本發(fā)明涉及的是一種生物醫(yī)藥領(lǐng)域的技術(shù)，具體是一種純度達(dá)到95％以上的蕁麻新苷Ⅰ、蕁麻新苷Ⅱ，以及純度達(dá)60％以上的蕁麻木脂素的制備方法。

背景技術(shù)：

蕁麻Urtica fissa E.Pritz.始載于《圖經(jīng)本草》，藥用歷史悠久。其根及根莖入藥稱蕁麻根，為一常用民族藥，具有祛風(fēng)、活血、止痛之功效，主治風(fēng)濕疼痛、蕁麻疹、濕疹等癥，在漢、藏、彝、苗、羌、土家、布依、維吾爾、瑤、傈僳、納西族等多個民族中廣泛應(yīng)用。近年來，發(fā)現(xiàn)蕁麻具有明顯的抑制前列腺增生、抗類風(fēng)濕作用，但其活性成分尚不清楚。

目前國內(nèi)學(xué)者從蕁麻根中分離鑒定了多個木脂素、三萜、甾體、多糖等成分。

然而，蕁麻根化學(xué)成分復(fù)雜，除含有木脂素類成分外，還含有大量黃酮、核苷、脂肪酸、生物堿類成分。蕁麻新苷Ⅰ、蕁麻新苷Ⅱ、蕁麻木脂素在蕁麻根中含量低，加上大量雜質(zhì)干擾，因此分離難度大，目前尚未見有制備蕁麻新苷Ⅰ、蕁麻新苷Ⅱ、蕁麻木脂素的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種高純度蕁麻新苷及蕁麻木脂素的制備方法，制備得到的蕁麻新苷能夠用于蕁麻藥材的準(zhǔn)確快速鑒定、質(zhì)量評價；蕁麻木脂素用于類風(fēng)濕藥物的制備。該方法具有簡便、快速、純度高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明涉及一類單萜類化合物，具體為蕁麻新苷Ⅰ(Urticaside Ⅰ)和蕁麻新苷Ⅱ(Urticaside Ⅱ)，均具有顯著的抑制5‐α還原酶作用，是蕁麻根抑制前列腺增生的活性成分；結(jié)構(gòu)新穎，也是蕁麻的特征性成分，其結(jié)構(gòu)式如下所示：

本發(fā)明還涉及一種蕁麻木脂素，具有顯著的抗類風(fēng)濕作用，是蕁麻抗類風(fēng)濕的有效藥物。其主要成分及含量為：蕁麻醇8％、蕁麻內(nèi)酯A 12％、蕁麻內(nèi)酯B 24％、蕁麻醇‐7‐O‐β‐D‐葡萄糖苷10％、開環(huán)異落葉松脂素5％、臭矢菜素A 4％，主要成分的結(jié)構(gòu)式如下所示：

所述的單萜類化合物、蕁麻木脂素通過從蕁麻(Urtica fissa E.Pritz.)中提取得到。

本發(fā)明涉及上述單萜類化合物的應(yīng)用，將其用于蕁麻藥材的真?zhèn)舞b定及優(yōu)劣評價，以及制備抑制前列腺增生的藥物，具體為抑制5‐α還原酶。所涉及蕁麻木脂素的應(yīng)用，將其用于制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物。

本發(fā)明涉及上述單萜類化合物的提取方法，通過將蕁麻(Urtica fissa E.Pritz.)乙醇提取、脫色脫脂、萃取木脂素后，得到含蕁麻新苷的水溶液依次經(jīng)大孔樹脂柱層析以及硅膠柱層析，得到蕁麻新苷粗品，最后經(jīng)HPLC制備分離并分別收集兩個主峰，分別得到蕁麻新苷Ⅰ(Urticaside Ⅰ)和蕁麻新苷Ⅱ(Urticaside Ⅱ)。

所述的蕁麻，具體采用蕁麻干燥根及根莖，經(jīng)干燥后粉碎。

所述的萃取木脂素，優(yōu)選對蕁麻根先進(jìn)行乙醇回流提取，得到醇浸膏。醇浸膏先經(jīng)石油醚脫色脫脂后，采用但不限于乙酸乙酯進(jìn)行萃取。

