本發(fā)明屬于工業(yè)真菌技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)計(jì)一種高產(chǎn)甾體發(fā)酵藍(lán)色犁頭霉菌株及其甾體化合物發(fā)酵的應(yīng)用技術(shù)。

背景技術(shù)：

1甾體化合物C11β-羥化微生物發(fā)酵

甾體化合物是一類含有環(huán)戊烷多氫菲核的化合物，由于母核上取代基、雙鍵位置或立體構(gòu)型的不同，形成了一系列具有獨(dú)特生理功能的化合物。與甾體化合物有關(guān)的激素類藥物主要為：腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticosteroids)、性激素(Sex Hormone)、蛋白同化激素(Anabolic steroids)。

氫化可的松(hydrocortisone，HC)是人工合成也是天然存在的糖皮質(zhì)激素，抗炎作用為可的松的1.25倍，具有免疫抑制作用、抗毒作用、抗休克及一定的鹽皮質(zhì)激素活性等，并有留水、留鈉及排鉀作用。1948年，美國風(fēng)濕病專家Hench在風(fēng)濕病關(guān)節(jié)炎的治療中發(fā)現(xiàn)可的松在體內(nèi)轉(zhuǎn)化HC才具有療效。因 發(fā) 現(xiàn) 可 的 松 和HC的藥理作用，Hench、Reichstein和Kendal一起獲得了1950年的諾貝爾獎(jiǎng)，并從此掀起了開發(fā)皮質(zhì)激素的高潮。Wendler等用化學(xué)法合成了HC，但由于步驟多、收率低 ，導(dǎo)致藥品價(jià)格昂貴而難以工業(yè)化。此后，人們開始把目光轉(zhuǎn)向生物轉(zhuǎn)化方法。Fieser首先采用微生物轉(zhuǎn)化方法使HC工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。為提高轉(zhuǎn)化率和收率，國內(nèi)外研究人員做出了不懈努力，并取得較大進(jìn)展。由于在甾體C11位周圍沒有活性功能基團(tuán)的影響，常規(guī)化學(xué)法很難氧化非活潑碳?xì)滏I，而生物催化法卻能對(duì)它立體選擇性氧化。有效的菌種是黑根霉和犁頭霉。前者可專一性的在C11位引入α-羥基，引入構(gòu)型恰恰相反，故還需將其氧化為酮得醋酸可的松，再用鉀硼氫對(duì)其進(jìn)行不對(duì)稱還原，得C11位β-羥基物，即HC；犁頭霉卻能在化合物S（RSA）的C11位上直接引入β-羥基，后者就縮短了合成HC的工藝路線。

羥化反應(yīng)是甾體微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中最重要和最廣泛被應(yīng)用的反應(yīng)：一方面，羥基化能夠?yàn)檫M(jìn)一步的化學(xué)合成提供中間體；另一方面，用微生物進(jìn)行羥基化反應(yīng)可以達(dá)到一般化學(xué)反應(yīng)達(dá)不到的部位，并羥基化后的甾體化合物具有消炎等方面的活性。C11羥基對(duì)于甾體化合物抗炎的活性是必不可少的。甾體的微生物羥化反應(yīng)是利用微生物內(nèi)的羥化酶對(duì)甾體特定部位引入羥基，由于羥化酶的不穩(wěn)定性，在提取過程中極易失活，因此通常采用微生物菌體細(xì)胞轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化過程通常分兩個(gè)階段。第一階段是菌體的培養(yǎng)，第二階段是加入甾體底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。由于甾體化合物的疏水性，在底物濃度較高時(shí)，產(chǎn)物在發(fā)酵液中呈結(jié)晶析出，屬于擬結(jié)晶發(fā)酵。

目前國內(nèi)生產(chǎn)HC的菌種主要是藍(lán)色犁頭霉（AbsidiacoeruleaBainier），但由于藍(lán)色犁頭霉氧化專一性低，HC的收率受到限制。國外大都是用新月彎孢霉進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，國內(nèi)對(duì)用新月彎孢霉進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)HC也有相關(guān)研究，但工業(yè)化生產(chǎn)較少。因此選育出具有轉(zhuǎn)化率和得率較高、性狀穩(wěn)定的藍(lán)色犁頭霉菌種，對(duì)我國甾體微生物發(fā)酵具有重大意義。

