本發(fā)明涉及強力霉素抗體制備工藝領(lǐng)域，具體涉及一種強力霉素廣譜單克隆抗體及制備工藝。

背景技術(shù)：

強力霉素是四環(huán)素類抗生素的重要成員之一，在畜牧獸醫(yī)臨床應(yīng)用很廣泛，隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖場(小區(qū))在利益的驅(qū)使下，不合理濫用獸藥導致藥物在動物可食性組織中蓄積殘留，這種行為不僅造成耐藥菌產(chǎn)生，而且嚴重影響了我國畜牧產(chǎn)品的出口，造成重大經(jīng)濟損失，也給廣大消費者身心健康帶來極大的危害，此外，飼養(yǎng)者還存在不符合用藥劑量、給藥部位和用藥動物種類等用藥規(guī)定，以及重復使用幾種商品名稱不同但成分相同藥物的現(xiàn)象，因此，加強對動物源食品中獸藥殘留監(jiān)測非常必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對以上問題，本發(fā)明提供了一種強力霉素廣譜單克隆抗體及制備工藝，以強力霉素和對氨基苯乙酸為主要原料，加入一定量的亞硝酸鈉溶液、碳酸鈉溶液、鹽酸，采用重氮法制備出具有抗血清特異性的強力霉素廣譜單克隆抗體，具有優(yōu)良的生物性能，可以有效解決背景技術(shù)中的問題。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種強力霉素廣譜單克隆抗體，按照重量份數(shù)由如下原料制成：

強力霉素40-52份、四環(huán)素4-20份、米諾環(huán)素2-6份、美他環(huán)素2-4份、牛血清白蛋白3-5份、弗氏完全佐劑5-8份、弗氏不完全佐劑1-2份、HRP-羊抗鼠IgG 2-3份、硫酸銨3-6份、磷酸氫二鈉9-10份、磷酸二氫鉀16-20份、檸檬酸12-16份、磷酸二氫銨8-12份、無水乙醇9-15份、氯甲酸異丁酯1-3份、包被緩沖液2-4份、封閉液5-7份、洗滌緩沖液3-4份、底物6-10份、細胞培養(yǎng)液20-25份。

根據(jù)上述技術(shù)方案，所述包被緩沖液選用濃度為0.05mol/L，PH值為9.6的碳酸鹽緩沖液。

根據(jù)上述技術(shù)方案，所述封閉液使用2g進口明膠，加入包被緩沖液100ml中煮沸趁熱過濾所得。

根據(jù)上述技術(shù)方案，所述底物配制是將10mg的四甲基聯(lián)苯胺溶于5ml無水乙醇中，將其0.5mL與10mL底物緩沖液混合，再加入10ul的30%的H₂O₂。

根據(jù)上述技術(shù)方案，所述細胞培養(yǎng)液選用濃度為0.2mol/L的L-谷氨酸溶液。

另外本發(fā)明還設(shè)計了一種強力霉素廣譜單克隆抗體的制備工藝，包括如下步驟：

（1）將0.4g強力霉素溶于5mL碳酸鈉溶液；

（2）將151mg對氨基苯乙酸溶于2mL HCL(0.3mol/L)，冷卻至4℃；

（3）4℃避光條件下，邊攪拌邊往（2）液中緩慢滴加亞硝酸鈉溶液；反應(yīng)過程始終用淀粉-碘化鉀試紙監(jiān)控，當試紙變藍，停止滴加；

（4）將（1）中的液體緩慢滴入（3）液中。

（5）用HCL（0.1mol/L）調(diào)PH到3.6，繼續(xù)4℃避光攪拌30min；

（6）真空抽濾，得到紅色沉淀，50mL超純水沖洗，烘干；

（7）裝于安培瓶密封4℃保存。

根據(jù)上述技術(shù)方案，所述步驟（1）中，碳酸鈉溶液的濃度為0.1mol/L。

根據(jù)上述技術(shù)方案，所述步驟（3），滴入的亞硝酸鈉溶液的濃度為0.1mol/L；所述步驟（4）中，需要在4℃避光條件下，攪拌30min，直到出現(xiàn)紅色沉淀為止。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明以強力霉素和對氨基苯乙酸為主要原料，加入一定量的亞硝酸鈉溶液、碳酸鈉溶液、鹽酸，采用重氮法制備出具有抗血清特異性的強力霉素廣譜單克隆抗體，具有優(yōu)良的生物性能。

附圖說明

圖1為本發(fā)明發(fā)泡保溫時間與泡徑的關(guān)系曲線圖。

圖2為本發(fā)明不同PbO加入量與發(fā)泡溫度的示意圖。

圖3為本發(fā)明PbO與密度的示意圖。

圖4為本發(fā)明PbO加入量與高密度泡沫玻璃力學性能的示意圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實施例1：

