本發(fā)明涉及涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種心肌分化試劑盒及心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

日本學(xué)者中山申彌(Shinya Yamanaka)于2006年和2007年，首次通過(guò)導(dǎo)入四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的方法，分別成功將小鼠(Takahashi and Yamanaka.,2006)和人(Takahashi et al.,2007)的皮膚成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)，并因此獲得了2012年的諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。hiPS細(xì)胞(人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)具備hES細(xì)胞(人胚胎干細(xì)胞)的所有分化能力，并且沒有倫理問題，在不久的將來(lái)會(huì)完全取代hES細(xì)胞，成為再生醫(yī)學(xué)的最主要細(xì)胞來(lái)源，為臨床應(yīng)用帶來(lái)了新的曙光。

冠心病(Coronary Artery Disease,CAD)是僅次于高血壓的第二大心血管疾病，在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率非常高，近幾年其發(fā)病率在我國(guó)也呈上升趨勢(shì)。目前冠心病的主要臨床治療方法如藥物治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)及冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)(CABG)，都不能顯著恢復(fù)受損后的心臟功能。由于人心肌沒有再生能力，一旦由于心梗等原因受損死亡后，一旦超過(guò)臨界點(diǎn)，心臟會(huì)進(jìn)入惡性代償?shù)难h(huán)，最終不可逆的發(fā)展進(jìn)入心衰。根據(jù)中國(guó)的流行病學(xué)調(diào)查，人群中的慢性心衰患病率為0.9％，至少有1000萬(wàn)病人，總死亡率達(dá)32％。誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞因其易擴(kuò)增，可定向分化為心肌細(xì)胞，且無(wú)免疫排斥反應(yīng)和倫理學(xué)問題，提供了治療冠心病的新思路。最近的研究發(fā)現(xiàn)，移植人ES/iPS產(chǎn)生的心肌細(xì)胞后，心梗豬的心功能得到了顯著程度的改善，形態(tài)學(xué)和生理學(xué)結(jié)果都顯示移植的心肌整合進(jìn)入宿主心臟并形成有效的收縮功能單元(Kawamura et al.,2012；Shiba et al.,2012)。

人心肌細(xì)胞與常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心肌細(xì)胞相比，存在較大生理學(xué)差異。例如，人心臟生理?xiàng)l件下每分鐘搏動(dòng)60～90次，而小鼠為500～700次，大鼠為300～400次。而獲取與人心臟生理接近的大動(dòng)物心肌細(xì)胞非常昂貴而且困難，收集到的細(xì)胞均一性差，難以得到穩(wěn)定可靠的結(jié)果。ES/hiPS產(chǎn)生的心肌之前，幾乎不可能獲任何人源心肌細(xì)胞用于藥物開發(fā)，毒性測(cè)定和生理學(xué)研究。

因此，需要解決現(xiàn)有技術(shù)中因?yàn)樾募〖?xì)胞無(wú)法長(zhǎng)期培養(yǎng)和實(shí)現(xiàn)規(guī)?；慨a(chǎn)，而無(wú)法用于藥物開發(fā)，毒性測(cè)定和生理學(xué)研的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種心肌分化試劑盒及心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中因?yàn)樾募〖?xì)胞無(wú)法長(zhǎng)期培養(yǎng)和實(shí)現(xiàn)規(guī)?；慨a(chǎn)，而無(wú)法用于藥物開發(fā)，毒性測(cè)定和生理學(xué)研的技術(shù)問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種心肌分化試劑盒，該心肌分化試劑盒包括心肌分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3；其中，心肌分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含糖1640培養(yǎng)基，心肌分化添加劑1包括1～3v％的B27、8～12ng/ml的BMP4以及4～8μM的CHIR99021；心肌分化添加劑2包括1～3v％的B27以及4～6μM的IWP2；心肌分化添加劑3包括1～3v％的B27。

進(jìn)一步地，心肌分化試劑盒還包括心肌純化基礎(chǔ)培養(yǎng)基及心肌純化添加劑；其中，心肌純化基礎(chǔ)培養(yǎng)基為無(wú)糖1640培養(yǎng)基；心肌純化添加劑包括1～3v％的B27以及1～3mg/ml的乳糖；優(yōu)選心肌純化添加劑包括1.5～2.5v％的B27以及1.5～2.5mg/ml的乳糖；更優(yōu)選，心肌純化添加劑包括2v％的B27以及2mg/ml的乳糖。

