本發(fā)明屬于納米材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多肽納米材料及其制備方法和應(yīng)用，尤其涉及一種基于雙芘的pH響應(yīng)自組裝的多肽納米材料及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，納米材料在臨床疾病的診斷和治療的應(yīng)用受到了極大的重視。多肽自組裝納米材料由于其良好的生物兼容性和化學(xué)多樣性，被廣泛用于生物成像和治療。而不同尺寸和形貌的納米材料對于生物成像和治療具有極大的影響。如納米顆粒，相關(guān)研究表明，當(dāng)納米顆粒尺寸在10-100nm時(shí)，會增加納米顆粒在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間；而當(dāng)納米尺寸在15-350nm時(shí)，納米顆粒會靶向聚集到心肌梗塞、腫瘤及其它炎癥部位；但是這樣的納米顆粒會被靶向組織快速清除。而且納米顆粒的結(jié)構(gòu)本身就是一個(gè)亞穩(wěn)態(tài)，會隨著時(shí)間及其它因素(酶、溫度、pH等)的改變而發(fā)生形貌轉(zhuǎn)變。其次，相比于納米顆粒，納米纖維具有更好的穩(wěn)定性而且在生物體內(nèi)不容易被清除，能延長材料的滯留時(shí)間。利用納米纖維的這個(gè)性質(zhì)，可以用于生物長效成像和治療。另一方面，小分子成像劑和治療藥物具有一定的疏水性，限制了其生物應(yīng)用。目前對于小分子成像劑和治療藥物的使用方法是用聚合物納米材料對其進(jìn)行密封，這種方法對于小分子成像劑和藥物的可控釋放還具有一定挑戰(zhàn)性。因此開辟一種新的策略用于腫瘤的檢測和治療十分必要。

因此，在本領(lǐng)域中，期望能夠結(jié)合納米纖維的穩(wěn)定性和小分子藥物的疏水性，設(shè)計(jì)一種可以原位轉(zhuǎn)化形成纖維的多肽納米材料，用于招募疏水性的小分子材料并用于生物成像和治療，這種具有潛力的新型診療策略，具有廣泛研究意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于雙芘的多肽納米材料及其制備方法和應(yīng)用，特別是提供一種基于雙芘的pH響應(yīng)自組裝的多肽納米材料及其制備方法和應(yīng)用。

為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種基于雙芘的多肽納米材料，所述納米材料具有如下式I-IV所示結(jié)構(gòu)：

其中R₁為具有分子內(nèi)多重氫鍵的多肽序列，R₂為組氨酸組成的多肽序列，R₃為親水性的聚乙二醇鏈，R₁、R₂和R₃之間由酰胺鍵相連。

本發(fā)明所述結(jié)構(gòu)的多肽納米材料具有pH響應(yīng)性，可以原位轉(zhuǎn)化形成纖維，用于招募疏水的小分子成像劑和藥物，大大提高小分子成像劑和治療藥物的利用率。

優(yōu)選地，所述基于雙芘的多肽納米材料中雙芘化合物基團(tuán)的供體為具有式V所示結(jié)構(gòu)的雙芘化合物：

在基于雙芘的多肽納米材料中雙芘化合物基團(tuán)與R₁或R₂形成酰胺鍵而連接在一起。

優(yōu)選地，R₁為：

其中表示基團(tuán)連接位點(diǎn)。即在本發(fā)明中，R₁的供體結(jié)構(gòu)為：

(可以KLVFF表示)或(可以LPFFD表示)。

優(yōu)選地，R₂的供體為由4-10個(gè)組氨酸構(gòu)成的多肽，例如R₂的供體為由4、5、6、7、8、9或10個(gè)組氨酸構(gòu)成的多肽，優(yōu)選由6個(gè)組氨酸構(gòu)成的六肽。

優(yōu)選地，R₃的供體為羧基封端的聚乙二醇，其重均分子量為300-2000，例如300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800或2000。

