAR的載體如下：：

pRRLSIN-EF1α-P1A6E-δZ；

pRRLSIN-EF1α-P1A6E-Z；

pRRLSIN-EF1α-P1A6E-BBZ；

pRRLSIN-EF1α-P1A6E-28Z；

pRRLSIN-EF1α-P1A6E-28BBZ；

pRRLSIN-EF1α-P3F2-δZ；

pRRLSIN-EF1α-P3F2-Z；

pRRLSIN-EF1α-P3F2-BBZ；

pRRLSIN-EF1α-P3F2-28Z；

pRRLSIN-EF1α-P3F2-28BB。

通過以上構(gòu)建，分別可獲得十個(gè)CAR多肽序列，稱為：

P1A6E-δZ(SEQ ID NO:41)；

P1A6E-Z(SEQ ID NO:42)；

P1A6E-BBZ(SEQ ID NO:43)；

P1A6E-28Z(SEQ ID NO:44)；

P1A6E-28BBZ(SEQ ID NO:45)。

P3F2-δZ(SEQ ID NO:46)；

P3F2-Z(SEQ ID NO:47)；

P3F2-BBZ(SEQ ID NO:48)；

P3F2-28Z(SEQ ID NO:49)；

P3F2-28BBZ(SEQ ID NO:50)。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T包裝慢病毒

以6×10⁶的密度接種培養(yǎng)至第6～10代的HEK-293T細(xì)胞(ATCC：CRL-11268)于10cm培養(yǎng)皿中，37℃，5％CO₂培養(yǎng)過夜準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM。

轉(zhuǎn)染的步驟如下：

A液配制：將10μg的目的基因質(zhì)粒pRRLSIN-cPPT.EF-1α-CAR(選自pRRLSIN-EF1α-P1A6E-δZ、pRRLSIN-EF1α-P1A6E-Z、pRRLSIN-EF1α-P1A6E-BBZ、pRRLSIN-EF1α-P1A6E-28Z、pRRLSIN-EF1α-P1A6E-28BBZ；pRRLSIN-EF1α-P3F2-Z、pRRLSIN-EF1α-P3F2-BBZ、pRRLSIN-EF1α-P3F2-28Z、pRRLSIN-EF1α-P3F2-28BBZ)，分別與7.5μg包裝質(zhì)粒pMDLg RRE和pRSV-REV、以及3μg包膜質(zhì)粒pCMV-VSV-G，溶入800μL的無血清DMEM培養(yǎng)液中，混勻。

B液配制：將60μg PEI(聚乙烯亞胺，購自Polysciences公司)溶解于800μL的無血清DMEM培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫孵育5min。

轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成：將A液加入B液中輕輕混合，加入后立即渦旋混合或輕輕混勻，室溫下孵育20min。

將轉(zhuǎn)染復(fù)合物1.6ml滴加入HEK-293T細(xì)胞中，4-5h小時(shí)后，用2％FBS的DMEM培基給轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞換液。

在轉(zhuǎn)染72h后，使用0.45μm濾器過濾收集病毒，然后采用Beckman Optima L-100XP超速離心機(jī)28000rpm，4℃離心2小時(shí)，棄離心上清，離心所得沉淀用1/10～1/50原液體積的AIM-V培養(yǎng)液(購自Invitrogen公司)進(jìn)行重懸，以100μL/管分裝凍存于-80℃，以待病毒滴定或感染T淋巴細(xì)胞。

實(shí)施例8、重組慢病毒感染CTL細(xì)胞

由健康人外周血通過密度梯度離心法獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞(上海市血液中心提供)，外周血單個(gè)核細(xì)胞通過CTL細(xì)胞磁珠(購自Stem Cell Technologies)負(fù)性分選方法獲得CTL，分選后的CTL細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測CTL細(xì)胞的純度，以CTL細(xì)胞的陽性率≥95％為宜進(jìn)行下一步操作。以約1×10⁶/mL密度加入Quantum 007淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基液(購自PAA公司)培養(yǎng)并以細(xì)胞：磁珠比例為1:1加入同時(shí)包被有抗CD3和CD28抗體的磁珠(Invitrogen公司)和終濃度300U/mL的重組人IL-2(購自上海華新生物高技術(shù)有限公司)刺激培養(yǎng)24h。然后以MOI≈5用上述重組慢病毒感染CTL細(xì)胞。感染后的細(xì)胞每隔一天采用5×10⁵/mL的密度進(jìn)行傳代，同時(shí)在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中補(bǔ)加終濃度300U/mL的重組人IL-2。