所述的制備單萜類成分過程中涉及的大孔樹脂層析以及硅膠柱層析，均通過TLC檢測并合并主斑點相同(Rf0.4‐0.5)的流份。

所述方法具體包括：

步驟1)蕁麻根粉碎，乙醇回流提取，回收乙醇(可再次使用)得醇浸膏。醇浸膏懸浮于水，石油醚脫脂、脫色素后，采用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯(可再次用于萃取)得乙酸乙酯浸膏；水層水浴上濃縮至無酸乙酯味，得含蕁麻新苷的水溶液。

所述的蕁麻為蕁麻科蕁麻屬植物蕁麻Urtica fissa E.Pritz.的干燥根及根莖。

所述的乙醇提取，乙醇濃度為70～95％，乙醇和蕁麻干粉的料液比為1∶10～1∶14(g/ml)，時間為1～3h，提取次數(shù)為2～3次。

所述的石油醚、乙酸乙酯萃取，石油醚‐水、乙酸乙酯‐水的比例均為1：1(v/v)，萃取次數(shù)為2～3次。

步驟2)含蕁麻新苷的水溶液經(jīng)D101大孔樹脂柱層析，經(jīng)乙醇洗脫后進(jìn)行TLC檢測，合并主斑點相同(Rf0.4‐0.5)的流份，回收乙醇(可再次使用)得蕁麻苷提取物。

所述的大孔樹脂柱層析樹脂用量為藥材重量的2～3倍，每個梯度洗脫3～5個柱體積(BV)，流速為0.6BV/h，0.3BV/流份。

所述的乙醇洗脫，具體為：先以30％乙醇洗脫，然后用55％、80％的乙醇洗脫，最后收集55％、80％乙醇洗脫液。

所述的TLC法檢測為：將樣品溶于甲醇，硅膠板上點樣，以二氯甲烷‐甲醇3：1(v/v)為展開劑，展開后吹干展開劑，以10％硫酸乙醇溶液為顯色劑，加熱顯色進(jìn)行檢測。

步驟3)蕁麻苷提取物進(jìn)行硅膠柱層析，二氯甲烷‐甲醇梯度洗脫，收集洗脫液后進(jìn)行TLC檢測，合并主斑點相同(Rf0.4‐0.5)的流份，減壓回收溶劑，得蕁麻新苷粗品。

所述的硅膠柱層析粒徑為200～300目，樣量比為1∶40～1∶60(樣品比硅膠，w/w)。所述的梯度洗脫為二氯甲烷‐甲醇比例為90：10、85：15、80：20、75：25(v/v)，每個梯度洗脫4～6個BV，流速0.6BV/h，0.3BV/流份。

步驟4)將蕁麻新苷粗品進(jìn)行HPLC制備分離，分別收集兩個主峰并回收溶劑，即得蕁麻新苷Ⅰ、蕁麻新苷Ⅱ精制品。

所述的HPLC制備分離，檢測波長為210nm，流動相甲醇‐水(1：1)，所用色譜柱為C₁₈柱。

本發(fā)明涉及一種基于上述方法的蕁麻木脂素提取方法，通過將步驟1)中的浸膏進(jìn)行甲醇處理，離心，棄去不溶物；甲醇溶液回收溶劑后進(jìn)行硅膠柱層析，先以二氯甲烷洗脫，回收二氯甲烷，棄去提取物；然后用二氯甲烷‐甲醇4：1洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，減壓干燥得蕁麻木脂素。

所述的硅膠柱層析粒徑為200～300目，樣量比為1∶20～1∶30(樣品比硅膠，w/w)。每個梯度洗脫3～5個BV，流速0.6BV/h。

本發(fā)明涉及上述方法提取得到的蕁麻木脂素的應(yīng)用，可將其用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物的制備。