另一方面，本發(fā)明提供了所述基于雙芘的多肽納米材料的制備方法，所述方法以樹脂為載體，以式V所示雙芘化合物和氨基酸作為原料，利用固相合成方法制備得到所述基于雙芘的多肽納米材料。

另一方面，本發(fā)明提供了所述基于雙芘的多肽納米材料的pH響應(yīng)性自組裝方法，所述方法包括以下步驟：

(1)將基于雙芘的多肽納米材料溶于有機(jī)溶劑中，得到多肽納米材料溶液；

(2)將步驟(1)得到的多肽納米材料溶液加入緩沖溶液中，在1.0≤pH＜8.0的緩沖液中，所述多肽納米材料自組裝為納米纖維；在pH≥8.0的緩沖液中，所述多肽納米材料自組裝為納米球。

優(yōu)選地，步驟(1)所述有機(jī)溶劑為DMSO、DMF或1,4-二氧六環(huán)中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選DMSO。

優(yōu)選地，步驟(1)所述多肽納米材料溶液的濃度為10^-4-10^-2M，例如1×10^-4M、3×10^-4M、5×10^-4M、8×10^-4M、1×10^-3M、3×10^-3M、5×10^-3M、8×10^-3M或1×10^-2M。

優(yōu)選地，步驟(2)所述自組裝在超聲下進(jìn)行，所述超聲的時(shí)間為1-10min，例如1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。

優(yōu)選地，步驟(2)所述超聲后在20-40℃(例如22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃或38℃)保持0.5-12h(例如0.8h、1h、3h、5h、8h、10h、11h或12h)。

本發(fā)明的基于雙芘的多肽納米材料具有pH響應(yīng)性，在不同pH值下可以自組裝成不同的形態(tài)，本發(fā)明制備得到的納米纖維或納米球，相對于納米顆粒，具有更好的穩(wěn)定性，在生物體內(nèi)不容易被清除，在生物體內(nèi)具有較長的滯留時(shí)間，并且具有良好的生物兼容性、EPR效應(yīng)、良好的pH敏感性以及對疏水的小分子藥物招募的能力。

另一方面，本發(fā)明提供了所述基于雙芘的多肽納米材料在制備癌癥治療藥物以及生物成像劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的pH響應(yīng)性多肽納米材料，基于其對pH的良好敏感性，可以原位轉(zhuǎn)化形成纖維，用于招募疏水的小分子成像劑和藥物，大大提高小分子成像劑和治療藥物的利用率，具有廣泛的應(yīng)用前景。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的基于雙芘的多肽納米材料具有pH響應(yīng)性，在1.0≤pH＜8.0的環(huán)境下自組裝形成納米纖維，在pH≥8.0的環(huán)境下組裝成納米球，可以招募疏水的小分子成像劑和藥物，大大提高小分子成像劑和治療藥物的利用率，該納米材料可在疾病組織或細(xì)胞部位原位轉(zhuǎn)化為纖維，可以大大延長滯留時(shí)間，可用于生物成像和治療，為疾病(尤其是癌癥)治療提供可靠診斷以及靶向治療方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1制備的基于雙芘的多肽納米材料的質(zhì)譜圖；

圖2是實(shí)施例1制備的基于雙芘的多肽納米材料自組裝能力測試得到的熒光強(qiáng)度曲線圖；

圖3是實(shí)施例1制備的基于雙芘的多肽納米材料在超純水(A圖)和pH＝6.0的緩沖液(B圖)中自組裝后的透射電鏡圖，A圖和B圖中的標(biāo)尺均為100nm；

圖4是利用實(shí)施例1制備的基于雙芘的多肽納米材料與尼羅紅對細(xì)胞進(jìn)行共孵育后的單光子激光共聚焦照片，其中A圖為細(xì)胞球在405nm激光激發(fā)條件下的明場共聚焦結(jié)果圖，B圖為細(xì)胞球405nm激光激發(fā)條件下收集450-550nm時(shí)呈雙芘綠光的結(jié)果圖，C圖為細(xì)胞球405nm激光激發(fā)條件下收集550-700nm時(shí)呈尼羅紅紅光的結(jié)果圖；