一種強力霉素廣譜單克隆抗體，按照重量份數(shù)由如下原料制成：

強力霉素40份、四環(huán)素4份、米諾環(huán)素2份、美他環(huán)素2份、牛血清白蛋白3份、弗氏完全佐劑5份、弗氏不完全佐劑1份、HRP-羊抗鼠IgG 2份、硫酸銨3份、磷酸氫二鈉9份、磷酸二氫鉀16份、檸檬酸12份、磷酸二氫銨8份、無水乙醇9份、氯甲酸異丁酯1份、包被緩沖液2份、封閉液5份、洗滌緩沖液3份、底物6份、細胞培養(yǎng)液20份。

所述包被緩沖液選用濃度為0.05mol/L，PH值為9.6的碳酸鹽緩沖液；所述封閉液使用2g進口明膠，加入包被緩沖液100ml中煮沸趁熱過濾所得；所述底物配制是將10mg的四甲基聯(lián)苯胺溶于5ml無水乙醇中，將其0.5mL與10mL底物緩沖液混合，再加入10ul的30%的H₂O₂；所述細胞培養(yǎng)液選用濃度為0.2mol/L的L-谷氨酸溶液。

其制備工藝，包括如下步驟：

（1）將0.4g強力霉素溶于5mL碳酸鈉溶液，所述碳酸鈉溶液的濃度為0.1mol/L；

（2）將151mg對氨基苯乙酸溶于2mL HCL(0.3mol/L)，冷卻至4℃；

（3）4℃避光條件下，邊攪拌邊往（2）液中緩慢滴加亞硝酸鈉溶液，滴入的亞硝酸鈉溶液的濃度為0.1mol/L；反應(yīng)過程始終用淀粉-碘化鉀試紙監(jiān)控，當試紙變藍，停止滴加；

（4）將（1）中的液體緩慢滴入（3）液中，在4℃避光條件下，攪拌30min，直到出現(xiàn)紅色沉淀為止。

（5）用HCL（0.1mol/L）調(diào)PH到3.6，繼續(xù)4℃避光攪拌30min；

（6）真空抽濾，得到紅色沉淀，50mL超純水沖洗，烘干；

（7）裝于安培瓶密封4℃保存。

實施例2：

一種強力霉素廣譜單克隆抗體，按照重量份數(shù)由如下原料制成：

強力霉素46份、四環(huán)素12份、米諾環(huán)素4份、美他環(huán)素3份、牛血清白蛋白4份、弗氏完全佐劑6.5份、弗氏不完全佐劑1.5份、HRP-羊抗鼠IgG 2.5份、硫酸銨4.5份、磷酸氫二鈉9.5份、磷酸二氫鉀18份、檸檬酸14份、磷酸二氫銨10份、無水乙醇12份、氯甲酸異丁酯2份、包被緩沖液3份、封閉液6份、洗滌緩沖液3.5份、底物8份、細胞培養(yǎng)液22.5份。

所述包被緩沖液選用濃度為0.05mol/L，PH值為9.6的碳酸鹽緩沖液；所述封閉液使用2g進口明膠，加入包被緩沖液100ml中煮沸趁熱過濾所得；所述底物配制是將10mg的四甲基聯(lián)苯胺溶于5ml無水乙醇中，將其0.5mL與10mL底物緩沖液混合，再加入10ul的30%的H₂O₂；所述細胞培養(yǎng)液選用濃度為0.2mol/L的L-谷氨酸溶液。

其制備工藝，包括如下步驟：

（1）將0.4g強力霉素溶于5mL碳酸鈉溶液，所述碳酸鈉溶液的濃度為0.1mol/L；

（2）將151mg對氨基苯乙酸溶于2mL HCL(0.3mol/L)，冷卻至4℃；

（3）4℃避光條件下，邊攪拌邊往（2）液中緩慢滴加亞硝酸鈉溶液，滴入的亞硝酸鈉溶液的濃度為0.1mol/L；反應(yīng)過程始終用淀粉-碘化鉀試紙監(jiān)控，當試紙變藍，停止滴加；

（4）將（1）中的液體緩慢滴入（3）液中，在4℃避光條件下，攪拌30min，直到出現(xiàn)紅色沉淀為止。

（5）用HCL（0.1mol/L）調(diào)PH到3.6，繼續(xù)4℃避光攪拌30min；

（6）真空抽濾，得到紅色沉淀，50mL超純水沖洗，烘干；

（7）裝于安培瓶密封4℃保存。

實施例3：

一種強力霉素廣譜單克隆抗體，按照重量份數(shù)由如下原料制成：

強力霉素52份、四環(huán)素20份、米諾環(huán)素6份、美他環(huán)素4份、牛血清白蛋白5份、弗氏完全佐劑8份、弗氏不完全佐劑2份、HRP-羊抗鼠IgG 3份、硫酸銨6份、磷酸氫二鈉10份、磷酸二氫鉀20份、檸檬酸16份、磷酸二氫銨12份、無水乙醇15份、氯甲酸異丁酯3份、包被緩沖液4份、封閉液7份、洗滌緩沖液4份、底物10份、細胞培養(yǎng)液25份。