技術(shù)效果

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以同時制備兩種新化合物蕁麻新苷Ⅰ、Ⅱ兩種精制品以及蕁麻木脂素，所得產(chǎn)品純度高。采用乙醇提取藥材，既提高了目標(biāo)產(chǎn)物的收率，同時又去除了蕁麻中水溶性大分子成分(如多糖、蛋白質(zhì))的干擾，簡化了制備工藝。采用石油醚萃取，去除了大部分色素及脂肪酸的干擾。采用乙酸乙酯萃取，既排除了水溶性成分的干擾，富集了木脂素類成分；同時，也避免了萃取過程中蕁麻新苷類成分的損失，提高了蕁麻新苷的收率。

本發(fā)明根據(jù)蕁麻木脂素的理化特性，乙酸乙酯浸膏先甲醇處理，去除了浸膏中大量胡蘿卜苷以及脂肪酸的干擾；硅膠柱層時，先用二氯甲烷洗脫，進(jìn)一步去除了脂肪酸、甾醇及脂溶性色素，能簡便快速制備蕁麻木脂素。所得蕁麻木脂素經(jīng)UV法檢測(對蕁麻內(nèi)酯A為對照品，測定波長282nm)，純度超過65％。采用HPLC進(jìn)行測定，6種主要木脂素的質(zhì)量百分含量約為：蕁麻醇8％：蕁麻內(nèi)酯A 12％：蕁麻內(nèi)酯B 24％：蕁麻醇‐7‐O‐β‐D‐葡萄糖苷10％：開環(huán)異落葉松脂素5％：臭矢菜素A 4％，總含量超過60％。

整個制備過程使用的有機(jī)溶劑，以及分離中用到的填料均可反復(fù)使用；另一方面，同時制備蕁麻新苷及蕁麻木脂素類成分，充分利用了藥材及化學(xué)試劑，大幅降低了生產(chǎn)成本。

附圖說明

圖1為蕁麻新苷Ⅰ的¹³C‐NMR圖(DMSO‐d6,150MHz)；

圖2為蕁麻新苷Ⅱ的¹³C‐NMR圖(DMSO‐d6,150MHz)；

圖3為蕁麻木脂素HPLC圖；

圖中：1為蕁麻醇‐7‐O‐β‐D‐葡萄糖苷、2為蕁麻內(nèi)酯B、3為蕁麻內(nèi)酯A、4為蕁麻醇、5為臭矢菜素A、6為開環(huán)異落葉松脂素。

具體實施方式

實施例1

本實施例是在以下實施條件和技術(shù)要求條件檢測下實施的：

1.蕁麻根200g，加入2000mL 70％乙醇回流2次，每次1h，提取液離心，回收乙醇得醇浸膏(23.3g)。醇浸膏懸浮于250mL水中，加入250mL石油醚萃取2次，然后用乙酸乙酯萃取2次(每次250mL)，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯浸膏(9.0g)；下層水溶液水浴上揮至無乙酸乙酯味，得水溶液。

2.水溶液上D101大孔樹脂柱(400g樹脂)，先以30％乙醇洗脫3個柱體積，然后55％、80％的乙醇洗脫3個柱體積(流速均為0.6BV/h)。收集55％、80％乙醇洗脫液(0.3BV/流份)，TLC檢測，合并主斑點相同(Rf0.4‐0.5)的流份，回收乙醇得蕁麻苷提取物(2.5g)。

3.取上述蕁麻苷提取物進(jìn)行第一次硅膠柱層析(100g硅膠)，用二氯甲烷‐甲醇梯度洗脫(每個梯度洗脫6個BV)，收集洗脫液。TLC法檢測，合并主斑點Rf值0.4‐0.5的流份，回收溶劑得蕁麻新苷粗品(146mg)。

4.將蕁麻新苷粗品進(jìn)行HPLC分離，分別收集兩個主要色譜峰，即得蕁麻新苷I精制品26mg(純度95.7％，HPLC法)、蕁麻新苷Ⅱ精制品17mg(純度95.4％，HPLC法)。