圖5是實(shí)施例1制備的基于雙芘的多肽納米材料在癌癥細(xì)胞表面發(fā)生原位形貌轉(zhuǎn)化的掃描電鏡照片，其中B圖為A圖中所選位置的放大圖，A圖標(biāo)尺為50μm，B圖標(biāo)尺為5μm；

圖6是實(shí)施例1制備的基于雙芘的多肽納米材料用于招募熒光染料尼羅紅的小動物成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；其中A圖為靜脈注射基于雙芘的多肽納米材料與尼羅紅4h后的成像結(jié)果圖，B圖為靜脈注射基于雙芘的多肽納米材料與尼羅紅96h后的成像結(jié)果圖；

圖7是實(shí)施例6制備的基于雙芘的多肽納米材料的質(zhì)譜圖；

圖8是實(shí)施例6制備的基于雙芘的多肽納米材料自組裝能力測試得到的熒光強(qiáng)度曲線圖；

圖9是實(shí)施例6制備的基于雙芘的多肽納米材料在(A圖)和pH＝6.0的緩沖液(B圖)中自組裝后的透射電鏡圖，A圖和B圖中的標(biāo)尺均為100nm；

圖10是實(shí)施例6制備的基于雙芘的多肽納米材料與尼羅紅對細(xì)胞進(jìn)行共孵育后的單光子激光共聚焦照片，A圖為細(xì)胞球在405nm激光激發(fā)條件下的明場共聚焦結(jié)果圖，B圖為細(xì)胞球405nm激光激發(fā)條件下收集450-550nm時(shí)呈雙芘綠光的結(jié)果圖，C圖為細(xì)胞球405nm激光激發(fā)條件下收集550-700nm時(shí)呈尼羅紅紅光的結(jié)果圖；

圖11是實(shí)施例6中的基于雙芘的多肽納米材料在癌癥細(xì)胞表面發(fā)生原位形貌轉(zhuǎn)化的掃描電鏡照片，其中B圖為A圖中所選位置的放大圖，A圖標(biāo)尺為50μm，B圖標(biāo)尺為5μm；

圖12是實(shí)施例6制備的基于雙芘的多肽納米材料用于招募熒光染料尼羅紅的小動物成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，其中A圖為靜脈注射基于雙芘的多肽納米材料與尼羅紅4h后的成像結(jié)果圖，B圖為靜脈注射基于雙芘的多肽納米材料與尼羅紅96h后的成像結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。

實(shí)施例1

在本實(shí)施例中，基于雙芘的多肽納米材料的結(jié)構(gòu)如下所示：

即在本發(fā)明所提供的式II中，R₁的供體為KLVFF，R₂的供體為由6個(gè)組氨酸構(gòu)成的六肽，R₃的供體為羧基封端的聚乙二醇，其分子量為1000g mol^-1。

所述基于雙芘的多肽納米材料以多肽的固相合成方法來合成，采用王氏樹脂，按照多肽順序，通過偶聯(lián)劑(氮甲基嗎啉：DMF＝5：95，體積比)進(jìn)行偶聯(lián)，其中帶有羧基的PEG及雙芘化合物也同樣按照氨基酸的偶聯(lián)方法進(jìn)行反應(yīng)，最后經(jīng)三氟乙酸裂解、旋蒸、乙醚純化而得。

對本實(shí)施例合成的基于雙芘的多肽納米材料進(jìn)行質(zhì)譜表征，結(jié)果如圖1所示，由該圖可知，圖中所出現(xiàn)的離子峰滿足材料分子的分子量的特征峰，而且峰形完全符合PEG聚合鏈的特征峰。

