本發(fā)明屬于基因工程和現(xiàn)代酶工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種灰略紅鏈霉菌β-1,4-葡萄糖苷酶及其編碼基因和應(yīng)用，具體涉及一種β-1,4-葡萄糖苷酶及其編碼基因序列、含有該編碼基因序列的重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因重組菌以及該β-1,4-葡萄糖苷酶的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

纖維素酶由外切β-1,4-葡聚糖酶、內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶和β-1,4-葡萄糖苷酶組成，其中β-1,4-葡萄糖苷酶是糖代謝關(guān)鍵酶，能夠水解糖苷鍵，將結(jié)晶纖維素、無定型纖維素及可溶性纖維二糖等轉(zhuǎn)化為葡萄糖，在古菌、細(xì)菌和真核生物中廣泛存在。在外切β-1,4-葡聚糖酶、內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶和β-1,4-葡萄糖苷酶的協(xié)同作用下，纖維素被徹底為葡萄糖。然而，相關(guān)研究表明β-1,4-葡萄糖苷酶含量少、活性低，是纖維素降解過程的限速酶。因此，研究低活性的β-1,4-葡萄糖苷酶，對(duì)了解糖苷酶在生物體內(nèi)代謝具有意義重大。目前，通過蛋白質(zhì)工程手段改造并開發(fā)出具有高活性、耐高溫、耐酸堿的β-1,4-葡萄糖苷酶，進(jìn)而應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

與此同時(shí)，日益增加的能源需求刺激了纖維素等生物質(zhì)材料轉(zhuǎn)化為單糖的研究，發(fā)掘具有良好熱穩(wěn)定性的β-1,4-葡萄糖苷酶成為關(guān)鍵所在。在農(nóng)業(yè)上，具有耐熱性β-1,4-葡萄糖苷酶能夠用于廢棄物生物堆肥處理，加速降解過程，實(shí)現(xiàn)廢棄物資源化利用的同時(shí)解決了環(huán)境問題，是一種環(huán)境友好型的處理方式；在工業(yè)上，如造紙行業(yè)，在化學(xué)試劑處理木質(zhì)纖維素的過程中，由于過酸、過堿的環(huán)境條件，造成只有少量的纖維素能夠被降解，這樣不僅浪費(fèi)資源，使用的化學(xué)試劑也會(huì)造成環(huán)境污染，如從嗜熱菌種熱袍菌分離出來的β-1,4-葡萄糖苷酶最適溫度為105℃，它能高效去除木質(zhì)纖維素，致使漂白劑使用減少，節(jié)約資源，環(huán)保環(huán)境；此外，β-1,4-葡萄糖苷酶在石油工業(yè)、能源工業(yè)、釀酒及果汁行業(yè)中也具有重要的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種β-1,4-葡萄糖苷酶。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種β-1,4-葡萄糖苷酶的編碼基因。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有上述的β-1,4-葡萄糖苷酶編碼基因的重組表達(dá)載體及轉(zhuǎn)基因重組菌。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述的β-1,4-葡萄糖苷酶編碼基因在表達(dá)β-1,4-葡萄糖苷酶中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述的β-1,4-葡萄糖苷酶在水解多糖物質(zhì)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種灰略紅鏈霉菌β-1,4-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO.2。

本發(fā)明提供的耐高溫β-1,4-葡萄糖苷酶及其編碼基因克隆自灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens)，命名為JSD-1，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期：2012.01.09，保藏編號(hào)為CGMCC No.5706，具有下列核苷酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

(2)編碼序列表中的SEQ ID NO.2氨基酸序列的多核苷酸。

本發(fā)明所述的β-1,4-葡萄糖苷酶基因序列是通過全基因組測序和PCR擴(kuò)增的方式克隆獲得。本發(fā)明涉及的實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括鏈霉菌基因組及大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠回收、連接、質(zhì)粒酶切、轉(zhuǎn)化、蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化、聚丙烯酰胺凝膠電泳及重組β-1,4-葡萄糖苷酶活性的測定等，具體步驟為：以灰略紅鏈霉菌基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得該β-1,4-葡萄糖苷酶編碼基因序列，隨后將該基因序列連接到表達(dá)載體pET28a-SUMO上，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到特定的大腸桿菌表達(dá)菌株BL21內(nèi)，進(jìn)而獲得β-1,4-葡萄糖苷酶表達(dá)菌株，最終通過IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)β-1,4-葡萄糖苷酶的體外高效表達(dá)，然后收集菌體、細(xì)胞破碎，離心后獲得粗酶液，之后進(jìn)行蛋白純化并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測表達(dá)情況，最后，測定該β-1,4-葡萄糖苷酶相關(guān)的酶學(xué)特征。

