本發(fā)明屬于水產(chǎn)遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種尼羅羅非魚(yú)偽雌魚(yú)的高效誘導(dǎo)及微衛(wèi)星分子標(biāo)記鑒定方法。

背景技術(shù)：

羅非魚(yú)的雌魚(yú)與雄魚(yú)生長(zhǎng)存在明顯的差異。為了避免過(guò)度繁殖，同時(shí)利用雄魚(yú)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，最為實(shí)際有效的解決措施是對(duì)羅非魚(yú)進(jìn)行性別控制生產(chǎn)雄性魚(yú)苗，養(yǎng)殖全雄魚(yú)。

在羅非魚(yú)當(dāng)中存在兩套不同的主要性別決定系統(tǒng)，尼羅羅非魚(yú)及莫桑比克羅非魚(yú)等性別主要由LG1和23號(hào)連鎖群上^[6,7]上的XX/XY系統(tǒng)決定，而其他一些如藍(lán)羅非魚(yú)性別主要由LG3上的ZW/ZZ系統(tǒng)決定^[2,3]。除了性染色體，常染色體上的小因子也能夠影響主要的性別決定系統(tǒng)。然而除此之外，羅非魚(yú)的性別還受到環(huán)境中的溫度和環(huán)境激素的影響。在卵孵化10日后開(kāi)始的高溫處理將導(dǎo)致群體中的雄性比率增高^[8]。有研究認(rèn)為溫度對(duì)于羅非魚(yú)性別發(fā)育的影響可能與表觀遺傳學(xué)上的變化相關(guān)，Cyp19a，F(xiàn)oxl2，amh，Sox9a，Sox9b等基因在性別分化和決定中起關(guān)鍵作用^[8,9]。雌性激素的使用會(huì)導(dǎo)致羅非魚(yú)的雌性化，XY個(gè)體性逆轉(zhuǎn)，生理性別表現(xiàn)為雌性，此過(guò)程可能與調(diào)控cyp19a1b，foxl2，amh，DMRT1等基因的表達(dá)相關(guān)^[11,12]。

為了得到全雄魚(yú)，在生產(chǎn)過(guò)程當(dāng)中，通常使用雄激素處理使雌魚(yú)發(fā)育成雄魚(yú)。羅非魚(yú)受精后0-18天是性別分化至關(guān)重要的時(shí)期。在此時(shí)期，胚胎對(duì)激素非常敏感^[15]。采用口服雄性激素如甲基睪丸酮處理羅非魚(yú)魚(yú)苗，誘導(dǎo)遺傳上的雌魚(yú)轉(zhuǎn)換為功能上的雄魚(yú)是雄性羅非魚(yú)生產(chǎn)的主要方式之一。但是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，甲基睪丸酮的后期消解較為緩慢，隨著甲基睪丸酮濃度增大，在羅非魚(yú)魚(yú)苗體內(nèi)殘留的時(shí)間延長(zhǎng)。若無(wú)法確保激素在魚(yú)體內(nèi)全部代謝完，則可能對(duì)人體造成危害，存在食品安全問(wèn)題^[17]。與此同時(shí)，激素的使用也造成一些環(huán)境問(wèn)題，影響水產(chǎn)品的安全性，造成陰陽(yáng)魚(yú)和不育雌魚(yú)的產(chǎn)生及形態(tài)異常，內(nèi)分泌紊亂，激素水平改變等負(fù)面影響。生產(chǎn)無(wú)公害羅非魚(yú)水產(chǎn)品，保障羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的首要條件就是解決羅非魚(yú)養(yǎng)殖的質(zhì)量控制問(wèn)題。使用環(huán)保安全的方法，生產(chǎn)綠色無(wú)公害的水產(chǎn)品有利于我國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖的良性發(fā)展。