實(shí)施例2

在本實(shí)施例中對實(shí)施例1制備得到的基于雙芘的多肽納米材料進(jìn)行自組裝，考察該材料的pH響應(yīng)性。

首先，測試基于雙芘的多肽納米材料的自組裝能力，將實(shí)施例1制備得到的基于雙芘的多肽納米材料溶于DMSO中，測試其熒光強(qiáng)度，而后加水進(jìn)行組組裝，每加一定量的水后使水與有機(jī)相充分混合，之后靜置一分鐘測試其熒光強(qiáng)度，測試結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出，在向基于雙芘的多肽納米材料的DMSO溶液中加入H₂O時(shí)熒光增強(qiáng)，表明材料從單分散變?yōu)榫奂瘧B(tài)。

所述基于雙芘的多肽納米材料的pH響應(yīng)性自組裝方法如下：

稱取基于雙芘的多肽納米材料5mg溶于10mL DMSO溶劑中，將此溶液用注射器分別快速注射到90mL的超純水中和pH＝6.0的緩沖液中，超聲30分鐘，靜置兩小時(shí)，分別得到熒光納米顆粒和納米纖維分散液。

圖3是實(shí)施例1制備得到的基于雙芘的多肽納米材料在超純水和pH＝6.0的緩沖液中自組裝后的透射電鏡圖，由圖3可知，基于雙芘的多肽納米材料具有pH響應(yīng)性，在pH逐漸變?yōu)樗嵝詶l件下，形貌會由納米顆粒變?yōu)槔w維狀。

實(shí)施例3

對實(shí)施例1制備得到的基于雙芘的多肽納米材料進(jìn)行細(xì)胞共聚焦測試，考察其對藥物或成像劑的招募情況，方法如下：

準(zhǔn)備細(xì)胞懸浮液，每個(gè)共聚焦培養(yǎng)皿1mL，培養(yǎng)過夜。取出培養(yǎng)基，加入基于雙芘的多肽納米材料濃度20μM的培養(yǎng)基1mL，過夜；用20μM的Nile Red(尼羅紅)替換藥品，培養(yǎng)2小時(shí)，用PBS清洗3遍，進(jìn)行共聚焦成像實(shí)驗(yàn)，采用405nm激光通道，收集綠光波段450-550nm，紅光波段550-700nm。

結(jié)果如圖4所示，細(xì)胞球與材料、尼羅紅共孵育，單光子共聚焦實(shí)驗(yàn)，在405nm激發(fā)時(shí)，當(dāng)采集450-550nm范圍時(shí)，呈雙芘的綠光；當(dāng)采集550-700nm范圍時(shí)，呈尼羅紅的紅光，即發(fā)生FRET(熒光能量共振轉(zhuǎn)移)，證明材料能在細(xì)胞表面大量聚集，有效招募尼羅紅熒光染料。

實(shí)施例4

在該實(shí)施例中考察實(shí)施例1制備得到的基于雙芘的多肽納米材料在癌癥細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)化情況，方法如下：

配制1％的瓊脂糖凝膠溶液(0.1g瓊脂糖溶于10mL水)，加熱至沸騰，迅速轉(zhuǎn)移至超凈臺，96孔板每孔加入100μL瓊脂糖溶液。然后打開紫外燈照射30min。準(zhǔn)備好MCF-7細(xì)胞懸浮液每孔加入2000個(gè)細(xì)胞，每孔200μL。培養(yǎng)7天，取出培養(yǎng)基，每個(gè)孔加入基于雙芘的多肽納米材料濃度為20μM培養(yǎng)基，體積為200μL，培養(yǎng)24h。取出細(xì)胞球，20％的戊二醛溶液(戊二醛：PBS緩沖液＝1:4)固化2-3h，再依次用PBS稀釋好的30％、50％、70％、90％、100％的乙醇溶液脫水處理，每個(gè)濃度脫水三次，每次10分鐘。然后用叔丁醇溶液置換出水和乙醇，置換3次，每次10分鐘。最后將處理好的細(xì)胞團(tuán)實(shí)驗(yàn)滴加到硅片，干燥，掃描觀察。