進(jìn)一步地，心肌分化添加劑1包括1.5～2.5v％的B27、9～11ng/ml的BMP4以及5～7μM的CHIR99021；心肌分化添加劑2包括1.5～2.5v％的B27以及4.5～5.5μM的IWP2；心肌分化添加劑3包括1.5～2.5v％的B27；更優(yōu)選，心肌分化添加劑1包括2v％的B27、10ng/ml的BMP4以及6μM的CHIR99021；心肌分化添加劑2包括2v％的B27以及2 5μM的IWP2；心肌分化添加劑3包括2v％的B27。

進(jìn)一步地，心肌分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基和心肌純化基礎(chǔ)培養(yǎng)基保存在4～8℃，心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2、心肌分化添加劑3以及心肌純化添加劑分別置于-20～-80℃保存。

進(jìn)一步地，心肌分化試劑盒在使用前還包括配制相應(yīng)心肌分化培養(yǎng)基和心肌純化培養(yǎng)基的步驟，配制相應(yīng)心肌分化培養(yǎng)基和心肌純化培養(yǎng)基的步驟包括：在2～8℃化凍心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2、心肌分化添加劑3及心肌純化添加劑；將心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3分別與心肌分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基以1:40～60，優(yōu)選1:50的體積比混合后形成心肌分化培養(yǎng)基1、心肌分化培養(yǎng)基2以及心肌分化培養(yǎng)基3；將心肌純化添加劑與心肌純化基礎(chǔ)培養(yǎng)基以1:40～60，優(yōu)選1:50的體積比混合后形成心肌純化培養(yǎng)基。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法包括以下步驟：將人多能干細(xì)胞接種到鋪有基質(zhì)膠或玻璃粘連蛋白的培養(yǎng)皿中；向培養(yǎng)皿中依次加入心肌分化培養(yǎng)基1培養(yǎng)2～4天，心肌分化培養(yǎng)基3培養(yǎng)1～2天，心肌分化培養(yǎng)基2培養(yǎng)2～3天，得到分化細(xì)胞；其中，心肌分化培養(yǎng)基1、心肌分化培養(yǎng)基2以及心肌分化培養(yǎng)基3采用上述任一種心肌分化試劑盒中的心肌分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3配制而成。

進(jìn)一步地，配制心肌分化培養(yǎng)基1、心肌分化培養(yǎng)基2以及心肌分化培養(yǎng)基3的步驟包括：將心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3分別與心肌分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基以1:40～60，優(yōu)選1:50的體積比混合后形成心肌分化培養(yǎng)基1、心肌分化培養(yǎng)基2以及心肌分化培養(yǎng)基3。

進(jìn)一步地，在得到分化細(xì)胞之后，培養(yǎng)方法還包括對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行心肌細(xì)胞純化的步驟，優(yōu)選對(duì)心肌細(xì)胞純化的步驟包括：去除心肌分化培養(yǎng)基2，然后向培養(yǎng)皿中加入心肌純化培養(yǎng)基，每隔一天換一次心肌純化培養(yǎng)基，純化3～4天，獲得純化后的心肌細(xì)胞；其中，心肌純化培養(yǎng)基采用上述任一種心肌分化試劑盒中的心肌純化基礎(chǔ)培養(yǎng)基及心肌純化添加劑配制而成。

進(jìn)一步地，配制心肌純化培養(yǎng)基的步驟包括：將心肌純化添加劑與心肌純化基礎(chǔ)培養(yǎng)基以1:40～60，優(yōu)選1:50的體積比混合形成心肌純化培養(yǎng)基。

進(jìn)一步地，在獲得純化后的心肌細(xì)胞之后，培養(yǎng)方法還包括維持培養(yǎng)純化后的心肌細(xì)胞的步驟；優(yōu)選維持培養(yǎng)純化后的心肌細(xì)胞的步驟包括：將純化后的心肌細(xì)胞接種到鋪有基質(zhì)膠或玻璃粘連蛋白的培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)皿中添加心肌分化培養(yǎng)基3，每隔2天換一次心肌分化培養(yǎng)基3，培養(yǎng)60～100天。

應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的試劑盒中心肌分化相關(guān)培養(yǎng)基、純化相關(guān)培養(yǎng)基成分明確，品質(zhì)穩(wěn)定；不含動(dòng)物源成分，分化的心肌細(xì)胞均一性好，電生理穩(wěn)定，可重復(fù)性高；可以達(dá)到人源心肌細(xì)胞穩(wěn)定的獲得和維持，并且適用于包括藥物開發(fā)和安全性評(píng)價(jià)在內(nèi)的各種需求，為心血管藥物開發(fā)和生理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說(shuō)明書附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1A至圖1D示出了實(shí)驗(yàn)一中實(shí)施例5的培養(yǎng)基分化人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向心肌分化過(guò)程在不同階段的圖像；其中，圖1A是分化前(day0)的iPSC，圖1B是分化72h的細(xì)胞形態(tài)，圖1C是分化結(jié)束獲得的心肌細(xì)胞，圖1D是純化處理獲得的純度≧99％的心肌細(xì)胞。