所述包被緩沖液選用濃度為0.05mol/L，PH值為9.6的碳酸鹽緩沖液；所述封閉液使用2g進口明膠，加入包被緩沖液100ml中煮沸趁熱過濾所得；所述底物配制是將10mg的四甲基聯(lián)苯胺溶于5ml無水乙醇中，將其0.5mL與10mL底物緩沖液混合，再加入10ul的30%的H₂O₂；所述細胞培養(yǎng)液選用濃度為0.2mol/L的L-谷氨酸溶液。

其制備工藝，包括如下步驟：

（1）將0.4g強力霉素溶于5mL碳酸鈉溶液，所述碳酸鈉溶液的濃度為0.1mol/L；

（2）將151mg對氨基苯乙酸溶于2mL HCL(0.3mol/L)，冷卻至4℃；

（3）4℃避光條件下，邊攪拌邊往（2）液中緩慢滴加亞硝酸鈉溶液，滴入的亞硝酸鈉溶液的濃度為0.1mol/L；反應(yīng)過程始終用淀粉-碘化鉀試紙監(jiān)控，當試紙變藍，停止滴加；

（4）將（1）中的液體緩慢滴入（3）液中，在4℃避光條件下，攪拌30min，直到出現(xiàn)紅色沉淀為止。

（5）用HCL（0.1mol/L）調(diào)PH到3.6，繼續(xù)4℃避光攪拌30min；

（6）真空抽濾，得到紅色沉淀，50mL超純水沖洗，烘干；

（7）裝于安培瓶密封4℃保存。

實施例4：

通過紫外掃描法、包被抗原與抗血清工作濃度鑒定法、血清效價的測定等測試方法鑒定單克隆抗體的生物性能。

（1）紫外掃描法鑒定單克隆抗體的作用

半抗原和BSA（OA）通過1，4-酊二醚作為“間隔臂”偶聯(lián)在一起，如圖1所示，在偶聯(lián)物紫外掃描曲線中，含有半抗原和BSA（OA）的紫外吸收特點，根據(jù)吸收峰的相加性可以確定偶聯(lián)成功。根據(jù)公式計算出強力霉素與BSA的偶聯(lián)比為16:1，強力霉素與OA的偶聯(lián)比為11:1。免疫原DC-BSA的濃度為21.87mg/mL。包被原DC-OA的濃度為6.81mg/mL。

若免疫原的載體蛋白與半抗原之間是通過較長的間隔臂偶連在一起的，與含有較短間隔臂的同種免疫原相比，它更容易刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對半抗原及其機構(gòu)類似物具有較高識別力和結(jié)合力的通用抗體，本研究合成的兩種免疫原的核心結(jié)構(gòu)都通過較長的間隔臂遠離了載體蛋白，因此，應(yīng)該可以刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生較好的通用抗體。

（2）包被抗原與抗血清工作濃度鑒定單克隆抗體的作用

根據(jù)方陣法確定ELISA方法的最佳包被抗原CTC-C-OA濃度為2.1μg/mL，陽性血清最佳稀釋度為1:20000，結(jié)果見圖2。

小鼠鑒定后一周眼眶采血，用間接ELISA方法測效價，判定標準同3.1，小鼠血清效價均可達1：4×10⁴，結(jié)果如圖3所示。

將合成的包被原（濃度為0.17mg/mL）稀釋成濃度為4.2μg/mL、2.1μg/mL、1.05μg/mL后包被酶標板，分別加入不同濃度的標準品（0、25、50、100ng/mL）和1：20000稀釋的鼠血清，同一稀釋度的包被原加入標準品和抗體后，OD值隨標準品濃度增高而逐漸降低，說明抗血清是針對DC的，結(jié)果見圖4所示。

因此，從圖2、3、4可以看出：該抗體的抗血清效價、抑制性較好，抗血清效價已達到了制備單克隆抗體的要求。

基于上述，本發(fā)明的優(yōu)點在于，本發(fā)明以強力霉素和對氨基苯乙酸為主要原料，加入一定量的亞硝酸鈉溶液、碳酸鈉溶液、鹽酸，采用重氮法制備出具有抗血清特異性的強力霉素廣譜單克隆抗體，具有優(yōu)良的生物性能，且該抗體的抗血清效價、抑制性較好，使得工藝生產(chǎn)效率得到大大的提高，生產(chǎn)工藝操作方便，成本較低。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。