結(jié)果如圖5所示，可見實(shí)施例1制備得到的基于雙芘的多肽納米材料在癌細(xì)胞表面發(fā)生原位轉(zhuǎn)化，形成纖維。

實(shí)施例5

在本實(shí)施例中考察實(shí)施例1制備得到的基于雙芘的多肽納米材料在小動物體內(nèi)的成像情況，方法如下：

小鼠皮下注射約10⁶個(gè)MCF-7細(xì)胞，用于腫瘤生長建立老鼠模型。當(dāng)小鼠腫瘤長至直徑約5.0mm左右時(shí)，開始用于成像實(shí)驗(yàn)。首先，靜脈注射200μL藥物，濃度為200μM；8小時(shí)后，靜脈注射20μM的Nile Red溶液200μL，立即進(jìn)行小動物成像實(shí)驗(yàn)，收集波段550-600nm。

結(jié)果如圖6所示，該圖表明：靜脈注射藥品之后，再注射尼羅紅，4h能檢測到尼羅紅信號，表明材料能具有招募熒光分子的能力；在96h后，在小鼠腫瘤部位還能檢測到尼羅紅的信號，表明材料在腫瘤部位能夠超長時(shí)間滯留，且能招募熒光分子用于癌癥的檢測。

實(shí)施例6

在本實(shí)施例中，基于雙芘的多肽納米材料的結(jié)構(gòu)如下所示：

即在本發(fā)明所提供的式IV中，R₁的供體為KLVFF，R₂的供體為由6個(gè)組氨酸構(gòu)成的六肽，R₃的供體為羧基封端的聚乙二醇，其分子量為1000g mol^-1。

所述基于雙芘的多肽納米材料利用如實(shí)施例1中所述的多肽的固相合成方法來合成。

對本實(shí)施例合成的基于雙芘的多肽納米材料進(jìn)行質(zhì)譜表征，結(jié)果如圖7所示，由該圖可知，圖中所出現(xiàn)的離子峰滿足材料分子的分子量的特征峰，而且峰形完全符合PEG聚合鏈的特征峰。

實(shí)施例7

在本實(shí)施例中對實(shí)施例6制備得到的基于雙芘的多肽納米材料進(jìn)行自組裝，考察該材料的自組裝能力和pH響應(yīng)性。

首先，測試基于雙芘的多肽納米材料的自組裝能力，將實(shí)施例6制備得到的基于雙芘的多肽納米材料溶于DMSO中，測試其熒光強(qiáng)度，而后加水進(jìn)行組組裝，每加一定量的水后使水與有機(jī)相充分混合，之后靜置一分鐘測試其熒光強(qiáng)度，測試結(jié)果如圖8所示。

從圖8中可以看出，在向基于雙芘的多肽納米材料的DMSO溶液中加入H₂O時(shí)熒光增強(qiáng)，表明材料從單分散變?yōu)榫奂瘧B(tài)。

所述基于雙芘的多肽納米材料的pH響應(yīng)性自組裝方法如下：

稱取化合物5mg溶于10mL DMSO溶劑，將此溶液用注射器分別快速注射到90mL到超純水中和pH＝6.0的緩沖液中，超聲30分鐘，靜置兩小時(shí)，分別得到熒光納米顆粒和納米纖維分散液。

圖9是實(shí)施例6制備得到的基于雙芘的多肽納米材料在超純水和pH＝6.0的緩沖液中自組裝后的透射電鏡圖，由圖9可知，基于雙芘的多肽納米材料具有pH響應(yīng)性，在pH逐漸變?yōu)樗嵝詶l件下，形貌會由納米顆粒變?yōu)槔w維狀。