2犁頭霉屬分類地位及利用現(xiàn)狀

犁頭霉屬（AbsidiaTiegh）屬于真菌界（Fungi）、接合菌門（Zygomycota）、毛霉目（Mucorales）、小克銀漢霉科（Cunninghamellaceae）。這個(gè)屬報(bào)道了79個(gè)種和種下分類單元，都為土壤生真菌。最近根據(jù)生理學(xué)、分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)研究，犁頭霉屬被分為3組：嗜溫的，耐溫的和生長緩慢的寄生性種類。其中耐溫的種類已經(jīng)從犁頭霉屬種分出去，成立了一個(gè)新科：Mycocladiaceae。該科目前僅一個(gè)屬，即Mycocladus。藍(lán)色犁頭霉（A. coerulea Bainier）仍然保留在犁頭霉屬中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的之一是提供一種藍(lán)色犁頭霉新菌株，其用于甾體化合物（薯蕷皂甙）為原料生產(chǎn)植物激素的轉(zhuǎn)化過程中，以甾體中間體為底物生產(chǎn)氫化可的松具有轉(zhuǎn)化率高、收率高的特點(diǎn)。

本發(fā)明目的之二是提供上述藍(lán)色犁頭霉新菌株，將甾體中間體RSA作為底物，將其轉(zhuǎn)化為氫化可的松產(chǎn)物中的應(yīng)用。

本發(fā)明目的之三是提供上述藍(lán)色犁頭霉新菌株在以甾體中間體RSA為底物生產(chǎn)氫化可的松的專用方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的采取的技術(shù)方案是：所述藍(lán)色犁頭霉菌株屬于真菌界、接合菌門、毛霉目、小克銀漢霉科，保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”（保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，分類名：藍(lán)色犁頭霉，Absidia coerulea），保藏時(shí)間為2013年6月8日，保藏號(hào)為：CGMCC No.7688。

所述藍(lán)色犁頭霉菌株可應(yīng)用于以甾體中間體RSA為底物制備氫化可的松產(chǎn)物中。

所述的藍(lán)色犁頭霉菌株在以甾體中間體RSA為底物生產(chǎn)氫化可的松的方法包括以下步驟：

⑴原種復(fù)活：在菌種生長溫度條件下，將保存的原種在PDA培養(yǎng)基茄子瓶或者克氏瓶斜面上培養(yǎng)，直到氣生菌絲長滿斜面；

⑵制備菌懸液：取無菌水倒入培養(yǎng)好菌種的茄子瓶中，用接種針攪拌完全，再取菌懸液稀釋后，涂布在PDA平板上，在菌種生長溫度條件下培養(yǎng)；

⑶制備茄子瓶或者克氏瓶斜面：在培養(yǎng)的PDA平板上選擇單個(gè)菌落接種在PDA茄子瓶或者克氏瓶斜面上，在菌種生長溫度條件下培養(yǎng)；

⑷制備一級(jí)種子液：在培養(yǎng)好的茄子瓶或克氏瓶斜面菌種中加入無菌水制備菌懸液并移入已經(jīng)滅菌的搖瓶培養(yǎng)液中，在菌種生長溫度條件下，在搖床上培養(yǎng)，pH到4.5以下獲得一級(jí)種子液；

⑸制備二級(jí)種子液：培養(yǎng)基以及裝量與上一步相同，將一級(jí)種子液按照20%移種量移入二級(jí)搖瓶培養(yǎng)，在菌種生長溫度條件下，在搖床上培養(yǎng)，pH到3.5以下即得二級(jí)種子液；

⑹投料發(fā)酵：按照0.2wt%的投料量投入RSA酒精溶液到二級(jí)種子液中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵液；

⑺結(jié)果檢測：將每個(gè)搖瓶的發(fā)酵液經(jīng)抽濾后，取濾液加入等量醋酸丁酯進(jìn)行萃取并濃縮結(jié)晶。將結(jié)晶物抽濾得到氫化可的松粗品和母液，將氫化可的松粗品烘干稱取粗品重量，根據(jù)投料量計(jì)算粗品收率和轉(zhuǎn)化率；

⑻選取生產(chǎn)菌株：在收率80%以上、轉(zhuǎn)化率70%以上的菌株中選擇收率和轉(zhuǎn)化率高于平均值的菌株，一方面制成砂土管原種或者牛奶凍干管在4℃條件下保存于冰箱中作為原種為以后生產(chǎn)和選育優(yōu)良菌株備用，另一方面?zhèn)鞔糜阽摅w發(fā)酵生產(chǎn)；