圖2A至圖2B示出了實(shí)驗(yàn)一中實(shí)施例5的心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物染色結(jié)果；其中，圖2A中的左、中、右圖分別示出的是誘導(dǎo)出的心肌細(xì)胞所表達(dá)主要的心肌特異性收縮蛋白Cardiac Troponin T、α-Sarcomeric-Actinin以及兩者疊加之后的圖，圖2A顯示了心肌細(xì)胞非常規(guī)則的肌理結(jié)構(gòu)。圖2B顯示了實(shí)施例5的試劑盒誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞由心室肌樣細(xì)胞組成，其中，左圖顯示的是少量其他心肌細(xì)胞表達(dá)心房特異性輕鏈肌球蛋白MLC2a，中圖顯示的是心室肌樣細(xì)胞表達(dá)心室特異性輕鏈肌球蛋白MLC2v，右圖顯示的是兩者疊加后的圖。

圖3A和圖3B示出了實(shí)驗(yàn)二中實(shí)施例5的心肌細(xì)胞分化效率和純度鑒定結(jié)果；其中，圖3A顯示實(shí)施例1～5及對(duì)比例1的心肌細(xì)胞分化效率比較結(jié)果；圖3B顯示心肌細(xì)胞NKX2.5啟動(dòng)子調(diào)控下特異性的表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)，通過(guò)搏動(dòng)和表達(dá)GFP的細(xì)胞比例可知，心肌細(xì)胞純度達(dá)99％以上。

圖4A及圖4B示出了實(shí)驗(yàn)三中實(shí)施例5分化的心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率圖，轉(zhuǎn)染48h觀察，其中圖4A為白光下的圖像；圖4B為綠色熒光下的圖像，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，GFP熒光比率達(dá)到50～60％，表明所分化的心肌細(xì)胞的GFP轉(zhuǎn)染效率可達(dá)50～60％。

圖5A、圖5B及圖5C示出了實(shí)驗(yàn)三中實(shí)施例5的試劑盒誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞在接種后10～13天RTCA數(shù)據(jù)分析結(jié)果：其中，圖5A顯示心肌細(xì)胞質(zhì)量均一穩(wěn)定且具備正常人心肌細(xì)胞的搏動(dòng)幅度與頻率；圖5B顯示心肌細(xì)胞在1.1μM異丙腎上腺素(Isoprenaline)的作用下心率顯著提高，其中，0.1％DMSO處理作為陰性參照；圖5C顯示心肌細(xì)胞在1.1μM胺碘酮(Amiodarone)的作用下心率顯著降低，其中，0.1％DMSO處理作為陰性參照。

圖6A和圖6B示出了實(shí)驗(yàn)三中實(shí)施例5的試劑盒誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞的膜片鉗電生理檢測(cè)結(jié)果，圖6A顯示誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞具備典型的自發(fā)動(dòng)作電位，圖6B顯示誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞具備經(jīng)典的自發(fā)離子通道。

具體實(shí)施方式

需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。下面將結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

如背景技術(shù)所提到的，現(xiàn)有技術(shù)中，心肌細(xì)胞因?yàn)闊o(wú)法長(zhǎng)期培養(yǎng)和實(shí)現(xiàn)規(guī)?；慨a(chǎn)，因而無(wú)法用于藥物開發(fā)，毒性測(cè)定和生理學(xué)研究。而動(dòng)物自體分離的心肌細(xì)胞，不同批次差異較大，很不穩(wěn)定，且電生理跟人差異極大，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度和結(jié)果。

為改善現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，在本申請(qǐng)一種典型的實(shí)施方式中，提供了一種心肌分化試劑盒。該試劑盒包括心肌分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2及心肌分化添加劑3；其中，心肌分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含糖1640培養(yǎng)基；心肌分化添加劑1包括1～3v％的B27、8～12ng/ml的BMP4以及4～8μM的CHIR99021；心肌分化添加劑2包括1～3v％的B27以及4～6μM的IWP2；心肌分化添加劑3包括1～3v％的B27。

本申請(qǐng)的心肌分化試劑盒成分明確，品質(zhì)穩(wěn)定且分化效率高，細(xì)胞譜系廣，可以分化包括各種來(lái)源的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞H9、HCN4等細(xì)胞。而且，分化的心肌細(xì)胞均一性好，電生理穩(wěn)定，可重復(fù)性高；可以達(dá)到人源心肌細(xì)胞穩(wěn)定的獲得和維持，并且適用于包括藥物開發(fā)和安全性評(píng)價(jià)在內(nèi)的各種需求，為心血管藥物開發(fā)和生理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

