本發(fā)明屬于臨床診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，本發(fā)明涉及一種雜交瘤細(xì)胞株SCCA1及其制備方法，雜交瘤細(xì)胞株SCCA1分泌的單克隆抗體、和單克隆抗體在檢測(cè)宮頸癌的試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：宮頸癌是全球婦女中僅次于乳腺癌和結(jié)直腸癌的第3個(gè)常見的惡性腫瘤，在發(fā)展中國家是僅次于乳腺癌居第2位的常見惡性腫瘤，是最常見的女性生殖道惡性腫瘤。宮頸癌是指發(fā)生在宮頸陰道部或者移行帶的鱗狀上皮細(xì)胞及宮頸管內(nèi)膜的柱狀上皮細(xì)胞交界處的惡性腫瘤。經(jīng)過幾十年廣泛開展婦科普查，宮頸癌的患病率及病死率降低了近68％，但宮頸癌的發(fā)病正呈現(xiàn)一種年輕化的趨勢(shì)。宮頸癌發(fā)病率高，預(yù)后較差。宮頸癌中最為常見的病理類型是鱗狀上皮細(xì)胞癌，約占宮頸癌總數(shù)的75％；其次為腺癌，約占宮頸癌患者的25％。鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC)是一種特異性很好而且是最早用于診斷鱗癌的腫瘤標(biāo)志物。SCCA是一組屬于絲氨酸/半胱氨酸抑制物家族的糖蛋白，最初由Kato等人于鱗狀細(xì)胞癌組織中分離出來，作為鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于宮頸癌，治療前血清中SCCA水平可以作為早期預(yù)后指標(biāo)。SCCA在正常的鱗狀上皮細(xì)胞中抑制細(xì)胞調(diào)亡和參與鱗狀上皮層的分化，在腫瘤細(xì)胞中參與腫瘤的生長，它有助于所有鱗狀上皮細(xì)胞起源癌的診斷和監(jiān)測(cè)，例如：子宮頸癌、肺癌(非小細(xì)胞肺癌)、頭頸部癌、食管癌、鼻咽癌以及外陰部鱗狀細(xì)胞癌等，這些腫瘤患者血清中SCC升高，其濃度隨病期的加重而增加，臨床上用于監(jiān)測(cè)這些腫瘤的療效、復(fù)發(fā)、和轉(zhuǎn)移以及評(píng)價(jià)預(yù)后。SCCA對(duì)宮頸癌有較高的診斷價(jià)值：對(duì)原發(fā)性宮頸鱗癌敏感性為44％-69％；復(fù)發(fā)癌敏感性為67％-100％，特異性90％-96％；其血清學(xué)水平與腫瘤發(fā)展、侵犯程度及有否轉(zhuǎn)移相關(guān)，在宮頸癌根治術(shù)后SCCA濃度顯著下降；可及早提示復(fù)發(fā)，50％患者的SCCA濃度升高先于臨床診斷復(fù)發(fā)2-5個(gè)月，它可以作為獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子加以應(yīng)用。此外，對(duì)宮頸癌患者進(jìn)行SCCA定量檢測(cè)，還可幫助監(jiān)測(cè)疾病狀態(tài)、反映治療療效并早期發(fā)現(xiàn)癌癥復(fù)發(fā)，有重要的參考價(jià)值。多數(shù)宮頸癌SCCA和CA125會(huì)同時(shí)升高，但有些宮頸癌只出現(xiàn)單一腫瘤標(biāo)志物的升高。因此，兩者聯(lián)合使用，可避免單一應(yīng)用的陰性結(jié)果造成疾病復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的漏診。SCCA輔助診斷肺鱗癌：肺鱗癌陽性率為46.5％，其水平與腫瘤的進(jìn)展程度相關(guān)，它配合CA125、CYFRA21-1和CEA聯(lián)合檢測(cè)可提高肺癌患者診斷的靈敏性。SCCA對(duì)于食管鱗癌、鼻咽癌的預(yù)測(cè)：陽性率隨病情發(fā)展而上升，對(duì)于晚期患者,其靈敏性可達(dá)73％，聯(lián)合檢測(cè)CYFRA21-1和SCCA可以提高檢測(cè)的靈敏性，III期頭頸部癌陽性率為40％，IV期時(shí)陽性率增至60％，研究表明腺癌患者血清SCCA陽性檢出率顯著低于鱗癌患者。目前，宮頸癌的診斷主要依據(jù)兩種檢測(cè)手段。一種是經(jīng)陰道取組織檢查。包括：1、宮頸刮片細(xì)胞學(xué)檢查，是宮頸癌篩查的主要方法，應(yīng)在宮頸轉(zhuǎn)化區(qū)取材；2、宮頸碘試驗(yàn)，正常宮頸陰道部鱗狀上皮含豐富糖原，碘溶液涂染后呈棕色或深褐色，不染色區(qū)說明該處上皮缺乏糖原，可能有病變。