本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及基因檢測試劑盒，具體地涉及一種UGT1A1基因突變位點檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：膽紅素在肝臟內(nèi)的代謝主要是通過尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)實現(xiàn)的，UGT1A1基因異常可導(dǎo)致肝臟微粒體的膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶表達下降，從而引起膽紅素代謝障礙。目前UGT1A1基因異常，包括遠端加強序列即苯巴比妥反應(yīng)增強元件(PBREM)-3279位點突變，PBREM約位于TATA上游，此突變與基因轉(zhuǎn)錄活性下降導(dǎo)致的膽紅素水平升高顯著相關(guān)；啟動子區(qū)域TA盒中TA堿基序列插入突變，表現(xiàn)為二核苷酸(TA)插入到UGT1A1基因啟動子上游約25～35個bp處的TATA盒中，使正常野生型A(TA)6TAA突變?yōu)锳(TA)7TAA?，F(xiàn)有技術(shù)中，主要通過PCR測序技術(shù)來檢測UGT1A1基因突變位點，但是測序價格較貴，耗時較長，增加了患者的經(jīng)濟負擔(dān)。因此必須尋找一種應(yīng)用簡單、結(jié)果可靠、價格低廉的技術(shù)來開發(fā)UGT1A1基因突變位點檢測試劑盒。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種UGT1A1基因突變位點檢測試劑盒，采用該檢測試劑盒來對UGT1A1基因突變位點進行檢測時，其測序價格低廉、耗時短、結(jié)果可靠，減輕了患者的經(jīng)濟負擔(dān)。為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種UGT1A1基因突變位點檢測試劑盒，所述的試劑盒是由DNA微列陣芯片及4種核苷酸探針部分組成，所述的DNA微列陣芯片是由丙烯酰胺修飾的PCR產(chǎn)物及其他成分固定于用丙烯基團修飾的玻片上制成的，其中，所述的丙烯酰胺修飾的PCR產(chǎn)物部分由4種引物PCR擴增獲得，所述的引物序列分別如SEQIDNO.1，SEQIDNO.2，SEQIDNO.3，SEQIDNO.4所示，所述的核苷酸探針部分序列分別如SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7，SEQIDNO.8所示。優(yōu)選地，所述的其他成分是由濃度為42％的丙烯酰胺、濃度為38％的丙三醇以及濃度為18％的過硫酸銨組成的混合溶液。優(yōu)選地，采用PCR產(chǎn)物及其成分固定于丙烯基團修飾的玻片上所制成的DNA微陣列芯片，用于與相應(yīng)的探針進行雜交反應(yīng)。進一步優(yōu)選地，在25℃～30℃的溫度條件下進行所述雜交反應(yīng)。優(yōu)選地，所述的檢測試劑盒還包括陽性質(zhì)控品，所述的陽性質(zhì)控品為UGT1A1增強元件PBREM基因片段及UGT1A1啟動子區(qū)片段。優(yōu)選地，所述DNA微列陣芯片的制備步驟如下：1)點樣，將所述由丙烯酰胺修飾后的PCR產(chǎn)物經(jīng)無水乙醇沉淀后與其他成分混合成PCR產(chǎn)物預(yù)聚合物，然后將所述的PCR產(chǎn)物預(yù)聚合物和空白對照預(yù)聚合物手動點樣于丙烯基團修飾的玻片上，其中，所述的其他成分為由濃度為42％的丙烯酰胺、濃度為38％的丙三醇以及濃度為18％的過硫酸銨組成的混合溶液，所述的空白對照預(yù)聚合物為水和所述的其他成分混合成的預(yù)聚合物；2)固定，點樣完成后，將玻片置于潮濕的盛有TEMED的容器中，在真空狀態(tài)下當(dāng)TEMED揮發(fā)到玻片表面時，丙烯基團之間會發(fā)生共聚合反應(yīng)，從而將丙烯酰胺修飾的PCR產(chǎn)物固定于用丙烯基團修飾的玻片上得到所述的DNA微列陣芯片。由于上述技術(shù)方案的運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點：本發(fā)明的UGT1A1基因突變位點檢測試劑盒，可替代PCR測序技術(shù)來檢測UGT1A1基因突變位點，與PCR測序技術(shù)相比，其操作簡便、價格低廉、結(jié)果可靠，更適用于臨床實驗室檢測。附圖說明附圖1為3個已知增強元件-3279位點的新鮮血樣本位點擴增后熒光雜交圖像；附圖2為3個已知啟動子區(qū)A(TA)6TAA/A(TA)7TAA插入突變的新鮮血樣本位點擴增后熒光雜交圖像。具體實施方式以下結(jié)合具體實施例對上述方案作進一步說明，應(yīng)理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中所采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。