包含上述成分的心肌分化試劑盒已經(jīng)能夠分化出品質(zhì)穩(wěn)定的心肌細(xì)胞，并且能夠滿足包括藥物開發(fā)和安全性評(píng)價(jià)在內(nèi)的各種需求。為了進(jìn)一步提高所分化的心肌細(xì)胞的純度，在本申請(qǐng)的一種優(yōu)選的實(shí)施例中，上述心肌分化試劑盒還包括：心肌純化基礎(chǔ)培養(yǎng)基和心肌純化添加劑，其中，心肌純化基礎(chǔ)培養(yǎng)基為無(wú)糖1640培養(yǎng)基；心肌純化添加劑包括1～3v％的B27以及1～3mg/ml的乳糖；優(yōu)選心肌純化添加劑包括1.5～2.5v％的B27以及1.5～2.5mg/ml的乳糖；更優(yōu)選，心肌純化添加劑包括2v％的B27以及2mg/ml的乳糖。

上述優(yōu)選實(shí)施例中，通過(guò)包括上述組分及其含量的心肌純化基礎(chǔ)培養(yǎng)基和心肌純化添加劑，使得本申請(qǐng)的心肌分化試劑盒除了具有分化心肌細(xì)胞、量產(chǎn)化心肌細(xì)胞的功能外，還具有對(duì)分化的心肌細(xì)胞進(jìn)行純化的功能，使得心肌細(xì)胞的純度相對(duì)更純，品質(zhì)更穩(wěn)定，更適合用于藥物開發(fā)、毒性測(cè)定和生理學(xué)研究。

上述心肌分化試劑盒中的心肌分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3的成分及含量明確，誘導(dǎo)分化能力強(qiáng)，分化后的心肌細(xì)胞品質(zhì)穩(wěn)定。為了進(jìn)一步優(yōu)化上述心肌分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加劑的相應(yīng)功能，在本申請(qǐng)一種優(yōu)選的實(shí)施例中，上述心肌分化添加劑1包括心肌分化添加劑1包括1.5～2.5v％的B27、9～11ng/ml的BMP4以及5～7μM的CHIR99021；心肌分化添加劑2包括1.5～2.5v％的B27以及4.5～5.5μM的IWP2；心肌分化添加劑3包括1.5～2.5v％的B27；更優(yōu)選，心肌分化添加劑1包括2v％的B27、10ng/ml的BMP4以及6μM的CHIR99021；心肌分化添加劑2包括2v％的B27以及2 5μM的IWP2；心肌分化添加劑3包括2v％的B27。上述含量范圍的各成分組成的心肌分化試劑盒具有更高效的心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力，得到的心肌細(xì)胞的品質(zhì)更穩(wěn)定。

上述試劑盒中，根據(jù)成分種類的不同，可以選擇合適的保存方式以延長(zhǎng)試劑盒中各種培養(yǎng)基成分的有效性，從而延長(zhǎng)試劑盒的有效使用期。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施例中，心肌分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基和心肌純化基礎(chǔ)培養(yǎng)基保存在4～8℃，心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2、心肌分化添加劑3以及心肌純化添加劑分別置于-20～-80℃保存。各心肌分化添加劑及心肌純化添加劑，在-20～-80℃保存可以保持性能穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)一年以上。

對(duì)于上述試劑盒的使用步驟，根據(jù)實(shí)際需要可以將各成分提前配制成母液或者現(xiàn)用現(xiàn)配。在本申請(qǐng)一種優(yōu)選的實(shí)施例中，心肌分化試劑盒在使用前還包括配制相應(yīng)心肌分化培養(yǎng)基和心肌純化培養(yǎng)基的步驟，配制相應(yīng)心肌分化培養(yǎng)基和心肌純化培養(yǎng)基的步驟包括：在2～8℃化凍心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2、心肌分化添加劑3及心肌純化添加劑；將心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3分別與心肌分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基以1:40～60，優(yōu)選1:50的體積比混合后形成心肌分化培養(yǎng)基1、心肌分化培養(yǎng)基2以及心肌分化培養(yǎng)基3；將心肌純化添加劑與心肌純化基礎(chǔ)培養(yǎng)基以1:40～60，優(yōu)選1:50的體積比混合后形成心肌純化培養(yǎng)基。優(yōu)選的，心肌分化培養(yǎng)基和心肌純化培養(yǎng)基在使用前0～14天配制，并在2～8℃保存。