在碘不染色區(qū)取材活檢可提高診斷率；3、陰道鏡檢查，宮頸刮片細(xì)胞學(xué)檢查巴氏Ⅲ級(jí)及Ⅲ級(jí)以上、TBS分類為鱗狀上皮內(nèi)瘤變，均應(yīng)在陰道鏡觀察下選擇可疑癌變區(qū)行宮頸活組織檢查；4、宮頸和宮頸管活組織檢查，為確診宮頸癌及宮頸癌前病變的可靠依據(jù)，所取組織應(yīng)包括間質(zhì)及鄰近正常組織，宮頸刮片陽性，但宮頸光滑或?qū)m頸活檢陰性，應(yīng)用小刮匙搔刮宮頸管，刮出物送病理檢查；5、宮頸錐切術(shù)，適用于宮頸刮片檢查多次陽性而宮頸活檢陰性者；或?qū)m頸活檢為宮頸上皮內(nèi)瘤變需排除浸潤癌者，可采用冷刀切除、環(huán)形電切除或冷凝電刀切除，此類方法還需要經(jīng)驗(yàn)豐富的臨床技師對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行解讀，且患者抗拒此類侵入性的檢查。另一種常規(guī)檢測(cè)方法是檢測(cè)生物標(biāo)志物SCCA。但是，SCCA具有特異性低和靈敏度低的特點(diǎn)，而且全身鱗狀上皮細(xì)胞若有病變均可使血清SCCA檢測(cè)為陽性。因此，亟需一種特異性高和靈敏度高的標(biāo)志物，來輔助增加檢測(cè)宮頸癌的準(zhǔn)確性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞株SCCA1及其制備方法、該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體、和檢測(cè)宮頸癌的試劑盒及其制備方法。為了實(shí)現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：一種雜交瘤細(xì)胞株SCCA1，所述細(xì)胞株的保藏編號(hào)為CCTCCNo：C2016131。本發(fā)明還提供了上述雜交瘤細(xì)胞株SCCA1的制備方法，其是以序列號(hào)為SEQIDNO:3所示氨基酸序列的SCCA1重組蛋白作為抗原免疫小鼠獲得的。本發(fā)明還提供了一種單克隆抗體，所述單克隆抗體由上述雜交瘤細(xì)胞株SCCA1分泌產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體在制備檢測(cè)宮頸癌的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)宮頸癌的試劑盒，所述試劑盒包括有上述單克隆抗體。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)宮頸癌的酶聯(lián)免疫試劑盒，所述試劑盒包括有包被上述單克隆抗體的微孔板。本發(fā)明的針對(duì)癌癥診斷的單克隆抗體，是由雜交瘤細(xì)胞株SCCA1所分泌產(chǎn)生的，該雜交瘤細(xì)胞株SCCA1已于2016年6月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國武漢大學(xué)內(nèi))，保藏號(hào)為CCTCCNo:C2016131。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：1、本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株SCCA1分泌的單克隆抗體具有良好的特異性，以此為基礎(chǔ)建立的檢測(cè)宮頸癌的體外診斷試劑盒，為臨床與實(shí)踐的不同需要提供了建立快速，特異，敏感的檢測(cè)方法；2、本發(fā)明所述的定量檢測(cè)宮頸癌的試劑盒不僅檢測(cè)速度快，血液標(biāo)本用量少，采用蛋白芯片法檢測(cè)SCCA抗體與其他相似抗體的交叉反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果的靈敏度高，為臨床醫(yī)師提供更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，極大改善宮頸癌的監(jiān)測(cè)與管理。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中小鼠常規(guī)免疫四次后的效價(jià)圖。