從灰略紅鏈霉菌得到的β-1,4-葡萄糖苷酶具有以下特征：

1.該β-1,4-葡萄糖苷酶的編碼基因共有1359個(gè)核苷酸，序列如SEQ ID NO.1，共編碼452個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。

2.該β-1,4-葡萄糖苷酶的適合反應(yīng)溫度為60～75℃，優(yōu)選為65℃。

3.該耐高溫中性蛋白酶的適合反應(yīng)的pH為4.5～5.5。

4.該β-1,4-葡萄糖苷酶能夠耐受高濃度的鹽溶液；在金屬離子中，Ba²⁺對(duì)酶活有促進(jìn)作用，Mg²⁺和Se¹⁺對(duì)酶活的影響不顯著，Ca²⁺對(duì)酶活的影響較小，Co²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶呈明顯抑制作用，其中，以Zn²⁺的抑制作用最為明顯；在酶活性抑制劑中，EDTA、雙氧水和咪唑?qū)γ富钣幸种谱饔?，DTT對(duì)酶活的影響不顯著，SDS對(duì)酶活有促進(jìn)作用。

所述的β-1,4-葡萄糖苷酶編碼基因的重組表達(dá)載體及轉(zhuǎn)基因重組菌株。所述的重組表達(dá)載體為將上述的β-1,4-葡萄糖苷酶編碼基因插入到大腸桿菌表達(dá)載體中得到的表達(dá)β-1,4-葡萄糖苷酶的重組表達(dá)載體，所述的大腸桿菌重組表達(dá)載體為pET28a-SUMO載體。

所述的轉(zhuǎn)基因重組菌為將上述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入到大腸桿菌中，篩選得到表達(dá)β-1,4-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)基因重組菌，所述的大腸桿菌為BL21。

上述的β-1,4-葡萄糖苷酶編碼基因在表達(dá)β-1,4-葡萄糖苷酶中的應(yīng)用。

上述的β-1,4-葡萄糖苷酶及其編碼基因在水解多糖物質(zhì)中的應(yīng)用。

一種表達(dá)β-1,4-葡萄糖苷酶的方法，是培養(yǎng)上述的轉(zhuǎn)基因重組菌得到β-1,4-葡萄糖苷酶。

本發(fā)明的β-1,4-葡萄糖苷酶在天然灰略紅鏈霉菌內(nèi)的表達(dá)量和酶活性均較低，因此嚴(yán)重限制了其使用范圍和效果。本發(fā)明利用基因工程手段，構(gòu)建了β-1,4-葡萄糖苷酶表達(dá)工程菌株，大幅度提高了β-1,4-葡萄糖苷酶的表達(dá)量，為該β-1,4-葡萄糖苷酶的高效表達(dá)與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，可用于纖維材料的降解。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

第一.本發(fā)明通過構(gòu)建外源表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了上述β-1,4-葡萄糖苷酶的體外高效表達(dá)，并通過添加可溶性標(biāo)簽，保證生物學(xué)活性的同時(shí)方便后續(xù)蛋白的純化；

第二.本發(fā)明的β-1,4-葡萄糖苷酶是一種酸性(最適反應(yīng)pH約為5.0)、耐高溫(最適反應(yīng)溫度約為65℃)的糖苷水解酶，該酶受溶液離子濃度影響較小，且對(duì)多種金屬離子(如Ba²⁺、Mg²⁺、Se¹⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺)及酶活性抑制劑(如EDTA、雙氧水、咪唑、DTT、SDS)存在很強(qiáng)的耐受能力；

第三.本發(fā)明通過應(yīng)用基因工程技術(shù)手段，實(shí)現(xiàn)β-1,4-葡萄糖苷酶在體外的高效表達(dá)，克服現(xiàn)有技術(shù)中β-1,4-葡萄糖苷酶在生物體內(nèi)多為胞內(nèi)表達(dá)，致使酶表達(dá)量和活性較低而導(dǎo)致的應(yīng)用范圍和效果嚴(yán)重受限的問題。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的β-1,4-葡萄糖苷酶重組表達(dá)載體構(gòu)建示意圖(A為灰略紅鏈霉菌基因組的驗(yàn)證圖；B為pET28a-sumo線性化PCR擴(kuò)增驗(yàn)證圖；C為β-1,4-糖苷酶PCR擴(kuò)增驗(yàn)證圖；D為單克隆菌落特異性PCR驗(yàn)證圖；E為重組質(zhì)粒提取的驗(yàn)證圖)；