在本申請(qǐng)另一種典型的實(shí)施方式中，還提供了一種心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法包括以下步驟：將人多能干細(xì)胞接種到鋪有基質(zhì)膠或玻璃粘連蛋白的培養(yǎng)皿中；向培養(yǎng)皿中依次加入心肌分化培養(yǎng)基1培養(yǎng)2～4天，心肌分化培養(yǎng)基3培養(yǎng)1～2天，心肌分化培養(yǎng)基2培養(yǎng)2～3天，得到分化細(xì)胞。上述依次加入是指：加入心肌分化培養(yǎng)基1培養(yǎng)2～4天，然后將心肌分化培養(yǎng)基1去除，換成心肌分化培養(yǎng)基3培養(yǎng)1～2天，再將心肌分化培養(yǎng)基3去除，換成心肌分化培養(yǎng)基2培養(yǎng)2～3天，得到上述分化細(xì)胞；其中，心肌分化培養(yǎng)基1、心肌分化培養(yǎng)基2以及心肌分化培養(yǎng)基3采用上述任一種心肌分化試劑盒中的心肌分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3配制而成。

采用上述培養(yǎng)基按照上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)，能夠分化得到較多的心肌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞的量產(chǎn)，且得到的心肌細(xì)胞的品質(zhì)性能穩(wěn)定。

根據(jù)試劑盒成分保存方式的不同，在采用試劑盒中的成分進(jìn)行心肌細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可以采用不同的前處理步驟。比如，對(duì)已經(jīng)化凍的心肌分化培養(yǎng)基的母液，直接按需求添入培養(yǎng)皿中即可。若試劑盒中各添加劑成分都是在-20℃～-80℃下保存，還需要先配置后續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中使用的心肌分化培養(yǎng)基和心肌純化培養(yǎng)基。

在本申請(qǐng)一種優(yōu)選的實(shí)施例中，上述配制心肌分化培養(yǎng)基1、心肌分化培養(yǎng)基2以及心肌分化培養(yǎng)基3的步驟包括：將心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3分別與心肌分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基以1:40～60，優(yōu)選1:50的體積比混合后形成心肌分化培養(yǎng)基1、心肌分化培養(yǎng)基2以及心肌分化培養(yǎng)基3。上述優(yōu)選的實(shí)施例中，將各分化添加劑與分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基以上述體積比進(jìn)行混合形成相應(yīng)的分化培養(yǎng)基，具有誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分化效率高，品質(zhì)穩(wěn)定的效果。當(dāng)上述各分化添加劑處于-20℃～-80℃的冷凍狀態(tài)時(shí)，配制上述各分化培養(yǎng)基之前，還需要先將各分化添加劑進(jìn)行化凍，使各分化添加劑處于液體狀態(tài)。

為了獲得純度更高、品質(zhì)更穩(wěn)定的心肌細(xì)胞，在本申請(qǐng)另一種優(yōu)選的實(shí)施例中，在得到分化細(xì)胞之后，培養(yǎng)方法還包括對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行心肌細(xì)胞純化的步驟，優(yōu)選心肌細(xì)胞純化的步驟包括：去除心肌分化培養(yǎng)基2，然后向培養(yǎng)皿中加入心肌純化培養(yǎng)基，每隔一天換一次心肌純化培養(yǎng)基，純化3～4天，獲得純化后的心肌細(xì)胞；其中，心肌純化培養(yǎng)基采用上述任一種心肌分化試劑盒中的心肌純化基礎(chǔ)培養(yǎng)基及心肌純化添加劑配制而成。

在本申請(qǐng)一種優(yōu)選的實(shí)施例中，上述配制心肌純化培養(yǎng)基的步驟包括：將心肌純化添加劑與心肌純化基礎(chǔ)培養(yǎng)基以1:40～60，優(yōu)選1:50的體積比混合形成心肌純化培養(yǎng)基。而將心肌純化添加劑與心肌純化基礎(chǔ)培養(yǎng)基以上述體積比進(jìn)行混合形成的純化培養(yǎng)基，對(duì)心肌細(xì)胞的純化效率高，純化得到的心肌細(xì)胞的品質(zhì)性能穩(wěn)定。當(dāng)然，若上述心肌純化添加劑處于-20℃～-80℃的冷凍狀態(tài)時(shí)，配制上述純化培養(yǎng)基之前，還需要先將純化添加劑進(jìn)行化凍成液體狀態(tài)才能配制。