培育超雄羅非魚(yú)是解決羅非魚(yú)全雄苗種生產(chǎn)問(wèn)題的重要途徑之一。實(shí)驗(yàn)證實(shí)尼羅羅非魚(yú)的偽雌魚(yú)(即遺傳雄性生理表型為雌性的個(gè)體)是可存活的，并且與正常的XX雌性一樣是可育的，可以用于全雄魚(yú)的生產(chǎn)。其中，高效誘導(dǎo)偽雌魚(yú)及其快速準(zhǔn)確鑒定技術(shù)是全雄羅非魚(yú)生產(chǎn)的技術(shù)基礎(chǔ)。然而，由于魚(yú)類的性染色體構(gòu)成處于原始狀態(tài)，所以在形態(tài)上難以區(qū)分Y和Z，X染色體。由于缺乏準(zhǔn)確判斷羅非魚(yú)遺傳性別的手段，使用傳統(tǒng)的選擇育種獲取全雄魚(yú)存在育種周期長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力的問(wèn)題。高效誘導(dǎo)偽雌魚(yú)及其鑒定技術(shù)是需要解決的核心問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種尼羅羅非魚(yú)偽雌魚(yú)的高效誘導(dǎo)方法，該方法能夠?qū)⑷后w中遺傳雄性個(gè)體進(jìn)行性逆轉(zhuǎn)，顯著增加群體中表型雌魚(yú)的比例；本發(fā)明還提供一種尼羅羅非魚(yú)偽雌魚(yú)微衛(wèi)星分子標(biāo)記鑒定方法，在將群體中遺傳雄性個(gè)體進(jìn)行性逆轉(zhuǎn)為表型雌魚(yú)后，利用新開(kāi)發(fā)的標(biāo)記及其引物對(duì)群體基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析能夠快速準(zhǔn)確鑒定表型雌魚(yú)群體中的偽雌魚(yú)。

一種尼羅羅非魚(yú)偽雌魚(yú)的高效誘導(dǎo)方法，其特征在于，在尼羅羅非魚(yú)孵化后開(kāi)始進(jìn)食時(shí)開(kāi)始投喂含乙烯雌酚(DES)的開(kāi)口飼料，連續(xù)投喂3周以上，然后再進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)。

優(yōu)選，所述的含乙烯雌酚的開(kāi)口飼料，其每1kg所述的含乙烯雌酚的開(kāi)口飼料中含0.5g-1g乙烯雌酚。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的含乙烯雌酚的開(kāi)口飼料，其每1kg所述的含乙烯雌酚的開(kāi)口飼料中含1g乙烯雌酚。

所述的含乙烯雌酚的開(kāi)口飼料的制備方法，將乙烯雌酚溶于足量無(wú)水乙醇后與小魚(yú)開(kāi)口飼料充分?jǐn)嚢杌旌希◆~(yú)開(kāi)口飼料充分吸收乙烯雌酚后，充分揮發(fā)無(wú)水乙醇，干燥，得到含乙烯雌酚的開(kāi)口飼料。

乙烯雌酚在誘導(dǎo)羅非魚(yú)遺傳雄魚(yú)性逆轉(zhuǎn)為偽雌魚(yú)中的應(yīng)用。

優(yōu)選，所述的羅非魚(yú)為尼羅羅非魚(yú)。

一種尼羅羅非魚(yú)偽雌魚(yú)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記引物，其特征在于，所述的微衛(wèi)星分子標(biāo)記引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示。

一種尼羅羅非魚(yú)偽雌魚(yú)微衛(wèi)星分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

提取待鑒定尼羅羅非魚(yú)的基因組DNA，以該基因組DNA作為模板，利用上述尼羅羅非魚(yú)偽雌魚(yú)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記引物的正向引物和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳然后分型，判斷是否為偽雌魚(yú)。

優(yōu)選，所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×PCR Mastermix 10μL，10μM正、反向引物各0.8μL，模板DNA 25ng，補(bǔ)充ddH₂O至總體積20μL；反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；變性94℃30sec、退火61.5℃30sec、延伸72℃15sec，循環(huán)數(shù)為34；72℃延伸10min。

本發(fā)明首先通過(guò)構(gòu)建尼羅羅非魚(yú)家系，并利用含雌激素乙烯雌酚(DES)的開(kāi)口飼料對(duì)家系部分個(gè)體(處理組)進(jìn)行性逆轉(zhuǎn)處理，促使其中的遺傳雄性個(gè)體發(fā)育成生理雌性的偽雌魚(yú)。對(duì)照組則投喂未添加雌激素的飼料。通過(guò)與對(duì)照組表型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，該方法成功的提高了處理組群體的表型雌性個(gè)體的比例(95％-100％；表1)。研究確定了羅非魚(yú)最佳DES性逆轉(zhuǎn)處理劑量(1g DES/kg飼料)及飼料配制方法。進(jìn)一步基于已有研究所定位出的不同染色體(LG1,LG23)性別決定QTL區(qū)域，設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物，通過(guò)群體QTL連鎖作圖，分析標(biāo)記與表型關(guān)系，最終篩選出尼羅羅非魚(yú)育種家系中與性別性狀連鎖的LG23上的QTL區(qū)間及微衛(wèi)星標(biāo)記；進(jìn)一步應(yīng)用新開(kāi)發(fā)的與性別緊密連鎖的微衛(wèi)星分子標(biāo)記tlp-23-sd的引物對(duì)激素處理后的群體進(jìn)行分析，篩選鑒定發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的偽雌魚(yú)39尾，為生產(chǎn)全雄魚(yú)奠定基礎(chǔ)。尼羅羅非魚(yú)微衛(wèi)星分子標(biāo)記tlp-23-sd的引物序列如SEQ ID NO.1(正向引物)和SEQ ID NO.2(反向引物)所示。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)如下：