具體實(shí)施方式以下通過具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，具體實(shí)施例不代表對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明理念所做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1雜交瘤細(xì)胞株SCCA1的制備包括以下步驟：1、抗原(SCCA1重組蛋白)的制備包括以下步驟：1)、pET28a-SCCA1重組載體的構(gòu)建根據(jù)Genbank中提供的人SCCA1(全長1173bp)的DNA序列(NC_000018.10)，人工合成該序列，去掉N末端信號(hào)肽，設(shè)計(jì)三對(duì)引物，由兩個(gè)引物的5‘端分別引入NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)，用常規(guī)PCR方法(載體pET-28a為模板)擴(kuò)增得到SCCA1基因的四個(gè)片段，分別表達(dá)SCCA1蛋白的四段序列：第一段：第93位到第159位氨基酸(SEQIDNo:1)；第二段：第44位到102位氨基酸(SEQIDNo:2)；第三段：第52位到112位氨基酸(SEQIDNo:3)；第四段：全長，第1位到390位氨基酸(SEQIDNo:4)。將載體pET-28a(市售)及經(jīng)過瓊脂糖凝膠純化的SCCA1基因片段，用NdeI和XhoI進(jìn)行雙酶切處理，用T4DNA連接酶將純化后的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒pET-28a-SCCA1-1，pET-28a-SCCA1-2,pET-28a-SCCA1-3，pET-28a-SCCA1-4，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α，在含有氨芐青霉素的LB平板上挑選克隆，小量制備質(zhì)粒，通過雙酶切/PCR鑒定篩選出陽性克隆，測(cè)序結(jié)果表明重組的SCCA1片段與設(shè)計(jì)的序列完全一致。2)、SCCA1重組蛋白的表達(dá)重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌(BL21)，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可在LB平板上挑選陽性克隆并進(jìn)行質(zhì)粒酶切鑒定，小量制備質(zhì)粒，用雙酶切PCR鑒定篩選出陽性克隆，最終獲得4個(gè)含有SCCA1的重組質(zhì)粒工程菌。將4個(gè)含有SCCA1的重組質(zhì)粒工程菌分別于含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，A600達(dá)到0.5-06之間，然后加入終濃度為0.5mM的Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)于37℃誘導(dǎo)4h，誘導(dǎo)完成后的菌液4,000rpm離心10min，收集菌體，并用PBS洗滌沉淀；PBS重懸沉淀后置于冰浴中，超聲破菌后12000rpm離心20min，上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明：表達(dá)的SCCA1重組蛋白皆為胞漿不可溶性表達(dá)。3)、四組SCCA1重組蛋白的純化和定量將大量表達(dá)得到的菌體，經(jīng)超聲破碎后離心，再進(jìn)行包含體洗滌，洗滌完成后用GEHealthcare公司的HisTrapFF純化柱將蛋白進(jìn)行純化(按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行試劑配制和純化)。最終獲得的SCCA1重組蛋白分別為SCCA1-1,SCCA1-2,SCCA1-3,SCCA1-4,用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)得其濃度。其中重組蛋白SCCA1-4(SEQIDNo:4)作為本發(fā)明試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品蛋白。2、鼠抗SCCA雜交瘤細(xì)胞株的建立包括以下步驟：a.選用6-8周齡、體重18g左右且健康的雌性BALB/c小鼠2只(1#，2#,3#)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采集陰性血作為對(duì)照用；b.