圖2為本發(fā)明的重組β-1,4-葡萄糖苷酶外源表達(dá)驗(yàn)證圖(A為誘導(dǎo)表達(dá)后1.0h、2.0h、3.0h、4.0h的示意圖；B為β-1,4-葡萄糖苷酶純化示意圖：1.去標(biāo)簽蛋白；2.透析存儲(chǔ)蛋白)；

圖3為pH對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶活力影響的示意圖(A為相對(duì)活性的折線圖；B為反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的樣品圖)

圖4為溫度對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶活力影響的示意圖(A為相對(duì)活性的折線圖；B為反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的樣品圖)；

圖5為鹽離子強(qiáng)度對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶活力影響的示意圖(A為相對(duì)活性的折線圖；B為反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的樣品圖)；

圖6為金屬離子對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶活力影響的示意圖(A為相對(duì)活性的折線圖；B為反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的樣品圖)；

圖7為酶活抑制劑對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶活力影響的示意圖(A為相對(duì)活性的折線圖；B為反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的樣品圖)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。在實(shí)際應(yīng)用中本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明做出的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

1、灰略紅鏈霉菌基因組提取和測序

將灰略紅鏈霉菌孢子懸浮液接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、150rpm條件下培養(yǎng)3天，然后收集2.0mL菌液，12000rpm離心2min，并棄上清，收集菌體沉淀，之后加入180μL溶菌酶(20mg/mL)和20μL EDTA溶液(0.5M,pH 8.0)，37℃處理45min，加入4μL RNase A(100mg/mL)，震蕩混勻15s，室溫放置5min，隨后按照細(xì)菌DNA提取試劑盒操作說明完成剩余操作，得到高純度基因組DNA，最后通過瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA質(zhì)量，確保無明顯RNA條帶，基因組條帶清洗、完整、無降解、無污染(如圖1-A所示)。

采用第二代測序技術(shù)，構(gòu)建不同插入片段長度的文庫，采用Illumina Miseq(2×250bp)平臺(tái)進(jìn)行測序，收集測序的原始數(shù)據(jù)，對(duì)帶接頭、低質(zhì)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，隨后采用Newbler version 2.8對(duì)去除接頭的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭拼接，構(gòu)建Contigs及Scaffolds，最后使用GapCloser程序進(jìn)行缺口填補(bǔ)得到鏈霉菌基因組草圖。

2、β-1,4-葡萄糖苷酶編碼基因表達(dá)載體的構(gòu)建

提取灰略紅鏈霉菌基因組DNA，擴(kuò)增β-1,4-葡萄糖苷酶基因。引物設(shè)計(jì)如下：

正向引物：

5'-CACTGGTAGCTGATGCGGCGGGAGG-3'

反向引物：

5'-TACCCCTCGCCCATGCCCTCCGCCGC-3'

將質(zhì)粒pET28a-Sumo線性化PCR(如圖1-B所示)，同時(shí)兩輪PCR擴(kuò)增出β-1,4-葡萄糖苷酶基因片段(如圖1-C所示)，運(yùn)用外切酶，重組載體，轉(zhuǎn)入DH5α克隆細(xì)胞，涂布于含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基固體平板上，在37℃烘箱中倒置過夜培養(yǎng)，挑單菌落PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增出來的陽性克隆(如圖1-D所示)經(jīng)LB液體小量培養(yǎng)提取出質(zhì)粒(如圖1-E所示)，測序無誤，表明重組載體克隆構(gòu)建成功，β-1,4-葡萄糖苷酶基因成功插入pET28a-SUMO質(zhì)粒上。

3、重組β-1,4-葡萄糖苷酶外源表達(dá)驗(yàn)證

重組成功的載體轉(zhuǎn)化入到表達(dá)菌株BL21后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，小量表達(dá)出目的蛋白(如圖2-A所示)，然后進(jìn)一步擴(kuò)大菌體培養(yǎng)量，收集菌體并提取蛋白，經(jīng)Ni²⁺柱親和純化，得到目的蛋白，目的蛋白N端含可溶性標(biāo)簽Sumo，經(jīng)GST-3C酶切割3C位點(diǎn)，反掛柱去除帶His-tag標(biāo)簽的Sumo蛋白，最后去標(biāo)簽的蛋白和透析后保存的蛋白經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證合格(如圖2-B所示)。