一.尼羅羅非魚(yú)偽雌魚(yú)雌激素高效誘導(dǎo)

挑選優(yōu)質(zhì)尼羅羅非魚(yú)親魚(yú)構(gòu)建全同胞家系。將家系分組進(jìn)行養(yǎng)殖管理(表1)，并利用雌激素乙烯雌酚(DES,0.5g或1g DES/kg開(kāi)口飼料)對(duì)該家系2個(gè)處理組分別進(jìn)行性逆轉(zhuǎn)處理。其中處理組在孵化后開(kāi)始進(jìn)食時(shí)即投喂添加雌激素DES的開(kāi)口飼料，每日三次，連續(xù)投喂3周，促使其中的遺傳雄性個(gè)體發(fā)育成表型雌性的偽雌魚(yú)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組1組投喂未添加雌激素DES的開(kāi)口飼料。通過(guò)比較對(duì)照組(30％)和處理組(95％-100％)的雌性個(gè)體比例，證實(shí)雌激素(DES)能成功提高家系表型雌性個(gè)體的比例(表1)。研究確定投喂含1g DES/kg開(kāi)口飼料能高效誘導(dǎo)遺傳雄性羅非魚(yú)性逆轉(zhuǎn)為生理雌性的偽雌魚(yú)。

二.尼羅羅非魚(yú)個(gè)體動(dòng)物電子標(biāo)簽標(biāo)記及偽雌魚(yú)微衛(wèi)星分子標(biāo)記鑒定

待魚(yú)生長(zhǎng)至性腺發(fā)育成熟(約5個(gè)月)后，通過(guò)人工分辨其外生殖器進(jìn)行表型性別鑒定，并記錄性別和體重，剪取親本和子一代(對(duì)照組96尾雌性個(gè)體及96尾雄性個(gè)體以及DES處理1組中96尾雌性個(gè)體)的鰭條樣品保存于無(wú)水乙醇中，放入-70℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)，在每條魚(yú)背部注射動(dòng)物電子標(biāo)簽，記錄個(gè)體身份信息，用于進(jìn)一步追蹤個(gè)體的生長(zhǎng)及發(fā)育情況。

利用基因組DNA提取試劑盒提取所有取樣個(gè)體基因組DNA?；谝延醒芯克ㄎ怀龅牟煌旧w(LG1,LG23)性別決定QTL區(qū)域基因組序列，設(shè)計(jì)5對(duì)微衛(wèi)星引物，并從O.Eshel(2012)等的研究當(dāng)中^[7]，選取9對(duì)位于性別決定區(qū)域內(nèi)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)所有樣品DNA進(jìn)行分析。通過(guò)3％PAGE膠電泳及銀染顯色對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因分型。通過(guò)QTL作圖分析驗(yàn)證和篩選性連鎖標(biāo)記。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示在所分析的羅非魚(yú)群體中新開(kāi)發(fā)的LG23微衛(wèi)星標(biāo)記tlp-23-sd等與羅非魚(yú)性別具有最強(qiáng)的連鎖關(guān)系(圖1)。非DES處理的對(duì)照組中，tlp-23-sd標(biāo)記對(duì)于遺傳性別為雄性的羅非魚(yú)鑒定準(zhǔn)確率達(dá)到90.6％。進(jìn)一步使用驗(yàn)證的性連鎖微衛(wèi)星分子標(biāo)記tlp-23-sd篩選鑒定處理組中標(biāo)記和取樣的偽雌魚(yú)(PAGE電泳結(jié)果示意圖如圖2)。DES處理1組的96個(gè)雌性個(gè)體中有90個(gè)個(gè)體擴(kuò)增出清晰條帶，經(jīng)微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定出39個(gè)遺傳性別為雄性、生理性別為雌性的偽雌魚(yú)。研究顯示使用雌激素處理的確使雄性尼羅羅非魚(yú)發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，遺傳性別為雄性的尼羅羅非魚(yú)發(fā)育成偽雌魚(yú)。其中用于擴(kuò)增微衛(wèi)星分子標(biāo)記tlp-23-sd的引物，其正向引物序列tlp-23-sd-F：5’-TCCCATTTAGACCACCACACCTCAACAACA-3’(如SEQ ID NO.1所示)，反向引物序列tlp-23-sd-R：5’-GTCAGAATGCACTTTAACACAGAGATACCA-3’(如SEQ ID NO.2所示)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果：