免疫程序采用4次基礎(chǔ)免疫和1次加強(qiáng)免疫。采用中程免疫方案(0.3mL/只，2周/次)，首次免疫時(shí)(50μg/只)按免疫原與等體積的弗氏完全佐劑攪拌乳化，背部皮下多點(diǎn)注射，免疫原采用步驟1的前三組SCCA1重組蛋白(SCCA1-1,SCCA1-2,SCCA1-3，即SEQIDNo:1、SEQIDNo:2、和SEQIDNo:3)。此后按免疫原與等體積的弗氏不完全佐劑攪拌乳化進(jìn)行常規(guī)免疫3次；第4次常規(guī)免疫7天后測(cè)效價(jià)，結(jié)果見圖1和表1，從圖1和表1結(jié)果可知，免疫小鼠效價(jià)明顯達(dá)到1：320000以上，準(zhǔn)備加強(qiáng)免疫；表1小鼠四次免疫后效價(jià)測(cè)定Dilutionofserum(1:X)1#mouse2#mouse3#mouse50002.3062.4422.016100001.9572.1361.857200001.5921.5961.498400001.1371.0711.007800000.8220.7790.7531600000.4580.4540.4123200000.3550.2890.212Blank0.0760.0960.082c.加強(qiáng)免疫不加佐劑，加強(qiáng)免疫劑量為50μg/只，加強(qiáng)免疫后3天，摘眼球采血，分離血清保存，同時(shí)取脾臟；d.將脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)4:1左右進(jìn)行混合，并在聚乙二醇(PEG，分子量為1450)的促融作用下進(jìn)行融合，融合細(xì)胞在HAT選擇性培養(yǎng)液(25-046-CIcorningcellgro)中進(jìn)行培養(yǎng)，10天后通過間接ELISA方法篩選出能與SCCA1蛋白反應(yīng)的陽性雜交瘤細(xì)胞，并將初篩得到的陽性雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，兩天后進(jìn)行標(biāo)簽蛋白(His-tag)雜交瘤細(xì)胞的排除，以復(fù)篩出針對(duì)SCCA1蛋白而非標(biāo)簽的雜交瘤細(xì)胞；e.用有限稀釋法將獲得的陽性雜交瘤細(xì)胞連續(xù)亞克隆至少兩次以上，每次亞克隆用HT選擇性培養(yǎng)基(25-047-CIcorningcellgro)進(jìn)行培養(yǎng)，亞克隆8-10天后進(jìn)行ELISA篩選，直至單克隆細(xì)胞陽性率為100％為止，獲得3株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株SCCA1-1，SCCA1-2,SCCA1-3。3、鼠抗SCCA單克隆抗體的制備及單抗亞型的鑒定取60ul雜交瘤細(xì)胞株SCCA1(3株雜交瘤細(xì)胞株SCCA1-1，SCCA1-2,SCCA1-3)的培養(yǎng)上清，按照小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑條(購自美國Raybiotech公司)說明書鑒定雜交瘤細(xì)胞株SCCA1分泌的單克隆抗體的亞型，結(jié)果顯示：雜交瘤細(xì)胞SCCA1上清的抗體亞型為IgG1。實(shí)施例2鼠抗SCCA的腹水單克隆抗體制備及純化包括以下步驟：a.選擇8-12周齡雌性健康BALB/c小鼠，腹腔注射降植烷，0.5mL/只；7-10天后，給每只小鼠腹腔注射1*106～5*106個(gè)實(shí)施例1的三株單克隆雜交瘤細(xì)胞株SCCA1-1，SCCA1-2,SCCA1-3，每株單克隆雜交瘤細(xì)胞注射兩只小鼠，注意從培養(yǎng)皿吹下細(xì)胞或稀釋細(xì)胞需用PBS或無血清培養(yǎng)基；b.將腹水10,000r/min離心15min，除去細(xì)胞成分和其他的沉淀物、脂肪以及油層等，收集中間層；c.飽和硫酸銨沉淀：吸取5mL中間層移入小燒杯中，在攪拌下，逐滴加入過0.22μm濾膜的PBS5.0mL；混合均勻后，再逐滴加入10mL飽和硫酸銨溶液(pH7.4)，繼續(xù)緩慢攪拌30min；靜置2h后10,000r/min離心15分鐘，棄去上清，沉淀物用過0.22μm濾膜的PBS重懸，然后再將該重懸液過0.22μm濾膜；d.