感染的CTL細(xì)胞在培養(yǎng)第8天時(shí)通過流式細(xì)胞檢測各不同嵌合抗原受體表達(dá)。首先，感染后的CAR T細(xì)胞與生物素標(biāo)記的人間皮素重組蛋白37℃孵育1h，D-PBS洗2次，然后加入PE-標(biāo)記的streptavidin在37℃孵育40min。D-PBS洗3次后流式細(xì)胞儀檢測陽性細(xì)胞比率。以未感染的T淋巴細(xì)胞作為陰性對照，表達(dá)不同嵌合抗原受體的病毒感染CTL細(xì)胞其陽性率如表3所示。該陽性率結(jié)果表明，通過慢病毒感染的方法能夠獲得一定陽性率的CAR⁺CTL細(xì)胞。

表3

CTL細(xì)胞在分別感染包裝有不同嵌合抗原受體的病毒后，以細(xì)胞密度為5×10⁵/ml隔天傳代培養(yǎng)、計(jì)數(shù)、并對傳代的細(xì)胞培養(yǎng)液補(bǔ)加IL-2(終濃度為300U/ml)，培養(yǎng)第11天約有20～40倍的擴(kuò)增，表明表達(dá)不同嵌合抗原受體的CTL細(xì)胞在體外能夠進(jìn)行一定數(shù)量的擴(kuò)增，為后續(xù)體外毒性試驗(yàn)及體內(nèi)試驗(yàn)提供了保證。

實(shí)施例9、表達(dá)嵌合抗原受體的T淋巴細(xì)胞的體外毒性效果實(shí)驗(yàn)

體外毒性實(shí)驗(yàn)使用的材料如下：

如表4所示的間皮素陰性胰腺癌細(xì)胞系(PANC-1)和轉(zhuǎn)染了間皮素基因的PANC-1(PANC-1-MSLN)細(xì)胞系作為靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞為如實(shí)施例4所驗(yàn)證的體外培養(yǎng)12天的FACS檢測嵌合抗原受體表達(dá)的陽性細(xì)胞記為嵌合抗原受體陽性(CAR⁺)的CTL，效靶比視情況分別為3:1，1:1和1:3，靶細(xì)胞數(shù)量為10000個(gè)/孔，根據(jù)不同效靶比對應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞。各組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，取5個(gè)復(fù)孔的平均值。檢測時(shí)間為第18h。

其中各實(shí)驗(yàn)組和各對照組如下：

各實(shí)驗(yàn)組：各靶細(xì)胞+表達(dá)不同嵌合抗原受體的CTL，

對照組1：靶細(xì)胞最大釋放LDH，

對照組2：靶細(xì)胞自發(fā)釋放LDH，

對照組3：效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放LDH。

檢測方法：采用CytoTox 96非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Promega公司)進(jìn)行。該方法是基于比色法的檢測方法，可替代⁵¹Cr釋放法。CytoTox檢測定量地測量乳酸脫氫酶(LDH)。LDH是一種穩(wěn)定的胞質(zhì)酶，在細(xì)胞裂解時(shí)會釋放出來，其釋放方式與⁵¹Cr在放射性分析中的釋放方式基本相同。釋放出的LDH培養(yǎng)基上清中，可通過30分鐘偶聯(lián)的酶反應(yīng)來檢測，在酶反應(yīng)中LDH可使一種四唑鹽(INT)轉(zhuǎn)化為紅色的甲臜(formazan)。生成的紅色產(chǎn)物的量與裂解的細(xì)胞數(shù)成正比。具體參照CytoTox 96非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書。