1.本研究通過(guò)比較分析確定1g DES/kg開(kāi)口飼料是羅非魚(yú)高效的DES性逆轉(zhuǎn)處理劑量，這對(duì)于高效誘導(dǎo)羅非魚(yú)偽雌魚(yú)具有重要的意義。

2.由于羅非魚(yú)的性別分化受到許多因素影響，除了遺傳因素，在性別分化的過(guò)程中，環(huán)境中的多種因素如溫度、環(huán)境激素等也可能使其發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，從而可能導(dǎo)致羅非魚(yú)的遺傳性別與生理性別不一致，導(dǎo)致某些個(gè)體的基因型和表現(xiàn)型相悖。通過(guò)應(yīng)用尼羅羅非魚(yú)性別決定區(qū)緊密連鎖的微衛(wèi)星分子標(biāo)記tlp-23-sd及其引物開(kāi)展偽雌魚(yú)的篩選，能縮短育種的周期，提高選育的準(zhǔn)確性。

附圖說(shuō)明

圖1是所用微衛(wèi)星分子標(biāo)記tlp-23-sd在LG23號(hào)連鎖群上的相對(duì)位置及其LOD值。

圖2是微衛(wèi)星分子標(biāo)記tlp-23-sd的引物篩選鑒定XY偽雌魚(yú)示意圖；Marker：100bp DNA ladder；Pf：雌性親本；Pm：雄性親本；Of：家系當(dāng)中的雌性表型個(gè)體；Om：家系當(dāng)中的雄性表型個(gè)體；箭頭所示為偽雌魚(yú)個(gè)體及雄性特異條帶。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范疇。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1：雌激素乙烯雌酚(DES)開(kāi)口飼料的配制方法

首先將雌激素乙烯雌酚(DES)按實(shí)驗(yàn)要求量(0.5g或1g)溶解入500mL無(wú)水乙醇，然后將含有DES的無(wú)水乙醇與1kg小魚(yú)開(kāi)口飼料進(jìn)行充分?jǐn)嚢琛?度冰箱過(guò)夜，讓小魚(yú)開(kāi)口飼料充分吸收DES。將添加DES的小魚(yú)開(kāi)口飼料置入通風(fēng)櫥，讓無(wú)水乙醇充分揮發(fā)。干燥，由此制備得到0.5g/kg、1g/kg的含DES的開(kāi)口飼料，然后用塑料袋密封，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2：家系構(gòu)建與雌激素處理

2015年6月份在廣州市五龍崗水產(chǎn)發(fā)展有限公司挑選優(yōu)質(zhì)尼羅羅非魚(yú)親魚(yú)(遺傳雄性親本和遺傳雌性親本)1對(duì)成功構(gòu)建了1個(gè)全同胞家系(共1356尾)。實(shí)驗(yàn)魚(yú)在廣州市五龍崗水產(chǎn)發(fā)展有限公司進(jìn)行養(yǎng)殖及實(shí)驗(yàn)處理。

將該家系不分性別隨機(jī)分成3組(2個(gè)處理組及1個(gè)對(duì)照組)進(jìn)行養(yǎng)殖管理(表1)。其中2個(gè)處理組在孵化后開(kāi)始進(jìn)食時(shí)投喂含DES的開(kāi)口飼料，連續(xù)投喂3周，促使其中的遺傳雄性個(gè)體發(fā)育成偽雌魚(yú)。對(duì)照組則投喂未添加雌激素的小魚(yú)開(kāi)口飼料。

表1尼羅羅非魚(yú)全同胞家系DES處理表型性別統(tǒng)計(jì)