在得到上述純化后的心肌細(xì)胞之后，根據(jù)研究目的和對(duì)心肌細(xì)胞的使用時(shí)間的不同，可以選擇直接對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)或研究，或者持續(xù)培養(yǎng)以適應(yīng)階段性的研究需求。在本申請(qǐng)一種優(yōu)選的實(shí)施例中，在獲得純化后的心肌細(xì)胞之后，培養(yǎng)方法還包括維持培養(yǎng)純化后的心肌細(xì)胞的步驟；優(yōu)選維持培養(yǎng)純化后的心肌細(xì)胞的步驟包括：將純化后的心肌細(xì)胞接種到鋪有基質(zhì)膠或玻璃粘連蛋白的培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)皿中添加心肌分化培養(yǎng)基3，每隔2天換一次心肌分化培養(yǎng)基3，培養(yǎng)60～100天。

下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。

一、各組分的配制

在下列實(shí)施例中，心肌分化添加劑及心肌純化添加劑通過(guò)以下步驟配置：

1)心肌分化添加劑1：

第一步：配制各種成分的儲(chǔ)備液：①B27；②BMP4 10ug/ml；③CHIR99021 6mM。

第二步：在室溫下將以上各種成分的儲(chǔ)備液按照以上儲(chǔ)備液編號(hào)順序依次混合，成為終濃度為B27 1～3v％、BMP4 8～12ng/ml、CHIR99021 4～8μM的工作液。

2)心肌分化添加劑2：

第一步：配制各種成分的儲(chǔ)備液：①B27；②IWP2 5mM。

第二步：在室溫下將以上各種成分的儲(chǔ)備液按照以上儲(chǔ)備液編號(hào)順序依次混合，成為終濃度為B27 1～3v％、IWP2 4～6μM的工作液。

3)心肌分化添加劑3：

第一步：配制各種成分的儲(chǔ)備液：①B27

第二步：在室溫下將以上儲(chǔ)備液按照儲(chǔ)備液編號(hào)與基礎(chǔ)液混合，成為終濃度為B271～3v％的工作液。

4)心肌純化添加劑：

第一步：配制各種成分的儲(chǔ)備液：①B27②乳糖2g/ml。

第二步：在室溫下將以上各種成分的儲(chǔ)備液按照以上儲(chǔ)備液編號(hào)順序依次混合，成為終濃度為B27 1～3v％、乳糖1～3mg/ml的工作液。

二、實(shí)施例1-5的各心肌分化培養(yǎng)基和心肌純化培養(yǎng)基的配制

實(shí)施例1-5及對(duì)比例1中的心肌分化培養(yǎng)基的組分如表1所示。

表1：

對(duì)比例1中的培養(yǎng)基為現(xiàn)有技術(shù)的體系。

將上述實(shí)施例1-5中的心肌分化培養(yǎng)基、純化培養(yǎng)基按照如下步驟配制：

在2～8℃化凍心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2和心肌分化添加劑3，隨后將心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2和心肌分化添加劑3分別按1ml:50ml的比例加入心肌分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基形成心肌分化培養(yǎng)基1、心肌分化培養(yǎng)基2和心肌分化培養(yǎng)基3，均可在2～8℃穩(wěn)定儲(chǔ)存達(dá)兩周。

在2～8℃化凍心肌純化添加劑，隨后將心肌純化添加劑按1ml:50ml的比例加入到心肌純化基礎(chǔ)培養(yǎng)基形成心肌純化培養(yǎng)基，可在2～8℃穩(wěn)定儲(chǔ)存達(dá)兩周。

三、心肌細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一：

1.實(shí)驗(yàn)材料：人腎上皮來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

2.培養(yǎng)基：實(shí)施例1-5中的心肌分化培養(yǎng)基

3.實(shí)驗(yàn)步驟：

1)人腎上皮來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的接種：將人腎上皮來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞接種到鋪有基質(zhì)膠培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至匯合度達(dá)到85％左右；

2)向培養(yǎng)皿中依次加入心肌分化培養(yǎng)基1培養(yǎng)2天，心肌分化培養(yǎng)基3培養(yǎng)1天，心肌分化培養(yǎng)基2培養(yǎng)3天；

3)去除心肌分化培養(yǎng)基2，向培養(yǎng)皿中加入心肌純化培養(yǎng)基，每隔一天換一次心肌純化培養(yǎng)基，純化3天；

4)將純化的心肌細(xì)胞再接種到鋪有基質(zhì)膠或玻璃粘連蛋白的培養(yǎng)皿中，換成心肌分化培養(yǎng)基3，每隔2天換一次心肌分化培養(yǎng)基3，可長(zhǎng)期培養(yǎng)100天。