⑼傳代培養(yǎng)：在菌種生長溫度條件下，將選取的生產(chǎn)菌株接入PDA培養(yǎng)基茄子瓶斜面上培養(yǎng)，直到氣生菌絲長滿斜面；

⑽培養(yǎng)生產(chǎn)母種：將傳代培養(yǎng)后的菌種從茄子瓶斜面上接入PDA培養(yǎng)基克氏瓶斜面上培養(yǎng)，在菌種生長溫度條件下培養(yǎng)，使得氣生菌絲長滿克氏瓶并呈藍(lán)黑色；

⑾培養(yǎng)一級(jí)生產(chǎn)種子液：將生產(chǎn)母種接入種子罐中，培養(yǎng)基與搖瓶培養(yǎng)液相同，在菌種生長溫度條件下培養(yǎng)，取樣鏡檢確定沒有被污染并且PH到4.5以下，菌絲體體積達(dá)到85%以上標(biāo)準(zhǔn)后即可移入二級(jí)發(fā)酵罐中培養(yǎng)；

⑿底物溶液制備：溶解罐中投入RSA，加入水和酒精，密閉后升溫回流至RSA溶清，溶液清亮透明，然后保溫備用；

⒀培養(yǎng)二級(jí)生產(chǎn)種子液：在發(fā)酵罐中置入培養(yǎng)液，然后將種子罐中的一級(jí)生產(chǎn)種子液移入該發(fā)酵罐，在菌種生長溫度條件下培養(yǎng)培養(yǎng)后，取樣鏡檢確定沒有被污染并且pH到3.5以下，菌絲體體積在40%～60%之間，降溫并加片堿水溶液壓入底物溶液；

⒁投底物發(fā)酵：壓入RSA底物溶液，在菌種生長溫度下發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)取樣檢測當(dāng)時(shí)的發(fā)酵罐中的轉(zhuǎn)化情況決定發(fā)酵終止時(shí)間；

⒂壓濾：在發(fā)酵達(dá)到終止條件后加硫酸水溶液調(diào)節(jié)pH至5.4后對(duì)發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液進(jìn)行壓濾，取濾液備用；

⒃濾液提?。簩V液壓入提取罐，加入發(fā)酵液量1/4～1/5的醋酸丁酯，攪拌，靜置分層后取上清液至濃縮罐進(jìn)行減壓濃縮，再打入同樣的醋酸丁酯循環(huán)攪拌、提取，直至濾液提取干凈；

⒄粗品濃縮：將上步的提取液減壓濃縮至粥狀物，放入結(jié)晶鍋內(nèi)用冰鹽水降溫結(jié)晶；

⒅粗品離心：將上步溶液置入離心機(jī)離心甩干；

⒆粗品烘干：將上述甩干物分裝入烘盤內(nèi)放入烘箱，烘烤獲得粗品；

⒇精制品：進(jìn)行粗制品的分離，然后采用甲醇進(jìn)行重結(jié)晶得精制品。

本發(fā)明所述的藍(lán)色犁頭霉菌株以RSA為底物生產(chǎn)氫化可的松的方法包括以下具體步驟：

1原種復(fù)活：在27～29℃溫度條件下，將保存的原種在PDA培養(yǎng)基茄子瓶或者克氏瓶斜面上培養(yǎng)，直到氣生菌絲長滿斜面；

2制備菌懸液：取無菌水倒入培養(yǎng)好菌種的茄子瓶中，用接種針攪拌完全，再取菌懸液稀釋后，涂布在直徑150MM的PDA平板上，在27～29℃溫度條件下培養(yǎng)；

3制備茄子瓶或者克氏瓶斜面：在培養(yǎng)的PDA平板上選擇單個(gè)菌落接種在PDA茄子瓶或者克氏瓶斜面上，在27～29℃溫度條件下培養(yǎng)；

4制備一級(jí)種子液：在培養(yǎng)好的茄子瓶或克氏瓶斜面菌種中加入無菌水制備菌懸液并移入已經(jīng)滅菌的搖瓶培養(yǎng)液中，在27～29℃溫度條件下，在搖床上以200～220轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)18～20h，PH到4.5以下獲得一級(jí)種子液；

5制備二級(jí)種子液：培養(yǎng)基以及裝量與上一步相同，將一級(jí)種子液按照20%移種量移入二級(jí)搖瓶培養(yǎng)，在27～29℃溫度條件下，在搖床上以200～220轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)11～13h后，PH到3.5以下即得二級(jí)種子液；