根據(jù)抗體不同亞型，選定GEHealthcare公司的不同的純化柱，IgG和IgM的柱子均有相應(yīng)說明書，根據(jù)其說明書配置不同的緩沖液進(jìn)行純化：以IgG抗體純化為例，先用結(jié)合緩沖液、洗脫緩沖液及再生緩沖液將柱子進(jìn)行平衡，通常平衡5個(gè)柱體積，然后將步驟c的腹水重懸液以1mL/min的速度上樣，上樣完成后用結(jié)合緩沖液平衡，再用洗脫液洗至基線位置，收集抗體峰；用PBS緩沖液將抗體進(jìn)行透析，用BCA蛋白定量試劑盒(PierceBCAProteinAssayKit23225ThermoScientific)測(cè)定抗體濃度，并將抗體分裝，置-70℃凍存。表2純化后的三組單克隆抗體特異性對(duì)比測(cè)定從表2結(jié)果可知，第三組SCCA1-3重組蛋白(SEQIDNo:3，抗原)與市售的檢測(cè)抗體(abcam,ab190756)進(jìn)行配對(duì)，檢測(cè)到SCCA1蛋白在宮頸癌血清中有高表達(dá)，而其它兩組抗體雖然與全長重組蛋白SCCA1-4(SEQIDNo:4)有較高的特異性結(jié)合，但與宮頸癌血清中的SCCA1蛋白的結(jié)合量較低。因此，本發(fā)明實(shí)施例4中的試劑盒采用第三組雜交瘤細(xì)胞株SCCA1-3分泌的單克隆抗體作為捕獲抗體，該細(xì)胞株已于2016年6月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國武漢大學(xué)內(nèi))，保藏號(hào)為CCTCCNo:C2016131。實(shí)施例3實(shí)施例2的單克隆抗體的特異性鑒定在本實(shí)施例中，分別應(yīng)用實(shí)施例1中所述的SCCA1重組抗原和CA125、CA153、CEA、AFP、HE4、GP73蛋白作為包被抗原，以實(shí)施例2中制備的單克隆抗體作為識(shí)別抗體，采用間接ELISA來檢測(cè)SCCA。1)、酶標(biāo)板的包被用包被液(Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，Na2N31.2g，加ddH2O到1L，調(diào)pH到9.6)將包被抗原稀釋成1μg/mL，混合均勻后加入到96孔酶標(biāo)板中，每孔100μL，將板密封于4℃過夜。2)、酶標(biāo)板的封閉用含有5％脫脂牛奶的PBS作為封閉液。首先將包被過夜的酶標(biāo)板拍干，加入200μL/well的封閉液，37℃封閉2h，用洗板機(jī)洗板6次后將酶標(biāo)板拍干，并于4℃?zhèn)溆?，?20℃長期保存。3)、間接ELISA檢測(cè)方法在封閉后的酶標(biāo)板中加入實(shí)施例2制備的單克隆抗體，100μL/well，于37℃溫育1h，用洗板機(jī)洗板6次后將酶標(biāo)板拍干，再加入一定濃度的生物素標(biāo)記goatanti-MouseIgGantibody(購自美國Raybiotech)，100μL/well，于37℃溫育1h；洗板后加入鏈霉素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(HRP)(購自美國Raybiotech)，100μL/well，于37℃溫育1h；洗板后加入TMB顯色液，待顯色完全后，加入2M的濃硫酸終止顯色，并用酶標(biāo)儀(美國Biotek)測(cè)定OD450，并對(duì)交叉反應(yīng)進(jìn)行比對(duì)分析，最終結(jié)果表明，實(shí)施例2制備的單克隆抗體僅識(shí)別SCCA1。實(shí)施例4檢測(cè)宮頸癌的酶聯(lián)免疫試劑盒該實(shí)施例的檢測(cè)宮頸癌的酶聯(lián)免疫試劑盒包括以下組成部分：1、ELISA微孔板：已包被捕獲抗體-單克隆抗體，并用5％BSA，0.2％蔗糖的PBS溶液進(jìn)行了封閉，單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞株SCCA1分泌產(chǎn)生，其保藏號(hào)為CCTCCNo:C2016131。2、標(biāo)本稀釋液15ml：加入0.5％BSA,0.05％的吐溫20的PBS緩沖液。3、檢測(cè)抗體稀釋液15ml：加入0.5％BSA,0.05％的吐溫20的PBS緩沖液。4、檢測(cè)抗體：已標(biāo)記HRP的抗SCCA1檢測(cè)抗體凍干粉(abcam,ab190756)。5、標(biāo)準(zhǔn)品：SCCA1重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)品——干粉重組蛋白SCCA1-4。