待尼羅羅非魚(yú)生長(zhǎng)至5個(gè)月性腺發(fā)育成熟后，通過(guò)人工分辨其外生殖器進(jìn)行表型性別鑒定并記錄性別(表1)和體重，剪取親本和子一代的鰭條樣品保存于無(wú)水乙醇中，放入-70℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)，基于體重及性別性狀，在處理1組中挑選出96條雌魚(yú)作為育種群體，為每條魚(yú)注射電子標(biāo)簽，記錄個(gè)體身份信息用于育種。數(shù)據(jù)分析顯示實(shí)驗(yàn)成功的提高了處理組中的表型雌性個(gè)體的比例(95％-100％；表1)。研究確定投喂1g/kg的含DES的開(kāi)口飼料能高效誘導(dǎo)遺傳雄性魚(yú)性逆轉(zhuǎn)為生理雌性的偽雌魚(yú)。

實(shí)施例3：基因組DNA來(lái)源與制備及標(biāo)記篩選

1.親代及子代基因組DNA樣品提取

本實(shí)驗(yàn)用于偽雌魚(yú)性別連鎖分子標(biāo)記的鑒定的樣品有：實(shí)施例2中的雌性和雄性親本、對(duì)照組96尾雌性(表型)個(gè)體及96尾雄性(表型)個(gè)體、處理1組96尾雌性(表型)個(gè)體。

2.DNA提取方法

(1)親本DNA

使用東盛基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，提取的DNA稀釋5倍后放入-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)子一代DNA

a.取一1.5mL的96孔板，置于冰上，每孔加入300μL的STE buffer(10mM Tris pH8.0，50mM EDTA pH 8.0，200mM NaCl，0.5％SDS)，50μL蛋白酶K(20mg/mL)；

b.用滅過(guò)菌的剪刀剪下3*3mm²大小的魚(yú)鰭樣品，放在濾紙上，按壓吸干樣品上殘留的無(wú)水乙醇，放入裂解液中；

c.簡(jiǎn)單離心后放入搖床中，將溫度設(shè)置為55℃，轉(zhuǎn)速70-100r/min，裂解3hr；

d.取硅膠柱(96孔)，下面用96孔板承接濾液，每孔加入240μL 6M NaI，再加入80μL的裂解液，2000g離心1min，倒去濾液；

e.每孔加入240μL的wash buffer(10mM Tris pH7.5，1mM EDTA pH7.5，100mM NaCl，50％乙醇)，2000g離心3min后，靜置干燥2-5min；

f.每孔加入120μL的純水，在室溫下靜置2min后，2000g離心2min得到DNA樣品；

g.1％瓊脂糖凝膠電泳，120v電泳30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。提取的DNA稀釋5倍后放入-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.標(biāo)記篩選

基于已有研究所定位出的不同染色體(LG1，LG23)性別決定QTL區(qū)域基因組序列，設(shè)計(jì)5對(duì)微衛(wèi)星引物，并從O.Eshel(2012)等的研究當(dāng)中^[7]，選取9對(duì)位于性別決定區(qū)域內(nèi)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)所有樣品DNA進(jìn)行分析。標(biāo)記引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

4.PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系為：2×PCR Mastermix 10μL，10μM正、反向引物各0.8μL，模板DNA 25ng，補(bǔ)充ddH₂O至總體積20μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；變性94℃30sec、退火61.5℃30sec、延伸72℃15sec，循環(huán)數(shù)為34；72℃延伸10min。取擴(kuò)增產(chǎn)物3μL進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，拍照。

5.聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測(cè)

1)制膠

取純水25mL，5×TBE 4mL，Acr-bis(30％)10.7mL，TEMED 26μL，APS(10％)280μL，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆?，將配置好的凝膠注入組裝好的兩玻璃板之間，輕輕插入梳子，靜置1-2小時(shí)，待其凝固。

2)電泳

待膠凝固后，將膠連同玻璃板一起取下，安置在電泳槽中；依次序進(jìn)行點(diǎn)樣，每孔3μL；蓋好上蓋，將電壓調(diào)到200V，電泳10分鐘后，將電壓調(diào)到600v，繼續(xù)電泳1.5小時(shí)。

3)銀染

電泳結(jié)束后，排出緩沖液，從電泳槽中取下玻璃板，用薄板輕輕撬開(kāi)兩塊玻璃板，將凝膠放入裝有純水的盤中，使凝膠與玻璃板脫離；倒掉純水，加入500mL的染色液(1％AgNO₃)，染色約5分鐘后將膠轉(zhuǎn)移到裝有純水的盤中，漂洗5-10秒，倒掉純水，加入顯色液(20g NaOH+0.5g Na₂CO₃+4mL甲醛溶液(37％)加入1L純水中，使用前置入冰中預(yù)冷)，顯色約10-15min，至條帶開(kāi)始呈現(xiàn)，倒掉顯色液，加入純水浸泡5min，觀察條帶并拍照。