通過(guò)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物對(duì)各實(shí)施例及對(duì)比例誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞進(jìn)行染色鑒定。其中，圖1A至圖1D示出了實(shí)驗(yàn)一中實(shí)施例5的培養(yǎng)基分化人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在分化過(guò)程不同階段的圖像；其中，圖1A是分化前(day0)的iPSC，圖1B是分化72h的細(xì)胞形態(tài)，圖1C是分化結(jié)束獲得的心肌細(xì)胞，圖1D是純化處理獲得的純度≧99％的心肌細(xì)胞。

圖2A和圖2B示出的是心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物染色的結(jié)果。圖2A的左、中、右圖分別示出的是誘導(dǎo)出的心肌細(xì)胞所表達(dá)主要的心肌特異性收縮蛋白Cardiac Troponin T、α-Sarcomeric-Actinin以及兩者疊加之后的圖；圖2A顯示了心肌細(xì)胞非常規(guī)則的肌理結(jié)構(gòu)。圖2B顯示了實(shí)施例5的試劑盒誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞由心室肌樣細(xì)胞組成。其中，左圖顯示的是少量其他心肌細(xì)胞表達(dá)心房特異性輕鏈肌球蛋白MLC2a；中圖顯示的是心室肌樣細(xì)胞表達(dá)心室特異性輕鏈肌球蛋白MLC2v；右圖2顯示的是兩者疊加后的圖，并對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行了特異染色。

實(shí)施例1～4的誘導(dǎo)分化過(guò)程及心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的染色結(jié)果與實(shí)施例5的結(jié)果類似，此處不再展示。

實(shí)驗(yàn)二：

1.實(shí)驗(yàn)材料：人ES細(xì)胞

2.培養(yǎng)基：實(shí)施例1-5中的心肌分化培養(yǎng)基

3.實(shí)驗(yàn)步驟：

1)人ES細(xì)胞的接種：將人ES細(xì)胞接種到鋪有基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至匯合度達(dá)到85％左右；

2)向培養(yǎng)皿中加入心肌分化培養(yǎng)基1培養(yǎng)3天，心肌分化培養(yǎng)基3培養(yǎng)2天，心肌分化培養(yǎng)基2培養(yǎng)3天；

3)去除心肌分化培養(yǎng)基2，向培養(yǎng)皿中加入心肌純化培養(yǎng)基，每隔一天換一次心肌純化培養(yǎng)基，純化3天；

4)將純化的心肌細(xì)胞再接種到鋪有基質(zhì)膠或玻璃粘連蛋白的培養(yǎng)皿中，換成心肌分化培養(yǎng)基3，每隔2天換一次心肌分化培養(yǎng)基3，可長(zhǎng)期培養(yǎng)100天。

通過(guò)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物對(duì)各實(shí)施例及對(duì)比例進(jìn)行染色鑒定，并根據(jù)染色結(jié)果統(tǒng)計(jì)各實(shí)施例及對(duì)比例的分化效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3A和圖3B所示。圖3A示出了實(shí)施例1～5及對(duì)比例1的心肌細(xì)胞分化效率比較結(jié)果；圖3B示出了實(shí)施例5的試劑盒誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞NKX2.5啟動(dòng)子調(diào)控下特異性的表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)。由搏動(dòng)和表達(dá)GFP的細(xì)胞比例顯示，心肌細(xì)胞純度達(dá)99％以上。圖3B中，右上角的縮小圖顯示了整個(gè)視野下的分化后帶熒光的細(xì)胞的比例，并以白光下的效果作為背景參照。

由圖3A可以看出，在分化效率上，實(shí)施例5相比對(duì)比例1，提高了20％。在目前分化培養(yǎng)適合藥物研發(fā)的心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基種類相對(duì)較少的基礎(chǔ)上，實(shí)施例5的培養(yǎng)基能夠在對(duì)比例1的培養(yǎng)基的誘導(dǎo)分化效率基礎(chǔ)上又提高20％多，是難以預(yù)料的。而且，分化效率的提高是實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞的規(guī)?；慨a(chǎn)的一個(gè)重要條件。此外，對(duì)比例1的培養(yǎng)基對(duì)分化后的心肌細(xì)胞的培養(yǎng)周期是難以達(dá)到100天的。而實(shí)施例5不僅分化效率大大提高，而且在需要的情況下可以被長(zhǎng)期體外培養(yǎng)(可長(zhǎng)達(dá)100天)，進(jìn)而解決了現(xiàn)有技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞大規(guī)模量產(chǎn)的問題。