6、10X洗滌液30ml：0.2MTris-HCl,5MNaCl,0.5％吐溫20。7、底物20ml：TMB溶液。8、終止液10ml：2MH2SO4。9、試劑盒產(chǎn)品說明書，包裝盒，塑料薄膜。該實(shí)施例的檢測(cè)宮頸癌的酶聯(lián)免疫試劑盒的操作流程如下：1)在微孔板加入梯度稀釋(1000ng/ml,333ng/ml,111ng/ml,37.1ng/ml,12.3ng/ml,41ng/ml,13ng/ml,0ng/ml)的SCCA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品與30個(gè)待檢測(cè)的血清樣品(樣品來源于中山二院)，每個(gè)樣品做兩個(gè)重復(fù)，每孔加100ul，37℃反應(yīng)40分鐘；2)配置1X洗滌液于洗板機(jī)上洗板5次共10分鐘；3)在微孔板中加入檢測(cè)抗體稀釋液混勻，加入微孔板中孵育40分鐘；4)再次洗滌并加入底物反應(yīng)10分鐘，加入終止液顯色，于酶標(biāo)板上讀數(shù)。根據(jù)讀數(shù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以得出讀數(shù)與SCCA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品之間的線性關(guān)系，將樣品的OD值代入線性公式得出樣品的含量。整個(gè)過程不超過1個(gè)半小時(shí)。試驗(yàn)例1實(shí)施例4的酶聯(lián)免疫試劑盒的質(zhì)量分析1、試劑盒的靈敏度實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說明書進(jìn)行。以零校準(zhǔn)品(A)當(dāng)作樣品測(cè)量20次，計(jì)算其均值及標(biāo)準(zhǔn)差。以A測(cè)定值的均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差所得的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出的濃度為其最低檢測(cè)量。根據(jù)數(shù)據(jù)得出散點(diǎn)圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝0.971x+1.473，R平方值為0.996。稀釋液測(cè)試A值均值為0.01025，標(biāo)準(zhǔn)差值為0.003552242，稀釋液測(cè)試最低檢測(cè)限，靈敏度為OD值為0.017354483。即：實(shí)施例4的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)SCCA的最低檢測(cè)限是0.58ng/mL，線性范圍是：0ng/mL-70ng/mL。2、試劑盒的特異性(交叉反應(yīng))A、將CA125、CA153、CEA、AFP、HE4、GP73抗原稀釋至一定濃度(見表4)后用實(shí)施例4的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表3和表4，其中表3中，1，2列為標(biāo)準(zhǔn)曲線，3，4，5列為以交叉抗原檢測(cè)人血清樣本的數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各交叉抗原1000ng/mL或者1000U/ml的濃度都未見明顯的交叉反應(yīng)。表3交叉抗原檢測(cè)樣本的SCCA1數(shù)據(jù)結(jié)果標(biāo)曲標(biāo)曲3452.2142.1290.0470.0490.0521.5311.3520.0480.0470.0510.7890.7390.0470.0460.0490.3910.2870.0490.0490.0470.1660.1470.0620.0540.0470.1010.0970.0490.0480.0530.0940.0620.050.0530.0570.050.050.0610.0540.055表4交叉抗原檢測(cè)樣本的SCCA1數(shù)據(jù)結(jié)果交叉抗原SCCA測(cè)試值CEA(1000ng/ml)0.5CEA(500ng/ml)0.5GP73(1000ng/ml)0.4GP73(500ng/ml)0.5AFP(1000ng/ml)0.9AFP(500ng/ml)0.5CA153(414u/ml