5.所得乙酸乙酯浸膏用50mL甲醇超聲處理，離心，棄去不溶物。甲醇溶液回收溶劑后進(jìn)行第二次硅膠柱層析(180g硅膠)，先以二氯甲烷洗脫3個BV，回收二氯甲烷，棄去提取物；然后用二氯甲烷‐甲醇4：1洗脫3個BV，收集洗脫液，回收溶劑，減壓干燥得蕁麻木脂素4.7g。

經(jīng)UV檢測，木脂素含量達(dá)68.4％；如圖3所示，經(jīng)HPLC分析，6種主要木脂素總含量為62.4％，HPLC檢測波長：282nm；流動相：0→18min，10％乙腈→100％乙腈；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃。

如圖1所示，為蕁麻新苷Ⅰ的¹³C‐NMR圖。

如圖2所示，為蕁麻新苷Ⅱ的¹³C‐NMR圖。

實施例2

本實施例是在以下實施條件和技術(shù)要求條件下實施的：

1.蕁麻根200g，加入2.4L乙醇回流3次，每次2h，提取液離心，回收乙醇得醇浸膏(29.8g)。醇浸膏懸浮于300mL水中，加入300mL石油醚萃取2次，然后用乙酸乙酯萃取2次(每次300mL)，減壓回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯浸膏(11.4g)。水層置水浴鍋上揮盡乙酸乙酯，得水溶液。

2.水溶液上D101大孔樹脂柱(500g樹脂，流速為0.6BV/h)，先以30％乙醇洗脫4個柱體積，然后55％、80％的乙醇洗脫4個柱體積。收集55％、80％乙醇洗脫液(0.3BV/流份)，TLC檢測，合并主斑點相同(Rf0.4‐0.5)的流份，回收乙醇(可再次使用)得蕁麻苷提取物(3.3g)。

3.取上述蕁麻苷提取物進(jìn)行第一次硅膠柱層析(165g硅膠)，用二氯甲烷‐甲醇梯度洗脫(每個梯度洗脫5個BV)，收集洗脫液。TLC法檢測，合并主斑點Rf值0.4‐0.5的流份，回收溶劑即得蕁麻新苷粗品(184mg)。

4.將蕁麻新苷粗品進(jìn)行HPLC分離，分別收集兩個主要色譜峰，即得蕁麻新苷I精制品31mg(純度95.3％，HPLC法)、蕁麻新苷Ⅱ精制品23mg(純度96.4％，HPLC法)。

5.所得乙酸乙酯浸膏用60mL甲醇超聲處理，離心，棄去不溶物。甲醇溶液回收溶劑后進(jìn)行第二次硅膠柱層析(280g硅膠)，先以二氯甲烷洗脫4個BV，回收二氯甲烷，棄去提取物；然后用二氯甲烷‐甲醇4：1洗脫4個BV，收集洗脫液，回收溶劑，減壓干燥得蕁麻木脂素5.9g(經(jīng)UV檢測，木脂素含量達(dá)70.7％；經(jīng)HPLC分析，6種主要木脂素總含量為63.0％)。

實施例3

本實施例是在以下實施條件和技術(shù)要求條件下實施的：

1.蕁麻根200g，加入2.8L乙醇回流3次，每次3h，提取液離心，回收乙醇得醇浸膏(32.4g)。醇浸膏懸浮于300mL水中，加入300mL石油醚萃取3次，然后用乙酸乙酯萃取3次(每次300mL)，減壓回收乙酸乙酯得乙酸乙酯浸膏(12.5g)。水層水浴鍋上揮盡乙酸乙酯，得水溶液。

2.水溶液上D101大孔樹脂柱(600g樹脂，流速為0.6BV/h)，先以30％乙醇洗脫5個柱體積，然后55％、80％的乙醇洗脫5個柱體積。收集55％、80％乙醇洗脫液(0.3BV/流份)，TLC檢測，合并主斑點相同(Rf0.4‐0.5)的流份，回收乙醇得蕁麻苷提取物(3.5g)。