6.遺傳圖的制作和基因定位

用表格記錄每個(gè)個(gè)體的基因型，使用軟件Joinmap 4和MapQTL 6對(duì)遺傳圖譜數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)分析，計(jì)算每個(gè)標(biāo)記的LOD值，獲得顯著性相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記，鑒定尼羅羅非魚(yú)性別性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記(如圖1所示)。使用Joinmap 4和MapQTL 6對(duì)對(duì)照組中96個(gè)雄性(表型)個(gè)體和96個(gè)雌性(表型)個(gè)體的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖作圖，結(jié)果顯示標(biāo)記tlp-23-sd的LOD最高，為19.79。LOD值的大小用于判定連鎖關(guān)系，本研究當(dāng)中的LOD值表示微衛(wèi)星標(biāo)記與尼羅羅非魚(yú)性別的連鎖關(guān)系。該微衛(wèi)星分子標(biāo)記tlp-23-sd的序列如下所示：TCCCATTTAGACCACCACACCTCAACAACATGGTAGCAAAAAAACGTGTGATTACGACCCCC(CA)nCGCACACACCCACTGTGTTACATCATTTCAGCCACTTTATACTTGTTCCCATGGTACGGATGGAAATAACCTTGCTGAAGCAGAAGCTGGTATCTCTGTGTTAAAGTGCATTCTGAC，其含有(CA)n微衛(wèi)星序列重復(fù)。在雌雄個(gè)體間存在CA堿基重復(fù)次數(shù)的差異從而區(qū)別不同性別的個(gè)體。通過(guò)該標(biāo)記對(duì)實(shí)驗(yàn)群體雄性親本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PAGE電泳銀染后有兩條雄性特異帶，其分別代表雄性親本該基因標(biāo)記的2個(gè)等位基因(分子量大小分別為197及213bp；如圖2所示)。對(duì)照組中，該微衛(wèi)星分子標(biāo)記tlp-23-sd對(duì)于遺傳性別為雄性的尼羅羅非魚(yú)鑒定的準(zhǔn)確率達(dá)到90.6％，即對(duì)照組雄性(表型)個(gè)體中有90.6％的個(gè)體能擴(kuò)增出相應(yīng)的雄性特異帶，而對(duì)照組雌性(表型)個(gè)體的基因組DNA經(jīng)擴(kuò)增后無(wú)雄性特異帶。準(zhǔn)確率無(wú)法到達(dá)100％的原因可能是由于羅非魚(yú)的性別受到許多因素影響。除了遺傳因素，在性別分化的過(guò)程中，環(huán)境中的多種因素如溫度、環(huán)境激素等也可能使其發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致某些個(gè)體的基因型和表現(xiàn)型相悖。通過(guò)微衛(wèi)星分子標(biāo)記tlp-23-sd可以快速準(zhǔn)確的鑒定和區(qū)分不同遺傳成分的個(gè)體，其中用于擴(kuò)增微衛(wèi)星分子標(biāo)記tlp-23-sd的引物，其正向引物序列tlp-23-sd-F：5’-TCCCATTTAGACCACCACACCTCAACAACA-3’(如SEQ ID NO.1所示)，反向引物序列tlp-23-sd-R：5’-GTCAGAATGCACTTTAACACAGAGATACCA-3’(如SEQ ID NO.2所示)。

實(shí)施例4：偽雌魚(yú)分子標(biāo)記篩選

進(jìn)一步使用驗(yàn)證的性連鎖微衛(wèi)星分子標(biāo)記tlp-23-sd的引物(如SEQ ID NO.1和2所示)對(duì)實(shí)施例2中處理1組的96個(gè)雌性(表型)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增、PAGE膠電泳、銀染顯色及基因型分析。結(jié)果表明，處理1組的96個(gè)雌性(表型)個(gè)體中有90個(gè)個(gè)體擴(kuò)增出清晰條帶，利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記tlp-23-sd的引物鑒定出39個(gè)遺傳性別為雄性、但生理性別為雌性的偽雌魚(yú)(圖2)，其都擴(kuò)增出雄性特異帶。