細(xì)胞毒性計(jì)算公式為：

具體如表4所示，本發(fā)明的抗間皮素的單鏈抗體(P1A6E，P3F2)的CAR均有明顯的殺傷間皮素陽性胰腺癌細(xì)胞的活性，其中第二代和第三代的抗mesothelin的CAR T細(xì)胞比第一代抗腫瘤活性略強(qiáng)。mock組沒有明顯殺傷。此外，所有CAR T細(xì)胞對間皮素陰性的PANC-1胰腺癌細(xì)胞均沒有殺傷活性。這些結(jié)果表明本發(fā)明的抗間皮素的CAR-T細(xì)胞(包括一、二、三代CAR T)可以選擇性地針對間皮素陽性的胰腺癌細(xì)胞，并進(jìn)行有效的殺傷。此外，本發(fā)明的抗間皮素的第一、二、三代CART對間皮素陽性腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)效靶比梯度依賴性即效靶比越高細(xì)胞毒性作用越強(qiáng)。

表4、融合表達(dá)單鏈抗體的CAR T細(xì)胞的體外抗腫瘤細(xì)胞毒性

實(shí)施例10、人間皮素抗體的表位分析

通過PCR從SEQ ID NO:1中擴(kuò)增人間皮素基因片段，通過NheI/BamHI雙酶切，將人間皮素基因片段連接至含有鼠Fc段的真核表達(dá)載體pCMV-V5-muFc中。根據(jù)實(shí)施例4瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293F細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)處理后通過protein G(購自GE)親和柱進(jìn)行親和純化，最終獲得純化的人間皮素片段-muFc融合蛋白，然后通過ELISA鑒定抗體scFv-P1A6E-Fc和scFv-P3F2-Fc的結(jié)合。根據(jù)Genbank登陸號NP_001170826.1(SEQ ID NO：65)，把成熟的人間皮素分成三個(gè)區(qū)域，區(qū)域R1(E296-T390，SEQ ID NO：66)，區(qū)域R2(S391-Q486,SEQ ID NO：67)，區(qū)域R3(N487-G581,SEQ ID NO：68)，ELISA結(jié)果顯示抗體scFv-P1A6E-Fc和scFv-P3F2-Fc都只和區(qū)域1(E296-T390)結(jié)合。進(jìn)一步把區(qū)域1分割成5個(gè)小的片斷，分別和muFc融合表達(dá)。區(qū)域R1A(296E-337D,SEQ ID NO：69)，區(qū)域R1B(328D-369I,SEQ ID NO：70)，區(qū)域R1C(360Y-405T,SEQ ID NO：71)，區(qū)域R1AB(296E-359L,SEQ ID NO：72)，R1BC(328D-405T,SEQ ID NO：73)。ELISA結(jié)果如圖9和圖10所示，其中抗體scFv-P1A6E-Fc和scFv-P3F2-Fc和區(qū)域R1AB有明顯的結(jié)合，和區(qū)域R1A有很弱的結(jié)合，和區(qū)域R1B不結(jié)合。因此，抗體scFv-P1A6E-Fc和scFv-P3F2-Fc的結(jié)合位點(diǎn)應(yīng)該位于R1A和R1B重疊的位置附近。這個(gè)區(qū)域包含有10個(gè)氨基酸“DAALLATQMD”，基于該序列向兩端各延長10個(gè)氨基酸，或者5個(gè)氨基酸，形成兩個(gè)肽段R1J10:“YKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYE(SEQ ID NO:74)”和R1J5:“LEACVDAALLATQMDRVNAI(SEQ ID NO:75)”分別和muFc融合表達(dá)純化。ELISA結(jié)果顯示抗體scFv-P1A6E-Fc和scFv-P3F2-Fc和R1J10以及R1J5都不結(jié)合。根據(jù)以上結(jié)果，抗體scFv-P1A6E-Fc和scFv-P3F2-Fc的表位應(yīng)該是位于區(qū)域R1AB(SEQ ID NO：72)的構(gòu)象表位。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。