本發(fā)明公開了一種UGT1A1基因突變位點檢測試劑盒，該試劑盒是由DNA微列陣芯片及4種核苷酸探針部分組成，DNA微列陣芯片是由丙烯酰胺修飾的PCR產(chǎn)物及其他成分固定于用丙烯基團修飾的玻片上制成，其中，丙烯酰胺修飾的PCR產(chǎn)物部分由4種引物PCR擴增獲得，所述的引物序列參見表一，分別如SEQIDNO.1，SEQIDNO.2，SEQIDNO.3，SEQIDNO.4所示，所述的核苷酸探針部分序列參見表二，分別如SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7，SEQIDNO.8所示。表一4種引物序列序列號序列(5’-3’)1AACTCATCCTTATTCTGA2丙烯酰胺-TCATGCCTCCTCTCTAAC3CGAGCTACCTTTGTGGAC4丙烯酰胺-ACGATGCCCGAGACTAACT表二核苷酸探針序列序列號序列(5’-3’)5TTCTGTTTGAAG6TTCTGTGTGAAG7CATATATATATATATAAG8CATATATATATATATATAAG本發(fā)明中，所述的其他成分是由濃度為42％的丙烯酰胺、濃度為38％的丙三醇以及濃度為18％的過硫酸銨組成的混合溶液。采用PCR產(chǎn)物及其成分固定于丙烯基團修飾的玻片上所制成的DNA微陣列芯片，用于與相應(yīng)的探針進行雜交反應(yīng)。具體的，在25℃～30℃的溫度條件下進行上述雜交反應(yīng)。本例中，該DNA微列陣芯片的制備步驟如下：1)點樣，將由丙烯酰胺修飾后的PCR產(chǎn)物經(jīng)無水乙醇沉淀后與其他成分混合成PCR產(chǎn)物預(yù)聚合物，然后將的PCR產(chǎn)物預(yù)聚合物和空白對照預(yù)聚合物手動點樣于丙烯基團修飾的玻片上，其中，的其他成分為由濃度為42％的丙烯酰胺、濃度為38％的丙三醇以及濃度為18％的過硫酸銨組成的混合溶液，的空白對照預(yù)聚合物為水和的其他成分混合成的預(yù)聚合物；2)固定，點樣完成后，將玻片置于潮濕的盛有TEMED的容器中，在真空狀態(tài)下當(dāng)TEMED揮發(fā)到玻片表面時，丙烯基團之間會發(fā)生共聚合反應(yīng)，從而將丙烯酰胺修飾的PCR產(chǎn)物固定于用丙烯基團修飾的玻片上得到的DNA微列陣芯片。實施例1制備UGT1A1基因突變位點檢測試劑盒表三UGT1A1基因突變位點檢測試劑盒的組成成分該檢測試劑盒的具體制作方法如下：1、核酸提?。和扑]使用QIAGENQIAampbloodminikit，具體操作參見該試劑盒說明書，最后收集到200μlDNA溶液，直接進行檢測或保存于-20℃。2、PCR擴增及檢測2.1試劑準(zhǔn)備：按比例取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液(35μl/人份)，按35μl/管分裝成PCR反應(yīng)管，備用。2.2加樣：向PCR反應(yīng)管中，分別加入提取后的DNA溶液15μl，陽性質(zhì)控品15μl。2.3PCR擴增條件：94℃5min；94℃30sec,55℃50sec,72℃45sec；32cycles；72℃10min。2.4PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。3、PCR產(chǎn)物的點樣及固定PCR產(chǎn)物經(jīng)無水乙醇沉淀后與濃度為42％的丙烯酰胺、濃度為38％的丙三醇、濃度為18％的過硫酸銨混合成預(yù)聚合物，然后將PCR產(chǎn)物預(yù)聚合物和空白對照預(yù)聚合物手動點樣于丙烯基團修飾的玻片上，在本實施例中，點樣模式為：每一類型的基因片段點在一張玻片上，點成四行，每張玻片上每個樣本重復(fù)點樣2次。點樣完成后，將玻片置于潮濕的盛有TEMED的容器中，在真空狀態(tài)下當(dāng)TEMED揮發(fā)到玻片表面時，丙烯基團之間會發(fā)生共聚合反應(yīng)，從而將丙烯酰胺修飾的PCR產(chǎn)物固定于用丙烯基團修飾的玻片上。4、雜交固定完成后，為了獲得雜交所需的單鏈DNA，將固定在玻片上的雙鏈DNA用0.10M的NaOH溶液處理10min以變性，然后在37℃分別與表三中相應(yīng)的10μM的探針雜交2小時。5、電泳去除非特異性雜交的探針雜交完成后，玻片在1xTBE緩沖溶液中常溫下，38V/cm電壓下電泳25分鐘。6、激光共焦掃描儀掃描電泳后的玻片用水沖洗，然后用氮氣吹干，最后用激光共焦掃描儀掃描得到雜交結(jié)果掃描圖像，參見圖1、圖2。圖1中的四個熒光雜交圖像所對應(yīng)的樣本分別為：1、空白對照；2、野生型純合子-3279T/T樣本；3、突變純合子-3279G/G樣本；4、雜合子-3279T/G樣本；圖2中的四個熒光雜交圖像所對應(yīng)的樣本分別為：5、空白對照；6、野生型純合子A(TA)6TAA樣本；7、突變純合子A(TA)7TAA樣本；8、雜合子A(TA)6/7TAA樣本。結(jié)合圖1、圖2可得出相關(guān)結(jié)果，見表四。表四從表四中可以得出，通過掃描得到的結(jié)果與PCR測序結(jié)果相一致，由此可見，采用本發(fā)明的檢測試劑盒可替代PCR測試技術(shù)用于檢測UGT1A1基因突變位點。而本發(fā)明的檢測試劑盒操作簡便、結(jié)果可靠、價格低廉，大大減少了患者的經(jīng)濟負擔(dān)。上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3