6投料發(fā)酵：按照0.2%的投料量投入RSA酒精溶液到二級(jí)種子液中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，在以上相同條件下，培養(yǎng)24～48h后得到發(fā)酵液；

7結(jié)果檢測：將每個(gè)搖瓶的發(fā)酵液經(jīng)抽濾后，取濾液加入等量醋酸丁酯進(jìn)行萃取并濃縮結(jié)晶。將結(jié)晶物抽濾得到氫化可的松粗品和母液，將氫化可的松粗品烘干稱取粗品重量，根據(jù)投料量計(jì)算粗品收率和轉(zhuǎn)化率；

8選取生產(chǎn)菌株：在收率80%以上、轉(zhuǎn)化率70%以上的菌株中選擇收率和轉(zhuǎn)化率高于平均值的菌株，一方面制成砂土管原種或者牛奶凍干管在4℃條件下保存于冰箱中作為原種為以后生產(chǎn)和選育優(yōu)良菌株備用，另一方面?zhèn)鞔糜阽摅w發(fā)酵生產(chǎn)；

9傳代培養(yǎng)：在27～29℃溫度條件下，將選取的生產(chǎn)菌株接入PDA培養(yǎng)基茄子瓶斜面上培養(yǎng)5～6天，直到氣生菌絲長滿斜面；

10培養(yǎng)生產(chǎn)母種：將傳代培養(yǎng)后的菌種從茄子瓶斜面上接入PDA培養(yǎng)基克氏瓶斜面上培養(yǎng)6～7天，在27～29℃條件下培養(yǎng)，使得氣生菌絲長滿克氏瓶并呈藍(lán)黑色；

11培養(yǎng)一級(jí)生產(chǎn)種子液：將生產(chǎn)母種接入種子罐中，培養(yǎng)基與搖瓶培養(yǎng)液相同，在27～29℃溫度條件下培養(yǎng)20～22h，取樣鏡檢確定沒有被污染并且PH到4.5以下，即可移入二級(jí)發(fā)酵罐中培養(yǎng)；

12底物溶液制備：溶解罐中投入RSA，加入2倍水和18倍酒精，密閉后升溫回流至RSA溶清，溶液清亮透明，然后保溫備用；

13培養(yǎng)二級(jí)生產(chǎn)種子液：在發(fā)酵罐中置入培養(yǎng)液，然后將種子罐中的一級(jí)生產(chǎn)種子液移入該發(fā)酵罐，在27～29℃溫度條件下培養(yǎng)培養(yǎng)11～13h后，取樣鏡檢確定沒有被污染并且PH到3.5以下，適當(dāng)降溫并將PH加片堿水溶液調(diào)節(jié)至5.2~5.4后壓入底物溶液；

14投底物發(fā)酵：壓入RSA底物溶液，在27～29℃溫度下發(fā)酵培養(yǎng)18～32h，根據(jù)取樣檢測當(dāng)時(shí)的發(fā)酵罐中的轉(zhuǎn)化情況決定發(fā)酵終止時(shí)間；

15壓濾：在發(fā)酵達(dá)到終止條件后加硫酸水溶液調(diào)節(jié)PH至5.4后對(duì)發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液進(jìn)行壓濾，取濾液備用；

16濾液提取：將濾液壓入提取罐，加入發(fā)酵液量1/4～1/5的醋酸丁酯，攪拌20~30min，靜置分層30min后取上清液至濃縮罐進(jìn)行減壓濃縮，再打入同樣的醋酸丁酯循環(huán)攪拌、提取，直至濾液提取干凈；

17粗品濃縮：將上步的提取液減壓濃縮至粥狀物，放入結(jié)晶鍋內(nèi)用冰鹽水降溫結(jié)晶；

18粗品離心：將上步溶液置入離心機(jī)離心甩干；

19粗品烘干：將上述甩干物分裝入烘盤內(nèi)放入烘箱，烘烤獲得粗品；

20精制品：根據(jù)中國專利專利號(hào)200710066229的方法進(jìn)行粗制品的分離，然后采用甲醇進(jìn)行重結(jié)晶得精制品。

菌株培養(yǎng)性狀：通常在15～35℃條件下都能生長，其中以27～30℃為最適生長溫度。在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上菌落初期為白色絨毛狀匍匐菌絲并形成菌胎，后期為藍(lán)黑色團(tuán)狀氣生菌絲。27～29℃溫度下在室內(nèi)培養(yǎng)5～7d，基本上都能長滿培養(yǎng)器皿。