3.取上述蕁麻苷提取物進(jìn)行硅膠柱層析(210g硅膠)，用二氯甲烷‐甲醇梯度洗脫(每個梯度洗脫4個BV)，收集洗脫液。TLC法檢測，合并主斑點Rf值0.4‐0.5的流份，回收溶劑即得蕁麻新苷粗品(201mg)。

4.將蕁麻粗品進(jìn)行HPLC分離，分別收集兩個主要色譜峰，即得蕁麻新苷I精制品33mg(純度95.2％，HPLC法)、蕁麻新苷Ⅱ精制品21mg(純度96.0％，HPLC法)。

5.所得乙酸乙酯浸膏用60mL甲醇超聲處理，離心，棄去不溶物。甲醇溶液回收甲醇后經(jīng)硅膠柱層析(375g硅膠)，先以二氯甲烷洗脫5個BV，回收二氯甲烷，棄去提取物；然后用二氯甲烷‐甲醇4：1洗脫5個BV，收集洗脫液，回收溶劑，減壓干燥得蕁麻木脂素6.1g(經(jīng)UV檢測，木脂素含量達(dá)71.2％；經(jīng)HPLC分析，6種主要木脂素總含量為63.4％)。

通過上述實施例制備得到的蕁麻新苷具有顯著的抑制5‐α還原酶作用，其活性優(yōu)于非那雄胺。實驗方法：將5α‐還原酶液、睪酮溶液、輔酶(NADPH‐Na4)、樣品(蕁麻新苷及非那雄胺)以及Tris緩沖液加入反應(yīng)體系，組成2ml酶促反應(yīng)體系，反應(yīng)液于37℃水浴反應(yīng)60min。0min及60min反應(yīng)液中各加入甲醇1.0ml并振蕩混勻以終止反應(yīng)，10000rpm 4℃離心20min，上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取20μL注入HPLC液相色譜儀分析(保護(hù)柱：Alltech Brava BDS‐C₁₈guard column，5μm,7.5×4.6mm；分析柱：Agilent Zorbax Elipse XDB‐C₁₈Column，5μm,4.6×250mm；流動相：甲醇：水＝7：3；流速：0.7ml/min；柱溫：35℃；檢測器：UV；檢測波長：242nm)。比較0min和60min反應(yīng)液中睪酮峰面積變化，計算酶促反應(yīng)體系中蕁麻新苷、非那雄胺對5α‐還原酶活性抑制的程度。實驗結(jié)果見表1。

表1蕁麻新苷對5‐α還原酶的抑制作用(n＝3)

通過上述方法所得蕁麻木脂素具有顯著抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(AA)作用。實驗方法：SD大鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只。測定大鼠造模前的后足足跖厚度后，將每鼠右后足跖皮內(nèi)注射Freund’s完全佐劑0.05ml塑造AA模型。致炎后第18天開始給藥，連續(xù)給藥7天，隔日測定后足足跖厚度。末次測量完畢后測量關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)(根據(jù)未注射的3只肢體的病變程度累計積分，計算AI：無紅腫，0分；小趾關(guān)節(jié)紅腫，1分；趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹，2分；踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹，3分；包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹，4分。把各個關(guān)節(jié)的積分累計起來，即為每只大鼠的AI)。實驗結(jié)果：蕁麻木脂素高、低劑量組均對AA模型大鼠的關(guān)節(jié)腫脹有明顯抑制作用(結(jié)果見表2)，還能顯著抑制AA模型大鼠全身繼發(fā)性病變(結(jié)果見表3)。

表2蕁麻木脂素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響(n＝10)

與空白組比較，*P＜0.05；**P＜0.01。

表3蕁麻木脂素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響(n＝10)

*與生理鹽水組比較，p＜0.05；**p＜0.01。

上述具體實施可由本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明原理和宗旨的前提下以不同的方式對其進(jìn)行局部調(diào)整，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)且不由上述具體實施所限，在其范圍內(nèi)的各個實現(xiàn)方案均受本發(fā)明之約束。