4、pH對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶活力的影響

定義在37℃，PBS緩沖液條件下測定，每分鐘pNPG轉(zhuǎn)化1μM所需的酶量為一個(gè)酶學(xué)活力單位，結(jié)果顯示1分鐘內(nèi)400μL濃度為1mM的pNPG體系中反應(yīng)產(chǎn)生0.186μM的硝基苯，反應(yīng)體系中蛋白含量為0.01mg，經(jīng)計(jì)算得出37℃條件下酶學(xué)活力單位的比活性為0.54U/mg。

使用不同pH值的緩沖劑作為反應(yīng)液，探究pH對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，在強(qiáng)酸性條件下(pH小于4)，β-1,4-葡萄糖苷酶的相對(duì)活性(以pH 5.5時(shí)的活性為參照)較低，低于50％；在強(qiáng)堿性條件下(pH 大于11)，β-1,4-葡萄糖苷酶同樣呈低活性狀態(tài)；在pH為4.5～5.5之間，β-1,4-葡萄糖苷酶相對(duì)活性大于95％。因此，β-1,4-葡萄糖苷酶的最適PH范圍在4.5到5.5之間，是一種典型的酸性水解酶。

5、溫度對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶活力的影響

在不同的溫度下，考察溫度對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶活力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，反應(yīng)溫度為60～75℃時(shí)，β-1,4-葡萄糖苷酶的相對(duì)活性在80％以上(以65℃時(shí)的酶活力為參照)，其中β-1,4-葡萄糖苷酶的最適溫度約為65℃；在95℃時(shí)，β-1,4-糖苷酶的相對(duì)活性超過50％，在100℃時(shí)，β-1,4-糖苷酶的相對(duì)活性約為50％(圖中未顯示)，同時(shí)設(shè)置不加β-1,4-糖苷酶的對(duì)照組，同樣100℃處理相同的時(shí)間，測得該酶的相對(duì)活性為0，表明高溫下糖苷鍵不會(huì)自然斷裂。因此，該β-1,4-糖苷酶為耐高溫型水解酶。

6、鹽離子濃度對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶活性的影響

在相同的PBS緩沖液中加入不同濃度的NaCl，考察不同離子濃度對(duì)酶活性影響，β-1,4-葡萄糖苷酶的活性變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，當(dāng)反應(yīng)液中含NaCl時(shí)，酶活相對(duì)活性(以不含NaCl的反應(yīng)液為參照)大于100％；當(dāng)NaCl濃度在10～340mM之間時(shí)，酶活性呈明顯上升趨勢(shì)；當(dāng)NaCl濃度達(dá)到640mM時(shí)，對(duì)酶活的促進(jìn)效果開始下降，但仍高達(dá)131％(圖中未顯示)。因此，β-1,4-葡萄糖苷酶能夠耐受高濃度的鹽溶液。

7、金屬離子對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶活性的影響

在相同的反應(yīng)體系中分別加入濃度為1mM的不同金屬離子，在相同的反應(yīng)條件下，測定各處理的β-1,4-葡萄糖苷酶相對(duì)活性(以不加金屬離子的反應(yīng)體系為參照)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，Ba²⁺對(duì)酶活有促進(jìn)作用；Mg²⁺和Se¹⁺對(duì)酶活的影響不顯著；Ca²⁺對(duì)酶活的影響較??；Co²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶呈明顯抑制作用，其中以Zn²⁺的抑制作用最為明顯。因此，對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶多種金屬離子(如Ba²⁺、Mg²⁺、Se¹⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺)存在很強(qiáng)的耐受能力。

8、酶活抑制劑對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶活性的影響

通過在相同的反應(yīng)體系中添加濃度為1mM的不同種類的酶活性抑制劑，考察不同抑制劑對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶活性影響(以不加抑制劑的反應(yīng)體系為參照)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，EDTA、雙氧水和咪唑?qū)γ富钣幸种谱饔?，但相?duì)活性仍維持在80％左右；DTT對(duì)酶活的影響不顯著；SDS對(duì)酶活有促進(jìn)作用。因此。β-1,4-葡萄糖苷酶對(duì)酶活性抑制劑(如EDTA、雙氧水、咪唑、DTT、SDS)存在很強(qiáng)的耐受能力。

以上公開的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例只是用于幫助闡述本發(fā)明。優(yōu)選實(shí)施例并沒有詳盡敘述所有的細(xì)節(jié)，也不限制該發(fā)明僅為所述的具體實(shí)施方式。顯然，根據(jù)本說明書的內(nèi)容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實(shí)施例，是為了更好地解釋本發(fā)明的原理和實(shí)際應(yīng)用，從而使所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員能很好地理解和利用本發(fā)明。本發(fā)明僅受權(quán)利要求書及其全部范圍和等效物的限制。