菌株形態(tài)特征：菌絲分枝，或在發(fā)育初期時(shí)不分枝；具有匍匐枝，無色具隔膜，8.5～13.5mm；假根發(fā)達(dá)，通常從匍匐枝種長出，單枝或分枝，無色；孢囊柱從匍匐枝上長出，直立或斜生；孢子囊球形到梨形；孢囊孢子性狀和大小不規(guī)則，3。0～12.5mm ′ 3.5-8.5mm；無厚垣孢子，接合孢子不知。

本發(fā)明的有益效果是：生產(chǎn)的氫化可的松具有轉(zhuǎn)化率高（68～72%）、收率高（48～50%），而且生物學(xué)性狀比較穩(wěn)定等特點(diǎn)。本發(fā)明可以為以薯蕷皂甙為原料的植物甾體激素生產(chǎn)提高產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本提供技術(shù)支持。

附圖說明

圖1為本發(fā)明藍(lán)色犁頭霉甾體化合物微生物發(fā)酵生產(chǎn)流程圖。

圖2為本發(fā)明藍(lán)色犁頭霉發(fā)酵工藝流程圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例

①原種復(fù)活：在27～29℃溫度條件下，將保存的原種在PDA培養(yǎng)基茄子瓶或者克氏瓶斜面上培養(yǎng)，直到氣生菌絲長滿斜面；

②制備菌懸液：取200ml無菌水倒入培養(yǎng)好的茄子瓶或者克氏瓶中，用接種針攪拌菌絲制成菌懸液，取菌懸液稀釋到10^-5～10^-7倍數(shù)后，涂布在直徑為150mmPDA平板上。在27～29⁰C溫度條件下培養(yǎng)3～4天；

③制備茄子瓶斜面：在培養(yǎng)的PDA平板上，選擇單個(gè)菌落接種在60mlPDA茄子瓶斜面上，在27～29⁰C溫度條件下培養(yǎng)5～6天；

④制備一級(jí)種子液：制備培養(yǎng)液100ml置入500ml搖瓶中，在27～29⁰C溫度條件下，在搖床上（200～220轉(zhuǎn)/分）培養(yǎng)20～22h后，檢測PH在4.5以下即獲得一級(jí)種子液；

⑤制備二級(jí)種子液：培養(yǎng)基以及裝量與上一步相同，將一級(jí)種子液按照20%移種量移入二級(jí)搖瓶培養(yǎng)在27～29⁰C溫度條件下，在搖床上（200～220轉(zhuǎn)/分）培養(yǎng)11～13h后，檢測PH在3.5以下即為二級(jí)種子液。；

⑥投料發(fā)酵：按照0.2%的投料量投入底物酒精溶液到二級(jí)種子液中，在相同條件下，培養(yǎng)24～48h后檢測符合要求后下料；

⑦結(jié)果檢測：將每個(gè)搖瓶的發(fā)酵液經(jīng)抽濾后，取濾液加入等量醋酸丁酯進(jìn)行萃取并濃縮結(jié)晶。將結(jié)晶物抽濾得到氫化可的松粗品和母液，將氫化可的松粗品烘干稱取粗品重量，根據(jù)投料量計(jì)算粗品收率和轉(zhuǎn)化率；

⑧選取生產(chǎn)菌株：在收率80%以上、轉(zhuǎn)化率70%以上的菌株中選擇收率和轉(zhuǎn)化率高于平均值的菌株，一方面制成砂土管原種或者牛奶凍干管在4℃條件下保存于冰箱中作為原種為以后生產(chǎn)和選育優(yōu)良菌株備用，另一方面?zhèn)鞔糜阽摅w發(fā)酵生產(chǎn)；

⑨傳代培養(yǎng)：在27～29℃溫度條件下，將選取的生產(chǎn)菌株接入PDA培養(yǎng)基茄子瓶斜面上培養(yǎng)5～6d，到氣生菌絲長滿斜面；

⑩培養(yǎng)生產(chǎn)母種：將傳代培養(yǎng)后的菌種從茄子瓶斜面上接入PDA培養(yǎng)基克氏瓶斜面上培養(yǎng)6～7天，在27～29℃條件下培養(yǎng)，使得氣生菌絲長滿克氏瓶并呈藍(lán)黑色；