實(shí)施例8

對實(shí)施例6制備得到的基于雙芘的多肽納米材料進(jìn)行細(xì)胞共聚焦測試，考察其對藥物或成像劑的招募情況，方法如下：

準(zhǔn)備細(xì)胞懸浮液，每個(gè)共聚焦培養(yǎng)皿1mL，培養(yǎng)過夜。取出培養(yǎng)基，加入基于雙芘的多肽納米材料濃度20μM的培養(yǎng)基1mL，過夜；用20μM的Nile Red(尼羅紅)替換藥品，培養(yǎng)2小時(shí)，用PBS清洗3遍，進(jìn)行共聚焦成像實(shí)驗(yàn)，采用405nm激光通道，收集綠光波段450-550nm，紅光波段550-700nm。

結(jié)果如圖10所示，細(xì)胞球與材料、尼羅紅共孵育，單光子共聚焦實(shí)驗(yàn)，在405nm激發(fā)時(shí)，當(dāng)采集450-550nm范圍時(shí)，呈雙芘的綠光；當(dāng)采集550-700nm范圍時(shí)，呈尼羅紅的紅光，即發(fā)生FRET(熒光能量共振轉(zhuǎn)移)，證明材料能在細(xì)胞表面大量聚集，有效招募尼羅紅熒光染料。

實(shí)施例9

在該實(shí)施例中考察實(shí)施例6制備得到的基于雙芘的多肽納米材料在癌癥細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)化情況，方法如下：

配置1％的瓊脂糖凝膠溶液(0.1g瓊脂糖溶于10mL水)，加熱至沸騰，迅速轉(zhuǎn)移至超凈臺，96孔板每孔加入100μL瓊脂糖溶液。然后打開紫外燈照射30min。準(zhǔn)備好MCF-7細(xì)胞懸浮液每孔加入2000個(gè)細(xì)胞，每孔200μL。培養(yǎng)7天，取出培養(yǎng)基，每個(gè)孔加入藥品濃度為20μM培養(yǎng)基，體積為200μL，培養(yǎng)24h。取出細(xì)胞球，20％的戊二醛溶液(戊二醛：PBS緩沖液＝1:4)固化2-3h，再依次用PBS稀釋好的30％、50％、70％、90％、100％的乙醇溶液脫水處理，每個(gè)濃度脫水三次，每次10分鐘。然后用叔丁醇溶液置換出水和乙醇，置換3次，每次10分鐘。最后將處理好的細(xì)胞團(tuán)實(shí)驗(yàn)滴加到硅片，干燥，掃描觀察。

結(jié)果如圖11所示，可見實(shí)施例6制備得到的基于雙芘的多肽納米材料在癌細(xì)胞表面發(fā)生原位轉(zhuǎn)化，形成纖維。

實(shí)施例10

在本實(shí)施例中考察實(shí)施例6制備得到的基于雙芘的多肽納米材料在小動物體內(nèi)的成像情況，方法如下：

小鼠皮下注射約10⁶個(gè)MCF-7細(xì)胞，用于腫瘤生長建立老鼠模型。當(dāng)小鼠腫瘤長至直徑約5.0mm左右時(shí)，開始用于成像實(shí)驗(yàn)。首先，靜脈注射200μL藥物，濃度為200μM；8小時(shí)后，靜脈注射20μM的Nile Red溶液200μL，立即進(jìn)行小動物成像實(shí)驗(yàn)，收集波段550-600nm。

結(jié)果如圖12所示，該圖表明：靜脈注射藥品之后，再注射尼羅紅，4h能檢測到尼羅紅信號，表明材料能具有招募熒光分子的能力；在96h后，在小鼠腫瘤部位還能檢測到尼羅紅的信號，表明材料在腫瘤部位能夠超長時(shí)間滯留，且能招募熒光分子用于癌癥的檢測。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的基于雙芘的pH響應(yīng)自組裝的多肽納米材料及其制備方法和應(yīng)用，但本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施例，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述實(shí)施例才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。