實(shí)驗(yàn)三：

1.實(shí)驗(yàn)材料：人外周血來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

2.培養(yǎng)基：實(shí)施例1-5中的心肌分化培養(yǎng)基

3.實(shí)驗(yàn)步驟：

S1，人外周血來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的接種：將人外周血來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞接種到鋪有基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至匯合度達(dá)到85％左右；

S2，向培養(yǎng)皿中加入心肌分化培養(yǎng)基1培養(yǎng)4天，心肌分化培養(yǎng)基3培養(yǎng)1天，心肌分化培養(yǎng)基2培養(yǎng)2天；

S3，去除心肌分化培養(yǎng)基2，向培養(yǎng)皿中加入心肌純化培養(yǎng)基，每隔一天換一次心肌純化培養(yǎng)基，純化4天；

S4，將純化的心肌細(xì)胞再接種到鋪有基質(zhì)膠或玻璃粘連蛋白的培養(yǎng)皿中，換成心肌分化培養(yǎng)基3，每隔2天換一次心肌分化培養(yǎng)基3，可長(zhǎng)期培養(yǎng)100天。

以實(shí)施例5分化的心肌細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，檢測(cè)本申請(qǐng)的試劑盒誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。檢測(cè)結(jié)果如圖4A和4B所示。圖4A和4B分別顯示心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒(Lipofectamine LTX and PLUS Reagents)48h后在白光和熒光下的觀察結(jié)果。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，GFP熒光比率達(dá)到50～60％。可見，本申請(qǐng)的試劑盒所誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率達(dá)50～60％。

此外，采用實(shí)時(shí)心肌細(xì)胞功能分析儀(RTCA)和膜片鉗分別對(duì)上述實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)二和實(shí)驗(yàn)三中各實(shí)施例及對(duì)比例所誘導(dǎo)分化及培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的功能和電生理分別進(jìn)行了檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，本申請(qǐng)的試劑盒誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞在無(wú)明顯可見細(xì)胞死亡的情況下，維持存活達(dá)到3個(gè)月以上，并且能保持節(jié)律性的搏動(dòng)。不僅能夠用來(lái)排除具有心臟毒性的化合物，還能用于初步評(píng)價(jià)心血管類藥物的療效，極大地降低藥物開發(fā)成本，并提高藥物開發(fā)效率，是長(zhǎng)期藥物毒性實(shí)驗(yàn)和生理學(xué)研究的理想模型工具。

其中，圖5A至圖5C是實(shí)驗(yàn)三中實(shí)施例5的心肌功能分析結(jié)果。其中，圖5A顯示心肌細(xì)胞質(zhì)量均一穩(wěn)定且具備正常人心肌細(xì)胞的搏動(dòng)幅度與頻率。圖5B顯示心肌細(xì)胞在1.1μm異丙腎上腺素(Isoprenaline)的作用下心率顯著提高，其中，0.1％DMSO處理作為陰性參照。圖5C顯示心肌細(xì)胞在1.1μm胺碘酮(Amiodarone)的作用下心率顯著降低，其中，0.1％DMSO處理作為陰性參照。

圖6A和圖6B示出的是實(shí)驗(yàn)三中實(shí)施例5的膜片鉗檢測(cè)電生理的結(jié)果。圖6A和圖6B示出了實(shí)驗(yàn)三中實(shí)施例5的試劑盒誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞的膜片鉗電生理檢測(cè)結(jié)果，圖6A顯示誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞具備典型的自發(fā)動(dòng)作電位，圖6B顯示誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞具備經(jīng)典的自發(fā)離子通道。

從上述實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)二以及實(shí)驗(yàn)三的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的心肌分化試劑盒成分明確，品質(zhì)穩(wěn)定且分化純化效率高，細(xì)胞譜系廣，可以分化包括各種來(lái)源的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞H9、HCN4等細(xì)胞。而且，在需要的情況下可以培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)100天，且能保持節(jié)律性的搏動(dòng)。不僅能夠用來(lái)排除具有心臟毒性的化合物，而且能夠用于初步評(píng)價(jià)心血管類藥物的療效，極大地降低藥物開發(fā)成本，并提高藥物開發(fā)效率，是長(zhǎng)期藥物毒性實(shí)驗(yàn)和生理學(xué)研究的理想模型工具。

從以上的描述中，可以看出，本發(fā)明上述的實(shí)施例實(shí)現(xiàn)了如下技術(shù)效果：本申請(qǐng)的心肌分化試劑盒搭配合成包被基質(zhì)使用，可以達(dá)到人源心肌細(xì)胞穩(wěn)定的獲得和維持，并且適用于包括藥物開發(fā)和安全性評(píng)價(jià)在內(nèi)的各種需求，為心血管藥物開發(fā)和生理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。