)0.6CA153(207u/ml)0.6CA125(1000u/ml)0.5CA125(500u/ml)0.5HE4(1000ng/ml)0.5HE4(500ng/ml)0.6B、按照相關(guān)統(tǒng)計(jì)得知女性的SCCA1健康人群的參考值為：1.5ng/mL的濃度，以1.5ng/mL作為陰陽性判斷閾值，大于1.5ng/mL的則為真陽性，通過檢測(cè)宮頸鱗癌病人(中山二院)血清30例，標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)如表5所示，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，真陽性的樣本個(gè)數(shù)除以30，即臨床診斷為宮頸鱗癌樣本的總數(shù)，則為敏感性，結(jié)果如表6。表5由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出散點(diǎn)圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝1.127x+1.455，將OD值換算成濃度。表6從表6結(jié)果可知，大于1.5ng/mL的有23例，23/30＝76.6％，即SCCA1作為檢測(cè)宮頸癌的敏感性為76.6％。3、試劑盒的穩(wěn)定性抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1.09至70ng/ml，由OD值可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝1.190x+1.276,R平方值為0.994。表7試劑盒在37℃熱條件下經(jīng)過7天測(cè)試其穩(wěn)定性，采用兩個(gè)質(zhì)控品，其中C1濃度為17.5ng/ml，C2濃度為4.37ng/ml，進(jìn)行了如下測(cè)試：最低檢測(cè)限：20個(gè)空白樣本的平均OD值+2SD作為最低檢測(cè)限的信號(hào)值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線算得即為最低檢測(cè)限。重復(fù)性：即為2個(gè)不同濃度的樣本各重復(fù)測(cè)量10次，平均值除以標(biāo)準(zhǔn)差即為重復(fù)性衡量結(jié)果-精密度。準(zhǔn)確度：將含有SCCA高濃度的樣本，加入到低濃度樣本中，2個(gè)樣本體積不超過1:9，測(cè)量這3個(gè)樣本的SCCA值，以公式計(jì)算回收率來評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度。R=C×(V0+V)-C0×V0V×Cs×100%]]>式中：R——回收率；V——樣品A液的體積；V0——樣品B液的體積；C——樣品B液加入A液后的檢測(cè)濃度；C0——樣品B液的濃度；線性：將一接近測(cè)量上限的高值樣本倍比稀釋后，不少于5個(gè)梯度，進(jìn)行測(cè)量，各樣本測(cè)值與稀釋比例用最小二乘法進(jìn)行擬合，R不小于0.99.結(jié)果如表8所示：表837度加速7天后性能分析最低檢測(cè)限0.6ng/ml重復(fù)性C16％重復(fù)性C23％準(zhǔn)確度96.70％線性0.9999試驗(yàn)例2實(shí)施例4的試劑盒與現(xiàn)有試劑盒的相關(guān)性比對(duì)本發(fā)明所述試劑盒與市面上常用的某進(jìn)口公司診斷試劑盒針對(duì)同一批臨床樣本(55例病人血清)作對(duì)比試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果如表9：表9兩種試劑盒的測(cè)試數(shù)據(jù)對(duì)照采用樣本檢測(cè)值作為X軸，某進(jìn)口公司診斷試劑盒檢測(cè)值作為Y軸繪制散點(diǎn)圖，生成趨勢(shì)線和公式y(tǒng)＝1.198x+0.072，并得R平方值為0.944，結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒與其它試劑盒有很好的相關(guān)性，且所需時(shí)間更短(本發(fā)明試劑盒只需1個(gè)半小時(shí)，而某進(jìn)口公司診斷試劑盒需2.5個(gè)小時(shí))。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3