?培養(yǎng)一級(jí)生產(chǎn)種子液：將50瓶生產(chǎn)菌種接入已經(jīng)置入了3.6t培養(yǎng)液（配方與搖瓶培養(yǎng)液相同）的種子罐（6t容積）中。在27～29⁰C溫度條件下培養(yǎng)20～22h后，取樣鏡檢確定沒有被污染并且PH到4.5以下，菌絲體體積達(dá)到85%以上標(biāo)準(zhǔn)后即可移入二級(jí)發(fā)酵罐中培養(yǎng)；

?底物溶液制備：溶解罐中投入RSA，加入2倍水和18倍酒精，密閉后升溫回流至RSA溶清，溶液清亮透明，然后保溫備用；

?培養(yǎng)二級(jí)生產(chǎn)種子液：將50t容積的發(fā)酵罐中置入30t培養(yǎng)液（配方與搖瓶培養(yǎng)液相同），然后將種子罐中的培養(yǎng)液全部移入該發(fā)酵罐，在27～29⁰C溫度條件下培養(yǎng)11～13h后，取樣鏡檢確定沒有被污染并且PH到3.5以下，菌絲體體積在40%～60%之間，適當(dāng)降溫并將PH加片堿水溶液調(diào)節(jié)至5.2~5.4后壓入底物溶液；

?投底物發(fā)酵：在二級(jí)種子液的發(fā)酵罐中壓入備用的底物溶液，在相同條件下培養(yǎng)18h后，根據(jù)取樣檢測當(dāng)時(shí)的發(fā)酵罐中的轉(zhuǎn)化情況決定發(fā)酵終止時(shí)間，一般控制發(fā)酵時(shí)間18～32h，最長不超過32h；

?壓濾：在發(fā)酵達(dá)到終止條件后加硫酸水溶液調(diào)節(jié)PH至5.4后對(duì)發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液進(jìn)行壓濾，取濾液備用；

?濾液提?。簩V液壓入提取罐，發(fā)酵液量1/4～1/5的醋酸丁酯，攪拌20~30min，靜置分層30min后取上清液至濃縮罐進(jìn)行減壓濃縮，再打入同樣的醋酸丁酯循環(huán)攪拌、提取，直至濾液提取干凈；

?粗品濃縮：將上步的提取液減壓濃縮至粥狀物，放入結(jié)晶鍋內(nèi)用冰鹽水降溫結(jié)晶；

?粗品離心：將上步溶液置入離心機(jī)離心甩干；

?粗品烘干：將上述甩干物分裝入烘盤內(nèi)放入烘箱，烘烤獲得粗品；

?精制品：根據(jù)中國專利專利號(hào)200710066229的方法進(jìn)行粗制品的分離，然后采用甲醇進(jìn)行重結(jié)晶得精制品。

對(duì)本發(fā)明提出的新型藍(lán)色犁頭霉菌株，就其菌株培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和搖床驗(yàn)證的整個(gè)過程，進(jìn)行了4個(gè)實(shí)例驗(yàn)證：

實(shí)例1

在搖床轉(zhuǎn)速190r/min，培養(yǎng)溫度27℃，發(fā)酵時(shí)間24h的條件下,收率為78.50%，轉(zhuǎn)化率為68.86%。

實(shí)例2

在搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間30h的條件下,收率為81.75%，轉(zhuǎn)化率為72.46%。

實(shí)例3

在搖床轉(zhuǎn)速210r/min，培養(yǎng)溫度29℃，發(fā)酵時(shí)間36h的條件下,收率為81.68%，轉(zhuǎn)化率為72.24%。

實(shí)例4

在搖床轉(zhuǎn)速220r/min，培養(yǎng)溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間48h的條件下,收率為80.33%，轉(zhuǎn)化率為71.79%。

其結(jié)果表明：在培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件（搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間）做相應(yīng)變動(dòng)的條件下，藍(lán)色犁頭霉菌株LJYH20130405-3和LJYH20130405-4對(duì)RSA的粗品收率和氫化可的松的轉(zhuǎn)化率分別穩(wěn)定在78～82%和68～73%之間，說明本發(fā)明提出的藍(lán)色犁頭霉新型菌株具有優(yōu)良的性狀；而且其在大型生產(chǎn)規(guī)模上該菌株也具有較高的轉(zhuǎn)化率和收率，其轉(zhuǎn)化率為68～72%，氫化可的松（精品）收率為48～50%。